转基因植物的鉴定

转基因植物的鉴定（11篇）

1.转基因植物的鉴定 篇一

转基因植物中外源非目的基因片段的生物安全研究进展

生物安全(biosafety)是指与以人类的环境为对象的生物学研究所产生的.效应相关的安全性[1],或对生物危害的检测,评价,监测,防范和治理的科学技术体系.

作 者：董志峰 管华诗 马荣才 彭于发 作者单位：董志峰(青岛海洋大学;中国生物工程开发中心)

管华诗(青岛海洋大学,)

马荣才(北京农业生物技术研究中心,)

彭于发(中国农业科学院植物保护研究所,)

刊 名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA年，卷(期)：200143(7)分类号：Q943.2关键词：生物安全 35S启动子 标记基因 载体骨架序列 CRE/lox

2.转基因植物的鉴定 篇二

一、转基因植物口服疫苗的获取

(一) 目标抗原的选择

要想生产转基因口服疫苗, 首先要选择合适的植物目标抗原, 当一些植物疫苗的结构比较清晰时, 可以直接运用这些植物来提取疫苗, 当植物的疫苗结构不是很清晰的时候, 就要通过微生物进行筛选, 选出适合的目标抗原。

(二) 受体植物的选择

受体植物是生产转基因口服疫苗的关键, 因此选择合适的受体植物是很有必要的, 合适的受体植物可以提高转基因口服疫苗的质量和产量。植物的叶片、幼苗、谷物的种子等等都可以作为转基因口服疫苗的受体植物。但是在新鲜的叶子中产生的蛋白需要快速的提取出来, 因为会被新鲜组织很快的吸收降解, 而在干燥的谷物中的产生的蛋白质可以长时间的保存, 因此在实际的操作中更倾向于使用干燥的种子作为受体植物。

(三) 转基因植物材料的获取

目前获取转基因植物材料应用的技术主要有核转化技术、叶绿体转化技术和病毒侵染技术。其中核转化技术是最长使用的一种技术手段, 该项技术是将编码抗体的外源基因注入带植物中, 利用植物的繁殖将遗传基因传给下一代。叶绿体转化技术也是借助植物的遗传。病毒侵染技术使利用植物病毒作为载体, 在植物中形成抗体。这三种方式均取得较好的效果。

二、转基因植物疫苗的加工处理及接种免疫

植物疫苗的接种方式有三种, 一种经过纯化技术处理后注射获取或者是直接口服获取。二是将植物疫苗加工成可以直接食用的状态, 让接种者直接使用。三是将植物疫苗添加到食品中, 接种者可以通过使用其他的食物从而接种疫苗。这种方式一般应用于家禽类动物疫苗的处理。

经过纯化处理可以将植物疫苗很好的浓缩和提纯, 但是一些植物的结构总有大量的酚类物质, 造成蛋白质很难很完全提纯, 并且需要的成本也比较高, 因此该方式的不能得到很广泛的使用。将植物疫苗加工成可食用的状态是疫苗的接种便的简单, 经过加工处理的植物疫苗可以直接口服, 使用效果较好。用于家禽类动物接种的疫苗的加工处理过程比较简单, 只需要将含有疫苗的植物稍作处理就可以, 在选择植物载体时要选用便于储存的食物, 例如玉米、谷物等等, 这样可以方便动物食用。

三、植物疫苗的应用前景及存在的问题

近年来, 动物传染疾病频发, 比如禽流感、疯牛病, 这些都是没有及时的接种疫苗造成的, 这些传染性疾病给养殖业者带来巨大的经济损失, 因此及时的接种疫苗是很有必要的。对于动物来说, 口服的植物疫苗是最理想的选择, 可以在动物的饲料中加入含有疫苗的植物, 让动物很轻松的使用下去, 从而接种疫苗。

但是目前仍然有诸多的因素影响着植物疫苗的应用和发展, 首先, 植物受体的选择, 虽然许多的植物可以当成疫苗的受体, 但是大部分的植物不能表达植物口服疫苗, 有些谷类植物的转化率较低, 这样极大限制了植物疫苗的发展。其次, 因为植物疫苗的转化率较低, 这就无形中增加了疫苗的生产成本, 疫苗是面向大众的一种药品, 价格太昂贵肯定不会被认可和接受, 这也制约着植物疫苗的发展。再次, 转基因技术一直是被受争议的一项技术, 在很多的国家不太接受转基因技术, 尤其是欧洲一些国家, 对于转基因是抵触的, 这就给转基因植物疫苗的发展设置了很大的障碍。因此, 要想推进转基因植物疫苗的发展, 必须在技术方面进行创新, 加大转基因植物的开发研究, 也要注重全社会普及转基因植物的知识, 消除人们对于转基因植物的错误认识, 让转基因疫苗更好的为我们服务。

参考文献

[1]王军政, 彭爱红, 姚利晓, 范达, 陈善春.转基因植物疫苗的研究进展[J].湖北农业科学, 2011 (17) .

[2]曲静, 王丕武, 范玉广.植物生物反应器生产转基因植物可食疫苗的研究进展[J].中国生物制品学杂志, 2010 (01) .

[3]朱宏, 赵凯, 段可, 潘爱虎, 贾军伟, 孙建萍, 李鹏, 何婷, 唐雪明.转基因植物疫苗研究进展[J].上海农业学报, 2009 (01) .

3.植物转基因技术的研究和应用 篇三

关键词: 转基因技术 植物 医疗 环境保护

中图分类号: Q91 文献标识码: A文章编号: 1007-3973 (2010) 04-070-02

将外源或者人工修饰的基因导入植物基因组并稳定表达,可改变生物体性状并遗传下去,这就是植物转基因技术。1983年,人类首次获得转基因植物,1986 年美国和法国的科学家第一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间试验。此后,植物转基因的研究与应用在世界各地蓬勃发展,并创造了巨大的经济效益。随着研究的深入,转基因植物的应用被不断拓宽,在农业上取得巨大经济效益的同时,其在医疗、资源、环境污染处理等方面的研究也吸引了越来越多的研究者。

1 植物转基因

1.1 植物转基因的原理

具有外源物种基因的植物叫做转基因植物,一般通过基因工程获得。基因工程是指按照人们的意愿用人工方法在体外对各种不同生物的DNA进行重组,构成遗传物质的新组合,并使其在受体细胞内持续稳定繁殖,从而获得大量新物种的技术。获得转基因植物需要具备3个要素:植物受体、目的基因和转化方法。受体的选择要考虑很多因素,如是否会对人类健康和生态环境有不利影响,是否有演变为杂草的可能,是否有敏感源和是否有毒等等。转基因的目的也应考虑进去,例如,选择合适的受体植物是生产转基因植物口服疫苗的关键,合适的受体植物可以使疫苗兼具表达量高、耐储藏和适宜于口服等优点。又如,为了利用转基因植物处理土壤污染,则尽量选择大型植物,以提高处理污染的效率。目的基因的选择也是根据具体研究的需要,截取需要表达的特性对应的基因。

另外,完成基因转化还需进行选择和一系列的鉴定工作,有时外源转化基因和植物中同源的内源基因的表达均被抑制即所谓的共抑制现象,有时外源基因在受体原生质中的表达瞬时不稳定,只有经过筛选和鉴定后,才能最终获得转化植物。

1.2 植物转基因的方法

植物转基因方法可分为生物学、化学和物理学方法三大类。生物学方法有农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导法等;物理学方法包括基因枪法、显微注射法和电激穿孔法等;化学方法包括聚乙二醇法、脂质体法等。在上述多种方法中,占主导地位的是农杆菌介导法,常用的还有基因枪法。

农杆菌介导的转基因技术:将目的基因插入到农杆菌中的Ti质粒上,使菌体成为共整合系统或双元整合系统,当农杆菌侵染植物时,菌体中的一段携带目的基因的T-DNA插入到植物基因组内,这段基因在植物细胞内编码了植物生长素和细胞分裂素的合成,同时利用植物细胞环境编码提供自己碳源和氮源的化合物,因此农杆菌和宿主植物形成了互利共生的关系。

基因枪转基因技术:由康奈尔大学Sanford提出,是将目的基因包裹在直径在微米级的球状金粉或钨粉颗粒上,用火药爆炸或高压气体加速金属微粒将其送到受体植物细胞中,再通过组织培养获得完整植株。

2 转基因植物的应用

2.1 转基因植物在农业上的应用

转基因技术改善作物中品质:作物的优质一直是人们追求的目标,目前利用转基因技术可以改善作物中营养元素的含量、控制植物的成熟期等。目前用于优化作物产品质量的基因主要有控制果实成熟的基因,谷物种子贮藏蛋白基因,控制脂肪合成基因等。如今改变作物中氨基酸蛋白质等物质的含量已经很常见,最近由日本、韩国和丹麦研究人员组成的研究小组成功培育出铁含量3倍于普通稻米的水稻,并证实这种高铁水稻能改善实验鼠的贫血症状。

转基因增强作物抗虫害:植物病害和虫害往往使农业生产蒙受严重损失,而农药的大量使用不仅污染环境,其残留还影响人类健康,利用植物转基因技术培育抗虫作物受到了大量研究者的重视。例如一种转基因玉米,可以通过释放一种吸引线虫的化学信号从而抵抗破坏性的根虫虫害,因为线虫是甲虫幼虫的天敌。Ted Turlings及其同事把一种来自牛至的(E)-β-石竹烯(EβC,一种能吸引线虫的化学物质)合成基因插入到了玉米中,使玉米有了自我保护能力。

转基因增强植物抗逆性:植物在自然界生长过程中易受外界环境影响,如旱涝、盐碱、强光、寒冷、高温、低温等作用于植物,会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应,表现为代谢和生长的可逆性抑制,严重时甚至引发不可逆伤害导致整个植株死亡。据Wired Science报道,加州大学河滨分校的科学家通过改变一种基因,让作物能够与有毒的铝相容。通过此技术,可能栽培出能在因含铝而被定性为有毒的土壤中生长的农作物。

2.2 转基因植物在医疗方面的应用

二十多年来,植物转基因技术的发展使外源基因在植物中表达变成现实,因此,利用转基因植物作为生物反应器生产动物疫苗等蛋白质已经变成可能,从而使植物基因工程迈上了新的台阶。Julian Ma及其同事将两种已知蛋白杀菌剂b12单克隆抗体和cyanovirin-N与一个单分子结合,使这种分子的抗HIV能力增强,而这种具有生物活性的融合分子由转基因植物产生。这项研究不仅产生了一种对抗HIV传播的新药,也满足了规模化生产的需求。目前,乙型肝炎表面抗原、大肠杆菌不稳定肠毒素(LT2B)抗原、诺沃克病毒衣壳蛋白、口蹄疫病毒VP1抗原、霍乱抗原等都已经在转基因植物中成功表达,并且成功地诱导动物产生保护性免疫反应。狂犬病毒糖蛋白在转基因西红柿中也已经成功地表达。

转基因植物产生的抗体、疫苗等,具有生产成本低,可规模化生产,方便保存运输等优点,2006 年2月,美国农业部(USDA)签发批准了转基因鸡新城疫植物疫苗商品化,这是第一个被许可上市的兽用转基因植物疫苗。但是大部分转基因植物用于医疗领域的研究尚且处于初级阶段,考虑到药物的安全性问题,还没有人用植物疫苗的二期临床研究报道。

2.3 转基因植物在其它方面的应用

植物转基因技术除了主要用于农业和医疗方面外,在保护环境和能源方面也有很好的发展前景(表1)。比如转基因植物用于处理土壤重金属污染,利用重金属富集植物从土壤中吸收重金属,通过植物的迁移转运作用,在可收割部位富集,待植物收获后再进行处理。现在,转基因植物在处理Hg,Se等污染中,已经发挥重要作用;转基因植物在生产生物燃料方面也有应用,美国能源部Brookhaven国家实验室的科学家从拟南芥和白杨(Populus trichocarpa)中发现一个基因家族可以控制细胞壁-酰基的结合,阻止生物纤维被消化为糖,使工程作物更容易生产生物燃料;通过转基因技术改造的杨树也可以产生作为造纸重要原料的长纤维,使杨树成为环保优质的造纸原料;此外转基因技术在花卉改良中也发挥着重要作用,培育色彩新奇、形态优美、抗性优良和花期延长的花卉新品种是转基因技术应用于花卉的主要目标。

表 1 转基因植物用于环境保护

3 转基因植物研究中的问题

植物转基因技术正在农业、医疗等领域发挥越来越重要的作用,同时转基因植物的潜在问题也逐渐暴露出来。在培育抗虫害作物时,首先碰到的问题就是转基因植物的非靶标效应,转基因生物释放后对于目标害虫或病原菌以外的生物的各种直接或者间接的不利影响,威胁到其它有益生物的生存,同时转基因植物的生存优势可能导致其肆意蔓延生长,以至威胁到生态系统的平衡;转基因植物口服疫苗存在易被人胃肠道分解的问题,口服疫苗的剂量问题也需研究,口服疫苗难以被人们接受,这也是影响研究的重要因素之一;在处理环境污染过程中,植物生长周期长,处理效率低,这些也限制了其应用。

转基因植物是否对人具有潜在的危险,一直没有定论。转基因可能诱发植物本被抑制毒性蛋白过量表达,或者使植物产生新的过敏原,甚至通过转基因食品在人体内的NDA残余危害人类健康。已经有研究报道,证实了转基因马铃薯对于小白鼠的内脏和免疫系统的威胁。国际环保组织绿色和平重申其警告:转基因技术的安全性存在巨大的健康隐患,包括中国在内的各国政府需立即停止任何转基因粮食作物的商业化审批和种植,并同时应加强对转基因食品安全性的研究。

4 展望

转基因植物具有巨大的经济效益和环境效益。利用转基因植物作为生物反应器,生产目的蛋白,抗体,疫苗等也有巨大的发展前景。随着研究的进展,将发展转化率更高的外源基因导入方法,并逐步阐明转基因植物的分子机制,降低转基因植物的“副作用”和潜在的危险性,扩展其接受度。另外,植物转基因技术将可能应用到更多的领域,解决其它领域碰到的生物学难题。

参考文献:

[1] 滑娜,陈振飞.浅谈转基因食品的安全性问题[J]. 旅行医学科学, 2009 (3).

[2] 卢雄斌,宫祖埙.植物转基因方法及进展[J]. 生命科学. 1998 (3).

[3] 曲岷. 植物转基因及其在农业中的应用[J]. 海洋湖沼通报. 2008 (4).

[4] 叶健明, 唐克轩, 沈大棱. 植物转基因方法概述[J]. 生命科学. 1999 (2).

[5] Lee S, Jeon U S, Lee S J, et al. Iron fortification of rice seeds through activation of the nicotianamine synthase gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA . 2009 (51).

[6] Degenhardt J, I. Hiltpold, et al. Restoring a maize root signal that attracts insect-killing nematodes to control a major pest[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 (32).

[7] Sexton A,S Harman, et al. Design, expression, and characterization of a multivalent, combination HIV microbicide[J]. FASEB J. 2009(10).

[8] 孙宁宁等. 转基因技术在污染土壤植物修复中的研究进展[J]. 中国水土保持. 2009 (6).

[9] Yu X H, J Y Gou, et al. BAHD superfamily of acyl-CoA dependent acyltransferases in Populus and Arabidopsis: bioinformatics and gene expression[J]. Plant Mol Biol. 2009 (4).

4.逆境胁迫下植物基因的表达与调控 篇四

逆境胁迫下植物基因的表达与调控

探讨植物在逆境下的适应机制,综述了植物在逆境下相关基因的表达调控方式,由于植物生活的“不动性”使其不可避免地要受到各种逆境的冲击,经过系统的进化,植物本身能够建立有效的适应乃至抗性机制.大量的`研究认为,逆境胁迫下,植物体内脱落酸(ABA)和水杨酸( SA)的含量会发生明显的变化,从而诱导许多新基因表达以及蛋白质合成,来适应环境的变化.植物对环境的适应可能有两种机制.第一种机制是ABA与SA诱导核糖核酸(mRNA)的合成或使其稳定.第二种机制是ABA与SA能引起逆境响应蛋白的积累和翻译调控.

作 者：赵虎成 王伯初 刘堰 蔡绍皙 ZHAO Hu-cheng WANG Bo-chu LIU Yan CAI Shao-xi 作者单位：重庆大学,生物工程学院,重庆,400044刊 名：重庆大学学报(自然科学版) ISTIC EI PKU英文刊名：JOURNAL OF CHONGQING UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：23(5)分类号：Q257关键词：植物生长 逆境胁迫 基因表达

5.转基因植物的鉴定 篇五

论文中英文摘要

作者姓名：丁新华

论文题目：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

作者简介：丁新华，男，1980年06月出生，2002年09月师从于华中农业大学王石平教授，于2008年06月获博士学位。

中

文

摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生产中的两大重要病害，造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害，是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因，研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。

植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因，在依赖于生长素的发育中发挥功能，同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素，而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质－伸展蛋白（α-和β-expansins），破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品种中，病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA－氨基酸的合成抑制生长素的作用，从而阻止细胞壁的松弛，增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性，同时也延缓了植株的生长和发育，至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径，同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。

超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常；通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现，GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常，这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异，但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育，这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达，并随着花的发育表达强弱也不断变化，而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术，筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达，证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达，而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育；检测雌蕊没有发现和野生型有显著

差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性，说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。

在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达，显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达，OsDR8的功能在信号路径的上游。另外，维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。

通过筛选水稻T-DNA插入突变体库，发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低，而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高，在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37，转基因植株类病斑表型消失，说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

关键词：

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗病相关基因；生长素；水杨酸；茉莉酸；基础抗性；发育；伸展蛋白；GH3；维生素B1；类病斑突变体；凋亡；植保素；活性氧物质

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

6.转基因植物的鉴定 篇六

基因转移技术在观赏植物抗性育种中的应用

各种病虫害、杂草、逆境胁迫等不仅会大大降低观赏植物品质,同时也限制了不同类型观赏植物在世界范围内的分布和应用.综述了抗虫、抗病、抗除草剂、抗寒、抗冻、抗旱等抗性基因在观赏植物抗性育种的.应用,提出了当前观赏植物转基因抗性育种中存在的问题并展望了今后的工作重点.

作 者：赵宏波 陈发棣 房伟民 ZHAO Hong-bo CHEN Fa-di FANG Wei-min 作者单位：南京农业大学,园艺学院,江苏,南京,210095刊 名：广西植物 ISTIC PKU英文刊名：GUANGXI ZHIWU年，卷(期)：26(3)分类号：Q943.2关键词：基因转移 观赏植物 抗性育种

7.转基因植物的鉴定 篇七

随着转基因作物在全世界的种植面积日益扩大, 转基因作物及其加工副产物作为畜禽饲料原料的安全性引起了人们的广泛关注, 对于消费的畜产品是否安全人们充满了疑虑, 如转基因饲料是否影响动物健康和生产性能, 转基因饲料的异源DNA是否在畜产品中残留, 饲料加工过程对重组DNA降解的影响如何等等。本文将近年来国内外一些有关研究结果进行综述, 并对其安全性进行评价。

1 转基因植物饲料营养成分

最近几年国内外的许多研究中通过常规方法分析了转基因饲料成分 (粗蛋白质、总能、纤维成分、氨基酸和脂肪酸组成、矿物质) 和不良物质 (如霉菌毒素) 含量。对测定的转基因作物Bt-玉米、Pat-玉米、Pat-甜菜、Gt-小麦的成分与各自等基因亲本进行比较, 表明没有显著差异[3,4]。转基因玉米Bt176和对照的常规玉米之间的干物质、粗蛋白、脂肪、氨基酸和总能含量以及霉菌毒素分析的结果也相近似[5-6]。第一代转基因植物饲料的输入特征仅增加了抵抗昆虫和除草剂、杀虫剂的耐受性等, 营养成分没有实质性改变。因而, 第一代转基因植物饲料与常规饲料相比在动物营养上并没有利用优势。

目前产生第二代转基因植物的时间很短, 国内外的研究报导较少。转基因油菜籽营养成分与亲本相比, 肉豆蔻酸和棕榈酸含量分别由0.1%~11.4%、3.6%增加到20%, 而十八烯酸占总脂肪酸的比例从68.6%下降到42.6%, 干物质中硫代葡萄糖苷含量由12.4μmol/g增加到19μmol/g。含15%的全脂转基因油菜籽日粮饲喂生长育肥猪, 日粮消化率和能量饲用价值与对照组无明显差异, 但动物采食量和体增重下降, 甲状腺的重量及碘浓度也受到影响, 这可能与转基因油菜籽中的硫代葡萄糖苷含量增加有关。转基因油菜籽脂肪酸组成的改变也影响了猪体脂组成, 造成背部脂肪和肌内脂肪中肉豆蔻酸沉积增加, 而十八烯酸含量降低[7]。因此, 植物基因修改不仅增加了期望的物质成分, 副作用也可能伴随发生, 对动物健康和屠体品质可能造成一些意想不到的不利影响。

2 转基因植物饲料对动物的影响

来源转基因植物的原料和加工副产物饲养动物引起了许多异议, 即转基因饲料的重组DNA和外源蛋白质是否对动物机体和生产性能造成影响?转基因植物的食 (饲) 用安全性如何?目前国内外研究人员对此进行了许多的研究。有研究表明, 用转基因Bt-玉米日粮饲养肉鸡的生产性能与对照组 (非转基因型玉米日粮) 的比较无显著差异[5,6]。Bt-176玉米日粮对产蛋母鸡的生产性能参数无明显影响[6]。转基因玉米DAS-59122-7 (抗虫和耐受除草剂双重特征) 日粮饲养海兰产蛋母鸡, 其产蛋量和蛋品质与近等基因型玉米日粮组 (对照组) 的结果相似[8]。转基因玉米DAS-59122-7饲喂生长肥猪育在生长期、育肥前期和后期的日增重、日采食量、增重/耗料与非转基因玉米对照组之间无明显差异, 屠宰率、眼肌面积、第十肋骨背膘厚、屠体瘦肉率指标也与对照组差异不显著[9]。为研究转基因Bt-玉米对鹌鹑生长期和产蛋期的影响, 连续进行了十个世代 (10×12周) 的试验结果显示, 转基因Bt玉米组的生长鹌鹑和产蛋鹌鹑的死亡率、产蛋强度、孵化率、屠宰测定结果和器官重量均与非转基因对照组的差异不显著 (P>0.05) , 但鹌鹑的个体平均重 (176.9g) 略低于非转基因对照组 (180.1g) [10], 长期的实验结果可以看出, Bt-玉米对鹌鹑还是有些不利的影响。用含29%转基因抗草甘膦豆粕日粮饲养断奶仔猪, 其生产性能指标、日粮养分的表观消化率与常规豆粕日粮相比较均无显著差异;但饲喂转基因豆粕日粮的仔猪血液嗜酸性粒细胞、单核细胞计数显著低于对照组, 而嗜碱性粒细胞数高于对照组, 对仔猪血液常规指标有些影响[11]。用转基因稻谷日粮饲喂肉仔鸡, 21日龄时血液碱性磷酸酶含量显著低于对照组 (14.06%) , 42日龄时血液中尿酸含量显著低于对照组 (13.11%) , 其它血液生化指标没有受到影响[12]。转基因Xa21 (表达抗水稻白叶枯病) 大米日粮饲喂大鼠的亚慢性毒性实验中, 第四十五天检测到转基因大米组雌鼠的胆固醇、高密度脂蛋白显著高于非转基因大米组, 而雄鼠的血糖显著低于非转基因大米组;在第九十天实验结束时, 转基因大米组雌鼠的谷草转氨酶活性显著高于非转基因大米组[13], 转基因Xa21大米对大鼠受孕、胚胎生长发育的影响与非转基因大米组无显著差异[14]。卓勤等[15]用转CpTI (豇豆胰蛋白酶抑制剂) 基因大米饲喂断奶大鼠90 d, 结果发现转基因大米组雌性鼠在试验中期红细胞计数及血红蛋白、试验末期的单核细胞计数均明显高于非转基因亲本大米组;转基因组雄性鼠在试验末期的血糖及谷丙转氨酶明显低于非转基因组, 其余指标与对照组无显著性差异。Seralini (2007) [16]对饲喂转基因Bt-玉米MON863日粮的试验大鼠生长曲线进行多变量统计分析发现, 转基因Bt-玉米的影响与大鼠的性别和日粮含量相关, 含11%Bt-玉米组的雄性大鼠体重低于对照组3.3%, 含33%Bt-玉米组的雌性大鼠体重高于对照组3.7% (P<0.05) 。化学检测显示大鼠肝肾有中毒的迹象, 雌性的甘油三酯含量显著增加了24%~40%, 雄性的尿磷、钠分泌显著减少31%~35%, 中毒特征以雄性肾脏、雌性肝脏较敏感。有人分别用三个品种的转基因玉米 (NK603、MON 810、MON863) 日粮饲喂大鼠, 测定了大鼠血液和器官系统中大约有60种不同的生化指标, 结果也证实大鼠出现肝肾中毒的迹象, 并且与性别和日粮含量相关。各转基因玉米品种对机体的影响有所不同, 对心脏, 肾上腺, 脾和血细胞的影响也是明显可见的。这可能是由于每一个转基因玉米品种的新农药 (除草剂或杀虫剂) 特征, 但也不排除基因改变产生意想不到的直接或间接的代谢影响[17]。

至今为止超过100项的现有的动物研究结果一致表明:第一代转基因饲料的营养价值与非转基因品种相比没有明显差异[18]。但现有的大多数试验期较短, 试验动物数量有限, 饲料中潜在的过敏性或毒副作用可能引起动物应激状态或亚临床慢性症状, 人们有可能认为是生物变异而被忽略。转基因植物化学成分与传统作物比较“实质等同”是不完全的, 动物体内的碎片小于180bp, 使它们超出了检测水平[6]。

到目前为止, 转基因植物饲喂动物的组织和器官样品中还没有发现重组DNA的片段[18]。植物叶绿体DNA更容易被发现是与基因复制数和采用PCR检测方法的敏感性有关, 在转基因玉米植物中的每个营养细胞可以包含一个质体基因的几百个副本, 但一个Bt或PAT基因仅有一个单一的副本, 经过动物体内消化系统的降解作用后, 在消化道各个部位均可检测到植物内源的叶绿体基因碎片, 而转基因的碎片可检测到的几率非常小[3]。有的学者认为, 少数已摄入的DNA也许在消化过程中不会被降解, 尤其是在个体由于慢性胃肠道疾病引起的消化异常或免疫缺陷的时候, 有可能DNA进入血液或者被排泄[22]。也许将来检测方法和技术手段的改进能够进一步提高其灵敏性, 能够在畜产品的牛奶、肉、鸡蛋中检测到来自转基因植物DNA的细小碎片。

4 加工过程对转基因植物DNA降解影响

用液氮或无液氮 (-196℃) 粉碎和碾磨并不造成植物DNA任何破坏[20]。转基因大豆经过100℃湿热处理15min后, 外源基因降解为408bp以下的碎片, 在100℃湿热处理3 min后启动子和终止子都产生了降解, 有或无液氮粉碎都未能使大豆基因产生降解, 而膨化工艺使外源基因降解到1512bp以下, 但启动子与终止子并未产生降解[24]。分别从油菜籽、玉米粒、甜菜根中提取的油、淀粉、糖, 经过了化学、物理方法和高温处理, DNA降解成小碎片以至于PCR方法不能检测到特异基因序列;有人认为加热温度在95℃以上和高压蒸汽是很有必要的, 可以完全降解基因组DNA。没有经过加工处理, 农畜饲料包含的植物DNA片段大于21kbp[25]。温度和PH值影响植物DNA和质粒降解, 缓冲剂中的转基因玉米DNA处于65℃温度和PH4的酸性条件下处理至少90 min仍可检测到残留碎片 (957bp) , 转基因大豆生产的豆浆和豆腐, 经过煮沸10 min后, 检测到碎片长度由1714bp减小到1339bp[29]。随着DNA检测技术的发展, 从豆粕、玉米蛋白粉中也成功检测出启动子35S、终止子NOS、耐除草剂基因EPSPS和抗虫基因CryA (b) 等转基因成分[26]。陈颖等[27,28]在大豆加工食品 (大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝) 和玉米加工食品 (玉米片、玉米面、香脆玉米角、窝窝头、爆玉米) 检测中, 以PCR技术为基础, 采用试剂盒 (Kit) 已成功检测到了食品中含有的转基因成分。总之, 只有在高温、低PH值酸性、蒸汽高压条件才有利于转基因DNA的有效降解。通常情况下畜禽的饲料经过粉碎、配料、混合、蒸汽调质、制粒过程 (温度70~80℃) 或青绿饲料的青贮过程都不能有效降解植物的DNA。高温、高压、强酸处理食物或饲料也会造成营养物质变性, 失去应有的营养价值。究竟什么样的加工处理条件下转基因重组DNA能够完全降解、失活, 才不会对人类和动物机体造成影响?这还有待于人们进一步的研究和探索。

5 小结

8.转基因植物的鉴定 篇八

【关键词】顶端外胚层嵴;Cre重组酶;LoxP;特异性敲除

1.实验原理

1.1顶端外胚层嵴（apical ectodermal ridge，AER）概述

AER是由中胚层细胞诱导其外侧的外胚层形成，它位于肢芽的远端边缘、背腹之交界处，是肢体生长的主要信号中心。多指症、并指症、無肢症、短指症等先天性肢体畸形的发生与AER发育的异常和功能的失调都有着密切的联系。

1.2 Col10a1-Cre转基因小鼠

我们构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因（Col10a1）启动子和3.2 kb小鼠X型胶原基因第二内含子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系（Col10a1-Cre）。采用显微注射法将14.7 kb的转基因片段导入小鼠基因组，获得了3只在基因组上整合有Cre重组酶基因。

图1-1 Col10a1-Cre转基因载体构建图

1.3 条件基因打靶技术

运用Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件基因打靶，靶基因或重要功能域片段被两个LoxP序列锚定，经同源重组被引入ES细胞，通过显微注射获得靶基因被两个LoxP序列锚定的条件打靶小鼠，该小鼠只有在与组织或细胞特异性表达Cre的转基因小鼠交配后，Cre介导的重组发生在特定的组织活细胞中，导致这些组织活细胞中靶基因被删除，而其他组织或细胞中由于Cre不表达，靶基因不会被改变[1,2]。

2.实验步骤

2.1实验方法

将Col10a1-Cre小鼠断颈处死，剖开腹部，获取其胚胎，即为Col10a1-Cre;Rosa26双转基因胚胎。取胚胎羊膜组织提取DNA基因组DNA。再将胚胎进行LacZ染色，经脱水处理后，进行石蜡包埋，再将腊块切片，以获取目的组织切片。将切片进行核红复染，再经乙醇复水后用中性树胶封片，用以保存观察。

2.2实验步骤

2.2.1小鼠基因组DNA的提取

（1）剪取鼠尾，置于1.5 mL离心管中，每管加入400 μL鼠尾裂解液（0.5%SDS、0.1 mol/L NaCl、0.05 mol/L EDTA、0.01 mol/L Tris·Cl、100 μg/mL 蛋白酶K），55℃水浴过夜。

（2）每个离心管加入200 μL饱和NaCl溶液（6 mol/L），将离心管上下剧烈摇荡约200次。

（3）将离心管置于冰上，10min，室温12000 rpm离心10min。

（4）将上清500 μL转移至干净的离心管中，每管加入800 μL无水乙醇，混匀，可见絮状沉淀。

（5）室温12000 rpm离心10min，弃上清。

（6）每个离心管加1 mL75%乙醇，振荡吹打，室温12000 rpm离心5min，弃上清。

（7）将步骤6重复一次。

（8）将离心管管口向下，室温干燥约20min，使乙醇挥发即可，不要太干，否则会影响DNA溶解。

（9）将DNA溶解于100 μL TE中，37℃过夜或55℃放置2h，使DNA充分溶解。

2.2.2小鼠基因型PCR鉴定

用引物Cre-1和Cre-2可以扩增出481 bp的片段，用以鉴定Cre基因。PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

2.2.3 小鼠各组织基因组DNA的制备

（1）用断颈法处死基因型Col10a1-Cre小鼠，取各组织样品于Eppendorf管中。

（2）按照2.2.1中提取鼠尾基因组的步骤提取各组织基因组DNA。

2.2.4 Col10a1-Cre和ROSA26双转基因胚胎获得

（1）交配Col10a1-Cre转基因小鼠和Rosa26转基因小鼠，本室保存的ROSA26转基因小鼠已配至纯合，子代全部带LacZ基因，不需再鉴定LacZ基因。

（2）在交配第二天检查母鼠精栓，以看到精栓为准记为E0.5天。

（3）在胚胎期9.5-16.5天用断颈法杀死母鼠，取各胚胎的羊膜组织于Eppendorf管中，按照2.2.1和2.2.2方法提取基因组DNA，鉴定Cre基因。

（4）取胚胎进行LacZ染色

2.2.5 LacZ染色

（1）工作液配制：

PBS（NaH2PO4·2H2O 3.588 g，Na2HPO4 10.93 g，NaCl 8.5 g溶于1 L去离子水中，调pH至7.3）

固定液（PBS（pH7.3）9.45 mL，0.1 mol/L EGTA 0.5 mL， 2 mol/L MgCl2 0.01 mL,50% 戊二醛 0.04 mL）

洗液（PBS（pH7.3）488.5 mL，2 mol/L MgCl20.5 mL， 0.5%脱氧胆酸钠 10 mL,10% NP-40 1 mL）

染色液（5×X-gal buffer 2 mL，X-gal 0.2 mL，洗液（pH7.3）7.6 mL，1 mol/L Tris·Cl（pH7.3）0.2 mL）

核固红染液（核固红 0.1g，硫酸铝 15g，蒸馏水100ml，将核固红溶入15%硫酸铝水溶液中，加热溶解，冷却过滤后备用。）

（2）取胚胎期7.5-13.5天的整个胚胎，置于固定液中4℃固定2-6 h。

（3）染色前，洗液洗3-4次，每次20-30 min。再将组织置于X-gal染液内于37℃染色过夜，待见到相应组织部位出现蓝染，即可终止染色。

2.2.6石蜡包埋、切片

（1）将组织置于固定液中4℃过夜。

（2）将组织进行系列组织脱水。

（3）包埋：将脱过水的组织转至处理好的石蜡（石蜡融化，于60℃放置过夜）中，透蜡2h，中间换蜡两次。将组织转到预热的包埋框中，迅速倾入熔蜡，用温热的镊子调整组织块的位置，放上底板，并在板上倒上一些熔蜡，小心除去底板内的气泡，使熔蜡凝固。

（4）切片：修整蜡块至所需大小，在轮转切片机上切片，调整刀身角度为10°，连续切片，将形成的蜡带移至42℃预热的水上，使样品漂浮在水面上，待样品展开，再将蜡带切成所需长度，移至载玻片上，37℃干燥过夜。

2.2.7核固红复染

（1）将石蜡切片放在58℃烤片2h。

（2）将石蜡组织切片进行二甲苯脱蜡（15 min×2）系列乙醇复水。

（3）置于核固红染液内染色30 s，放入水中稍洗。

（4）染色后的切片经95%、100%、100%浓度的乙醇脱水各1min，二甲苯透明（2 min×2），中性树胶封片。

3.实验结果与讨论

3.1 实验结果

3.1.1 PCR鉴定小鼠基因型结果

取个小鼠胚胎羊膜，按照2.2.2步骤，鉴定小鼠基因型，结果如图3-1：

圖3-1：PCR鉴定基因型结果，2号胚胎为Cre阴性，其他均为阳性

3.1.2 LacZ染色检测Cre重组酶表达位置

为了进一步检测Col10a1-Cre转基因小鼠的Cre重组酶的时空分布，我们将Col10a1-Cre转基因小鼠与Rosa26报告小鼠进行交配，在胚胎期不同时间对得到的Col10a1-Cre;Rosa26双转基因小鼠的胚胎进行LacZ染色。Rosa26报告小鼠LacZ基因前有一个携带强终止子序列的新霉素抗性基因，序列两端被两个LoxP序列锚定。在双转基因小鼠中，Cre重组酶发挥作用，剔除LacZ基因前的新霉素抗性基因和终止子序列，使LacZ基因表达（图3-2）。加入特异性的底物X-gal，表达重组酶的组织或细胞就会出现蓝染。

图3-2 Col10a1-Cre;Rosa26转基因小鼠LacZ染色原理

我们通过对胚胎期11.5天的小鼠胚胎的LacZ染色结果显示，Col10a1-Cre;Rosa26双转基因小鼠胚胎的后肢顶端外胚层嵴都表现强的β-半乳糖苷酶活性而出现蓝染（如图3-3B、D），而在阴性对照Rosa26转基因小鼠中未发现任何蓝染（如图3-3A、C）。

对胚胎期11.5天的小鼠胚胎进行石蜡包埋后切片观察，仅在后肢顶端外胚层嵴表现出LacZ染色活性而出现特异性蓝染（图3-4），表明Col10a1-Cre转基因小鼠在顶端外胚层嵴中特异性表达Cre重组酶。

图3-3 胚胎11.5天Col10a1-Cre;Rosa26

双转基因小鼠胚胎LacZ染色结果

A:Rosa26转基因小鼠胚胎LacZ染色结果。

B：Col10a1-Cre;Rosa26转基因小鼠胚胎LacZ染色结果。

C：Rosa26转基因小鼠胚胎LacZ染色局部放大图。

D：Col10a1-Cre;Rosa26转基因小鼠胚胎LacZ染色局部放大图,箭头所指为顶端外胚层嵴出现的特异性蓝染。

图3-4 11.5天Col10a1-Cre;Rosa26双转

基因小鼠胚胎组织切片核红复染结果

A：Rosa26转基因小鼠组织切片核红复染结果,右下角为局部放大图。

B：Col10a1-Cre;Rosa26转基因小鼠胚胎组织切片核红复染结果,右下角为局部放大图,箭头所指为顶端外胚层嵴出现的特异性蓝染。

3.2实验结论

（1）取Col10a1-Cre小鼠各组织提取基因组DNA进行PCR鉴定，证实Cre重组酶在顶端外胚层嵴中能够特异性表达并能介导LoxP间的重组。Col10a1-Cre转基因小鼠可以作为在顶端外胚层嵴中进行条件基因打靶的工具小鼠。

（2）对Col10a1-Cre;Rosa26双转基因小鼠进行LacZ染色检测Cre重组酶的时空表达分布，在顶端外胚层嵴发现特异性的蓝染，将Cre重组酶的表达范围限定在此区域。

【参考文献】

［１］Lakso M, Sauer B, Mosinger B, Jr., et al.Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A.1992;89:6232-6.

9.转基因植物的鉴定 篇九

植物凝集素及其在抗虫基因工程中的应用

植物凝集素是一类具有高度特异性糖结合活性的蛋白,含有1个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域.它的糖结合特异性主要针对外源寡糖,主要生理功能是介导植物的防御反应,在农业、医学等领域应用前景广阔.综述了植物凝集素的分子生物学的研究进展,介绍了植物凝集素的.分类、性质、结构、功能,以及在抗虫基因工程中的应用.

作 者：李凤玲 徐培洲 肖t 张红宇 汪旭东 吴先军 作者单位：四川农业大学水稻研究所,四川,温江,611130刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：34(3)分类号：Q936关键词：植物凝集素 糖结合活性 结构 功能 抗虫基因工程

10.转基因植物的鉴定 篇十

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的: 构建适于原核表达的.人诱骗受体DcR3基因, 并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定.方法: 查得人DcR3 Cdna全序列, 将其分段设计引物, 通过重叠PCR获得DcR3基因.构建Pet-22b(+)/DcR3表达载体, 转化大肠杆菌Rosseta-gami, IPTG诱导表达, Ni柱纯化.采用ELISA进行特异性鉴定.结果: 通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 蛋白纯度达95%以上.ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合.结论: 诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化, 为进一步的功能研究奠定了基础.

作 者：李文珠 陶惠然 颜江华 张长弓 苏金华 王阶平杨桂旺 庄国洪  作者单位：李文珠,王阶平,杨桂旺,庄国洪(厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005)

陶惠然,颜江华,张长弓,苏金华(厦门大学医学院抗癌研究中心,福建,厦门,361005)

刊 名：细胞与分子免疫学杂志  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(2) 分类号：Q786 关键词：DcR3   基因构建   基因表达  

11.转基因植物的鉴定 篇十一

关键词：植物；ICE；序列比对；系统进化分析

中图分类号： Q943.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）02-0042-06

收稿日期：2015-02-27

基金项目：国家高技术研究发展计划（编号：2013AA102705）；国家自然科学基金（编号：30900871）；江苏省自然科学基金（编号：（BK2011409）。

作者简介：陈露（1989—），女，江苏靖江人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。E-mail：chenlu1201@163.com。

通信作者：罗玉明（1963—），男，江苏涟水人，教授，研究生导师，主要从事植物生物技术研究。Tel：（0517）83525128；E-mail：yumingluo@163.com。

ICE（inducer of CBF expression）是CBF[C-repeat-binding factors，又称DREBs（dehybration responsive element factors）]冷响应通道的上游调控因子，目前主要在拟南芥中发现[WTBX][STBX]ICE1和ICE2[WTBZ][STBZ]这2种ICE基因。ICE一般为组成型表达，常温下没有活性，低温诱导可使[WTBX][STBX]ICE1[WTBZ][STBZ]成活性状态，编码一个类似MYC的螺旋-环-螺旋型（bHLH）转录激活因子，诱导CBF基因的表达，从而提高植物的抗寒性，在转基因植株生长发育过程中没有异常表现[1]。研究表明，ICE2可以直接影响[WTBX][STBX]CBF1[WTBZ][STBZ]基因的表达，将[WTBX][STBX]ICE2[WTBZ][STBZ]基因转入拟南芥发现，拟南芥体内[WTBX][STBX]CBF1[WTBZ][STBZ]基因表达量明显上升，转基因拟南芥可在-20 ℃环境下正常生长[2-3]。由此可见，ICE在植物低温抗性中有着重要的作用。有研究证明，ICE1-CBF转录级联反应在植物响应低温胁迫过程中发挥着至关重要的作用[4]。

目前，依赖CBF的信号转导通路被视为植物低温胁迫应答的主要途径[4-7]。在ICE1-CBF的调控路径中，ICE1在低温诱导下与CBF3启动子顺式作用元件相互结合，并激活CBF3转录，调控CBF及下游抗冷相关基因的转录，也可以与R2R3型MYB转录因子AtMYB15相互作用，负调控CBF基因的表达[2，8]。ICE1蛋白的磷酸化可能涉及到低温胁迫过程中ICE1的活性调控。另外，HOS1编码一种E3连接酶，参与ICE1蛋白的泛素化降解，在低温胁迫过程中，HOS1与ICE1相互作用并降解ICE1，通过ICE1调节CBF的转录。有研究表明，ICE1蛋白在冷胁迫时明显降解，而在HOS1突变体中，ICE1蛋白受冷胁迫降解的程度明显降低[9-10]。

鉴于ICE在植物低温抗性中的重要作用，本研究通过对来源于植物的ICE蛋白进行同源比对，分析系统发生关系，拟找出ICE基因在植物界的系统进化关系，为研究该基因的功能进化提供参考。

1材料与方法

1.1序列信息的获取与筛选

为获得ICE家族的各成员，分别以拟南芥ICE基因的蛋白质序列AtICE1、AtICE2，使用Blastp程序搜索绿色植物数据（http：//blast.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），database选择为non-redundant protein sequences （nr），organism选择为plants（taxid：3193），max target sequences设置为250，其余均为默认参数。对获得的搜索结果用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）进行分析，把具有与拟南芥ICE基本结构特征的序列保留下来做后续分析。

1.2多序列比对及系统进化树的构建

以氨基酸全序列比对结果为基础，用Mega 5.10軟件构建系统进化树[11]。采用Neighbor-joining法运行相应参数[12]：Poisson model模式，缺口设置为Pairwise deletion；校验参数为bootstrap=1 000。系统发生树中，ICE家族各亚族的分组是在相似理论和分类学基础上完成，并用Clustal X软件[13]进行检验。

1.3模体识别

使用MEME模体搜索工具以识别ICE家族相关蛋白质所共有的模体，并对相关参数进行修改，将可找到的模体最大值调整为25，每个模体的最大宽度调整为100，其他均为默认值；MEME在线软件识别的模体通过Smart和Pfam模体识别工具[14-15]进行进一步检验。

2结果与分析

2.1植物ICE基因的鉴定

利用模式植物拟南芥中已测序的2个ICE蛋白基因序列，执行Blastp搜索、关键词搜索、结构域搜索等，以在植物中获得更多的ICE基因；将得到的初始目标序列经过整理、合并、筛选，通过Mega 5.10软件构建系统进化树，并进行逐一比对分析，去除不符合条件的序列，最终确定33个植物（表1）基因组中的65个ICE蛋白质基因（表2）用于分析，其中包括拟南芥2个模板ICE蛋白基因。按照从低等植物到高等植物的顺序依次为：2条来自苔藓植物，即藓纲的小立碗藓；2条来自蕨类植物，即石松纲的江南卷柏；1条来自裸子植物，即松柏纲的北美云杉；21条来自单子叶植物的禾本科和芭蕉科，包括山羊草、小麦、乌拉尔图小麦、水稻、二穗短柄草、大麦、玉米、芭蕉共8种植物；39条来自双子叶植物，包括芥菜、欧洲油菜、蓖麻、大白菜、山嵛菜、板蓝根、荠菜、拟南芥、萝卜、白刺、桉树、蓝桉树、葡萄、鹰嘴豆、大豆、野茶树、番茄、黄瓜、野草莓、榛子、甜杨、毛果杨共22种植物。

nlc202309040708

2.2序列特异性分析

由图1可见，65个ICE蛋白质基因中，有63、63、61、62、63个基因分别包含模体1、模体2、模体3、模体5和模体6；基因GmICE5、GmICE1-like2缺失模体1，基因GmICE5、GmICE6缺失模体2，基因GmICE5、GmICE6、HvICE2-3、PsiICE1缺失模体3，基因GmICE5、MuICE1-3、MuICE1-1缺失模体5，PpICE1、PpICE2缺失模体6。利用NCBI中Blastp对65个植物的ICE氨基酸序列进行结构域搜索，结合MEME做出蛋白序列25个模体（表3）中的模体2、模体3序列进行分析，并用Smart和Pfam进行检验，结果表明，不同来源的ICE氨基酸序列有一定的差异，但仍有一个保守结构域HLH存在，HLH是ICE氨基酸序列的功能区域，包含3个功能位点，分别为DNA结合区域（核酸结合位点）、E-box （5-CANNTG-3）/N-box （5-CACGC/AG-3）的特異性位点、二聚接口（多肽结合位点）。

2.3植物ICE基因家族的系统发生关系

由图2可见，ICE蛋白家族基本按苔藓、蕨类、裸子、单子叶和双子叶植物而分别聚类，说明该基因在进化上具有保守性；大部分允许ICE蛋白亚族分离的节点，自展值都比较小；自上往下，将ICE家族分为4个亚组，分别被称为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、

Ⅳ，其中第Ⅰ大亚组包含所有双子叶植物，第Ⅱ大亚组全部为单子叶植物，第Ⅲ大亚组可分为2个小亚组A、B，其中，小亚组A全部为单子叶植物，小亚组B为裸子植物，第Ⅳ大亚组可分为2个小亚组C、D，其中，小亚组C为蕨类植物，小亚组D为苔藓类植物；Ⅲ和Ⅳ位于系统发生树的基部，其在进化地位上是最原始的类型。

3结论

对植物ICE蛋白基因家族进行分析发现，尽管不同来源的ICE序列表现出一定的差异，但HLH结构域在各植物物种中都有很好的保守性，这说明该基因在进化上具有保守性。对双子叶植物来说，大多数同源基因聚类到一起，如 BrICE1-1 和BrICE1-2，VvICE1-1和VvICE1-2，GmICE5、GmICE6、GmICE1-like1、GmICE2、GmICE1、GmICEb、GmICE4和GmICEd，GmICE1-like2和GmICE3，CsiICE1和CsiICE2，PsuICE1和 PsuICE1；对单子叶植物、蕨类植物、苔藓植物来说，也发生同样的现象。这说明植物ICE蛋白基因家族的进化模式， 应归因于物种特定的扩张，也可以说，植物进化历程

中，细胞扩增过程中的基因复制及细胞分化是ICE蛋白基因家族的主要进化模式。因此，进化树分支末端的基因可能是代表最近复制过程中突变的基因[16]，这为物种特定扩张学说提供了有力支持。同时，研究发现，被子植物中的ICE基因形成不同的分支，这表明单子叶植物和双子叶植物可能有不同的原始ICE蛋白基因。

[HS2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

[1][ZK（#]郑银英，崔百明，常明进，等. 转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究[J]. 西北植物学报，2009，29（1）：75-79.

[2]Chinnusamy V，Ohta M，Kanrar S，et al. ICE1：a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Genes & Development，2003，17（8）：1043-1054.

[3]王翠花，刘沙，张瑞富，等. 植物抗寒分子生物学研究概况及展望[J]. 辽宁农业科学，2014（1）：45-48.

[4]Chinnusamy V，Zhu J H，Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants[J]. Trends in Plant Science，2007，12（10）：444-451.

[5]Zhu J H，Dong Ch H，Zhu J K. Interplay between cold-responsive gene regulation，metabolism and RNA processing during plant cold acclimation[J]. Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：290-295.

[6]Chinnusamy V，Zhu J K，Sunkar R. Gene regulation during cold stress acclimation in plants[J]. Methods in Molecular Biology，2010，639：39-55.

[7]Zhou M Q，Shen C，Wu L H，et al. CBF-dependent signaling pathway：a key responder to low temperature stress in plants[J]. Critical Reviews in Biotechnology，2011，31（2）：186-192.

[8]Agarwal M，Hao Y J，Kapoor A，et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（49）：37636-37645.

nlc202309040708

[9]Dong C H，Hu X Y，Tang W P，et al. A putative Arabidopsis nucleoporin，AtNUP160，is critical for RNA export and required for plant tolerance to cold stress[J]. Molecular and Cellular Biology，2006，26（24）：9533-9543.

[10][ZK（#]Dong C H，Agarwal M，Zhang Y Y，et al. The negative regulator of plant cold responses，HOS1，is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（21）：8281-8286.

[11]蔣瑶，陈其兵. 植物CBF1转录因子的生物信息学分析[J]. 林业科学，2010，46（6）：43-50.

[12]王波，孙君社，翟玉盼，等. 植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族的分子进化分析[J]. 生物技术通报，2011（1）：83-89，94.

[13]金谷雷，汪旭升，朱军. 水稻14-3-3蛋白家族的生物信息学分析[J]. 遗传学报，2005，32（7）：726-732.[HJ]

[FK（W46][TPCL222.tif；S+2mm][FK）]

[14][ZK（#]Schultz J C R，Bork P. Smart：a web-based tool for the study of genetically mobile domains[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（1）：231-234.

[15]Sonnhammer E R，Durbin R. Pfam：a comprehensive database of protein domain families based on seed alignments[J]. Proteins，1997，28（3）：405-420.

[16]Xiong Y Q，Liu T Y，Tian C G，et al. Transcription factors in rICE：a genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots[J]. Plant Molecular Biology，2005，59（1）：191-203.