实时荧光定量PCR技术综述

2024-12-02

实时荧光定量PCR技术综述（8篇）

1.实时荧光定量PCR技术综述篇一

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

来源：中国论文下载中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武

【摘要】检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。

【关键词】实时荧光定量PCR；检测限；统计推断

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。

文献中FQPCR检测限的描述

检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”［2，3］、灵敏度［5～7］等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有：阴性HBV DNA≤106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml［5］、104拷贝/ml［6］、8.6×102拷贝/ml［7］；HCⅡ法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml［7］；103 Eq/ml理论值时到达检测极限［3］；PCRFP检测HBV DNA的最低检测出量1×101拷贝［2］；bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限［3］。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍。

FQPCR检测过程简介

以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40 μl血清样本加40 μl DNA提取液处理后，将其中2 μl（相当于1 μl血清）加入主反应液（含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等）管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧光强度，记30次温度循环后结束。在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值（Cyclethreshold),它与反应管中DNA起始拷贝数的对数值（lgN)呈非常显著的直线相关关系。自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起始拷贝数值（lgN)的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数（N）。当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值为30，不计算起始拷贝。确定FQPCR检测限的统计学原理

如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多次检测空白的方法来确定。可信限为95%时检测限＝x空白+2.s空白；可信限为99.7%时检测限=x空白+3.s空白。这是目前多数检测限的确定方法。对核酸检测方法的检测限的理解可能与此有差别，但是原理应是一致的［1］，FQPCR检测限也应是推论总体与空白有统计学差异的最小抽样结果。

FQPCR检测限的统计推断

假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中(如1.0 μl)病原颗粒数的分布服从Poisson分布。以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总体概率。从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝［2］。例如：血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 ℃放置，离心，吸取上清液2 μl作模板进行扩增检测(2 μl上清液相当于抽样1 μl血清)［2］，其中至少有1个拷贝的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/μl。由Poisson分布的概率函数公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1～9的概率见表1。

表1 总体为1～9时抽样为0的概率及总体（略）

在FQPCR检测HBV DNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号(即当Ct≥30)，反应管检测结果为0时，推论总体拷贝数为1～9的概率之和>0.581 92，总体为其他的概率之和<0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为1～9时的概率见表1。当一次抽样结果≥4时，推论总体为1的概率≤0.015 33，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果≥4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/μl。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值GM±0.5 log(10)［9］作为可接受的定量范围］。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/μl的样本符合率仅35.2%；Mancini C 等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(<50%)；抽样单位的任意放大：在上述HBV DNA检测中，抽样单位是1 μl血清［如血清前处理过程中有抽提(浓缩)过程，取2 μl上清液相当于实际含12.5 μl血清，则抽样单位也只是12.5 μl］，而报告结果的单位是ml甚至L。当总体为1拷贝/μl时表示一次抽样结果为0的概率达0.368，结果在0拷贝/μl～4拷贝/μl的概率为0.996；而总体为1 000拷贝/ml时表示一次抽样结果为0的概率为0，结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997(Poisson分布总体>50时近似正态分布，范围是X±uα*√X，可信限为99.7%时uα=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR检测为例，其他病源体核酸的FQPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 μl血清则检测限相当于0.32拷贝/ μl。此推断仅是针对FQPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸的拷贝数进行讨论。【参考文献】

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2.实时荧光定量PCR技术综述篇二

关键词：实时荧光定量PCR技术,优点与缺陷,应用情况,研究探讨

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈,与常规PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点,使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

在实时荧光定量PCR技术中,它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是,当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线,所以,依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系,因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。

相比于常规PCR,实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环,模板的初始量可以定量分析。简言之,实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增,正比于产品的对数扩增样品的DNA含量,因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。

2 实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷

2.1 实时荧光定量PCR技术的优势

与传统的PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处,具体如下[2]:

(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究,极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用;

(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度:科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量,检测极限能够实现10 cells/样品[4];

(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量,简便快捷:对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线,通常可以超过7个数量级以上;

(4)实时荧光定量PCR技术安全性高:在样品的定量检测在PCR反应完成后,没有进一步的后续处理,减少了工作量,以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide,EB)等诱变风险的过程。

2.2 实时荧光定量PCR技术的缺陷

实时荧光定量PCR技术是一种高效,灵敏,安全的分子生物学手段,已经成为主流定量核酸的技术之一,但此技术还不是很成熟,在使用过程中还存在一些缺陷,具体如下[1,2,3]:

(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的,这会对实验结果的准确性有一定的影响;

(2)标准曲线制作过程是非常复杂的,目前还没有统一的标准方法,这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性;

(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确,目前的大多数研究是基于平均份数进行评估,其精度是可疑的;

(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术,目前在我国还没有广泛的应用基础;

(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。

2.3 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示,荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S r DNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nir S)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)种类的丰度,说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量,表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量,发现分布相对均匀,泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospira spp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的总量进行了定量监测。

在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol,PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测,研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大,并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析,结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升,系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eae A和rfb E进行实时荧光定量PCR检测,表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数,表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级,腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcy A基因进行了定量的分析,实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。

3 结语

3.实时荧光定量PCR技术综述篇三

方法：采用FQ-PCR方法对984例泌尿生殖道感染患者解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌同时进行检测。

结果：984例样本中阳性的有435例，阳性率为44.2%，其中UU、CT、NGH分别占总例数的40.7%、7.9%、1.7%，UU、CT混合感染44例，占4.5%，UU、NGH混合感染10例，占1.0%，UU、CT、NGH混合感染的3例，占0.3%。

结论：泌尿生殖道感染患者中，UU、CT、NGH各占有一定比例，应尽可能的为患者进行全面的检查，以及时发现合并感染，给予有效的治疗。FQ-PCR技术检测UU、CT、NGH具有反应时间短、结果客观准确，敏感性和特异性好的优点，适宜门诊初查。

关键词：荧光定量PCR解脲支原体沙眼衣原体淋球茵

【中图分类号】R-3【文献标识码】B【文章编号】1008-1879（2012）12-0396-02

解脲支原体、沙眼衣原体、淋球茵为临床常见的性病病原体，它们通过性传播所致的泌尿生殖道感染者日益增多，且有逐年上升趋势[1]。为了解解脲支原体、沙眼衣原体、淋球茵在一般人群中的感染率，评估UU、CT、NGH在人群中传播的危险性，本文应用荧光定量PCR（FQ-PCR）技术对984例患泌尿生殖道感染的患者，取其宫颈、尿道分泌物同时进行UU、CT、NGH的检测，现就其结果分析如下。

1材料与方法

1.1一般资料。选择2012年1月到6月我院门诊患者984例，其中男性186例，女性798例，年龄18-49岁。用无菌棉拭子插入女性宫颈1.0-1.5cm或男性尿道2-3cm，转动10秒并停留数秒钟后将棉拭子取出密闭送检。

1.2仪器与试剂。采用达安基因股份有限公司生产的DA7600全自动荧光定量PCR分析仪，试剂盒为达安基因股份有限公司的配套产品。

1.3方法。标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中离心5分钟，弃上清后沉淀加无菌生理盐水1ml混匀，离心5分钟后沉淀直接加50μlDNA提取液充分摇匀，在100℃金属浴中10分钟，离心5分钟后，取上清液5μl加入各反应管后放入PCR扩增仪进行PCR扩增。

2结果

984例样本中阳性的有435例，阳性率为44.2%，其中UU、CT、NGH分别占总例数的400例（40.7%）、78（7.9%）、17（1.7%）。见表1。

从感染情况来分析，单UU阳性343例（39.4%），单CT阳性31例（3.2%），单NGH阳性4例（0.4%），UU、CT混合感染44例（4.5%），UU、NGH混合感染10例（1.0%），UU、CT、NGH混合感染的3例（0.3%）。见表2。

3结论

随着经济发展，生活水平的提高，社会交往活动的日益频繁，性意识和性行为的改变，目前我国STD已成为常见疾病，且呈上升趋势，因此，开展性病防治、性病监测及开展新的检测技术早期诊断、提高检出率是卫生工作者的重点。FQ-PCR是把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体，PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭的条件下进行，从根本上解决了PCR扩增产物污染的问题，其敏感度高，特异性强，它不仅克服了常规PCR假阳性问题，而且还能对标本准确定量，大大提高临床检出率[2]，其用于检测UU、CT、NGH具有反应时间短、结果客观准确，敏感性和特异性好的优点，适宜门诊初查。

在984例患者进行的检测结果中，阳性435例，阳性率为44.2%。其中感染率最高的是UU，阳性率高达40.7%，CT次之，阳性率为7.9%，NGH最低，阳性率仅有1.7%。从感染情况来分析，单UU阳性343例（39.4%），单CT阳性31例（3.2%），单NGH阳性4例（0.4%），UU、CT混合感染44例（4.5%），UU、NGH混合感染10例（1.0%），UU、CT、NGH混合感染的3例（0.3%）。混合感染率较高，说明性传播疾病患者经常不是单一病原体感染，因一种病原体感染后导致人体局部抵抗力降低，从而容易合并其他病原体的感染，所以应尽可能的为患者进行全面的检查，以及时发现合并感染，给予有效的治疗。

UU、CT及NGH感染可导致育龄男女不孕不育、流产、早产等。所以，在加强对性病诊断的同时应加强宣传教育，增强人們对泌尿生殖道感染的认识，积极防治，避免漏诊，减少危害。

参考文献

[1] Takahashi S，Takeyama K，Kunishima Y，et al.Analysis of clinical manifestations of male patients with urethritis[J].J Infect Chemother，2006，12 （5）：283—286

4.实时荧光定量PCR技术综述篇四

【中文摘要】TTV(Torque teno virus)属于环病毒科指环病毒属成员,为单股、环状、负链的DNA病毒,正20面体对称结构,无囊膜。人源TTV基因组大小约为3900bp,猪源TTV约2700bp。到目前为止,尚未发现猪源TTV与任何一种猪病有必然联系,但是与一些猪病的发生有一定的相关性,如断奶猪多系统衰竭综合症、猪皮炎肾炎综合症等,因此,研究猪源TTV对于预防其潜在的致病性有重要意义。

1、由于还没有找到适合在体外培养TTV的细胞系,其基因组结构及复制转录机制尚不清楚。本研究利用本实验室构建的含有TTV2基因组三种不同拷贝数的质粒pSK+1TTV2(含有1个TTV2基因组拷贝的pSK载体)、pSK+1.3TTV2(含有1.3个TTV2基因组拷贝的pSK载体)、pSK+2TTV2(含有2个TTV2基因组拷贝的pSK载体),将其转染至张氏肝细胞,48小时后,提取总的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用预测的阅读框ORF1、ORF2、ORF3的扩增引物,确证其中的DNA已经消除干净。RNA经反转录后,用这三对引物扩增基因片段,经克隆和测序,结果发现:ORF1确实发生了转录,但转录产物并非O...【英文摘要】TTV(Torque teno virus), a small, non-enveloped virus, has a single-stranded circular DNA genome and is currently classified into the family Anelloviridae.Viral DNA of both porcine TTV species(TTV1 and TTV2)has a high

prevalence in both healthy ans diseased pigs worldwide and multiple infection of porcine TTV species with distinct genotypes or subtypes of the same species has been documented in China.Human TTV genome has 3900bp and porcine TTV 2700bp.So far, no porcine diseases have been found a reason...【关键词】猪源TTV ORF 荧光定量PCR 多克隆抗体

【英文关键词】porcine TTV ORF fluorescence quantitative PCR polyclonal antibody 【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848 同时提供论文写作一对一辅导和论文发表服务.保过包发

【目录】猪源TTV转录本的鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立摘要6-817-29

Abstract8-9

第一章绪论

1.2 人TTV 的研

1.2.2 1.1 TTV 的发现及概况17-19究进展19-251.2.1 人TTV 流行情况的调查19人TTV 的分子生物学特征19-242

41.2.3 人TTV 的致病性

1.3 猪源TTV 研1.2.4 人TTV 感染的诊断24-25究现状25-272

51.3.1 猪源TTV 的流行病学调查

1.3.3 猪源TTV 1.3.2 猪源TTV 的基因型25-26

26的分子生物学特征26-27

1.3.4 猪源TTV 的致病性

1.3.6 TTV 研究第二章猪源TTV

2.1.1 质1.3.5 猪源TTV 的检测方法

1.4 目的和意义的前景展望2727-29转录本的鉴定29-472.1 材料与方法29-37

粒、菌株和细胞2929-3030

2.1.2 试验试剂和主要仪器设备2.1.3 CaCl_2 法制备大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞2.1.4 阳性质粒转化至DH5α感受态细胞30

312.1.6 阳性质粒的酶切鉴定

2.1.8 阳性质粒转

2.1.5 小量制备阳性质粒312.1.7 大量制备阳性质粒31-33

33-3

42.1.9 提取总染至张氏肝细胞系RNA34-3535段362.1.10 总RNA 中残余DNA 的检测

2.1.12 PCR 扩增目的基因片

2.1.14 目的基因2.2.1 含TTV2 2.1.11 反转录35-362.1.13 PCR 产物的回收36-37

2.2 结果37-45片段的克隆与测序FJ2 基因组不同拷贝数的三种质粒的酶切鉴定结果37-382.2.2 含TTV2 FJ2 基因组不同拷贝数的三种质粒的大

2.2.3 总RNA 反转录后目的基因的扩增结

2.3 讨论量抽提结果38-39果39-4145-4747-614747-48482.2.4 测序结果分析41-45第三章猪源TTV2 ORF1 和ORF2 的多克隆抗体制备3.1 材料与方法47-543.1.2 试剂与仪器47

3.1.1 质粒、菌株与载体3.1.3 实验动物3.1.4 TSS 法制备BL21(DE3)pLysS 感受态细胞3.1.5 ORF1 全长的体外表达48-49

3.1.6 ORF1 的3.1.7 B 细胞表位富集区和ORF2 全长的体外表达49-53ORF1a 和ORF2 的多克隆抗体的制备53-54ORF2 多克隆抗体的ELISA 效价测定54

3.1.8 ORF1a 和3.2 结果

54-593.2.1 ORF1 的抗原性分析结果54-553.2.2 ORF1a 和ORF2 基因的PCR 扩增5555-5656-5959

3.2.3 重组质粒的鉴定3.2.4 ORF1a 和ORF2 重组蛋白的表达与纯化3.2.5 ORF1a 和ORF2 多克隆抗体的ELISA 效价测定3.3 讨论59-61

第四章猪源TTV 荧光定量PCR 检4.1 材料与方法61-644.1.2 试剂和仪器61-62

4.1.1 病4.1.3 引物

4.1.5 测方法的建立61-69料与核酸样品61和探针设计62阳性标准模板的制备63636464-65验结果67结果67-6869-7081

4.1.4 病毒基因组DNA 的提取6262-63

4.1.6 标准曲线的绘制

4.1.8 敏感性试验4.1.7 特异性试验634.1.9 重复性试验63-644.2 结果64-68

4.1.10 病料的的检测

4.2.1 标准曲线的建立

4.2.3 敏感性试4.2.5 样品检测4.2.2 特异性试验结果65-674.2.4 重复性试验结果4.3 讨论68-69参考文献70-80

第五章全文结论致谢80-81

5.实时荧光定量PCR技术综述篇五

1 材料与方法

1.1 毒株

鹅细小病毒病毒GPVS1株、鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒, 均为华南农业大学禽病实验室保存。

1.2 主要试剂

SYBR Green Realtime PCR Master MixPlus, 购于广州美津生物技术有限公司;PCR试剂、RNA抽提试剂盒, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.3 GPV-VP基因的扩增和克隆

参考GenBank中鹅细小病毒B株VP基因的核苷酸序列, 根据其保守区域的序列设计特异性引物扩增GPV-VP基因。引物序列:上游引物GPV-VP-PCR-F 5′-TGATTCTGCCCTCCCTTCCA-3′;下游引物GPV-VP-PCR-R 5′-TGATGAACACCGAGTCTTCCTTAC-3′。引物由上海基康生物技术有限公司合成。

1.4 PCR反应

取含GPVS1株的番鸭胚尿囊液经100 ℃水浴10 min, 然后冰浴5 min, 15 000 r/min离心10 min;取上清液作模板进行PCR。反应体系:模板DNA 3 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, GPV-VP-PCR-F (25 pmol/μL) 0.5 μL, GPV-VP-PCR-R (25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 16 μL, 总体积为25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 54 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。按广州瑞真生物技术有限公司的Gel Extraction Kit说明书纯化目的片段, 将该目的片段连接到pMD18-T载体, 重组质粒pMD18-T-VP经PCR与双酶切鉴定后进行测序。RNA病毒 (尿囊液) 的提取按照产品说明书操作。反转录采用20 μL体系:RNA 9.5 μL, 随机引物1 μL, 10×RT Buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, RNA酶抑制剂0.5 μL, AMV反转录酶1 μL, 加灭菌去离子水至20 μL。混匀, 室温下作用10 min, 接着42 ℃水浴1 h, 即为cDNA。

1.5 实时荧光定量PCR试验

1.5.1 引物及PCR条件

以上述重组质粒为模板, 选择保守序列设计荧光定量PCR 特异性引物, 序列为GPV-VPRT-PCR-F 5′-TTCTCCTACCACTCCCGCTACTT-3′;GPV-VPRT-PCR-R 5′- TGGTCTACATTTCCAGCA2GTTTGT-3′。扩增的目的片段是VP基因序列中3 011～3 144 bp的134 bp片段。pMD18-T-VP稀释10倍测定其在波长280 nm的吸光度值, 计算DNA的浓度和拷贝数。然后以标准质粒10倍梯度稀释溶液为模板, 根据SYBR GreenⅠReal-time PCR试剂盒说明, PCR反应中各组分如下:2×SYBRmixL 10 μL, GPV-VPRT-PCR-F (10 μmol/L) 0.4 μL, GPV-VPRT-PCR-R (10 μmol/L) 0.4 μL, ddH2O 6.2 μL, pMD18-T-VP 3 μL, 总体系为20 μL。荧光定量PCR反应程序:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s;60 ℃退火15 s, 72 ℃延伸40 s, 共38个循环。荧光定量PCR反应结束后制作熔解曲线, 反应程序:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 40 s, 95 ℃ 15 s。

1.5.2 特异性检测

用引物GPV-VPRT-PCR-F/R对实验室保存的鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒等进行PCR检测。

1.5.3 灵敏度分析

将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5×102个拷贝/μL, 以各梯度稀释液为模板进行PCR反应。最低起始模板浓度即为该Real-time PCR反应的灵敏度。

2 结果

2.1 pMD18-T-VP重组质粒的构建结果

以病毒DNA为模板进行PCR反应, PCR 产物大小约407 bp。将PCR产物克隆进pMD18-T载体, 经PCR扩增和双酶切鉴定后, 最终测序结果证明重组质粒为阳性。该测序结果与GenBank中公布的GPV核衣壳蛋白基因序列的相似性为98.3% (见图1) 。

2.2 荧光定量PCR 结果

2.2.1 扩增曲线分析

将标准质粒pMD18-T-VP进行10倍梯度稀释后, 选取3.5×104～3.5×107个拷贝/μL的稀释样品作为模板进行PCR反应, 扩增曲线见图2。模板浓度越高, Ct值越小, 即扩增曲线越早进入对数期。阴性对照在36个循环后出现扩增现象, 熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。

2.2.2 标准曲线分析

PCR扩增结束后, 根据起始模板浓度和相应的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数r2 =0.975, 扩增效率E=86.2% (见图3) 。

2.2.3 熔解曲线分析

目的产物熔解温度为88 ℃, 引物二聚体熔解温度为82 ℃。在3.5×102个拷贝/μL的模板浓度下, 虽然也有相同熔解温度产物的产生, 但是其扩增Ct值已经与空白对照很相近, 结果为阴性 (见图4) 。

2.2.4 灵敏度分析

从扩增曲线可见, 当模板浓度为3.5×103个拷贝/μL时, 荧光定量PCR 可以扩增出特异性产物。当模板浓度为3.5×102个拷贝/μL时, PCR反应虽然能扩增出相同熔解温度的条带, 但是其Ct值已经基本与空白对照重合。因此, 该SYBR GreenⅠReal-time PCR 方法检测灵敏度为3.5×103个拷贝/μL。

2.2.5 重复性试验结果

对于不同浓度的模板, 4个平行样品之间的Ct值差异不显著, 表明该方法具有很好的重复性 (见图5) 。

2.2.6 特异性检测结果

针对实验室保存的与鹅细小病毒共感染的其他病毒鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒进行特异性检测。图6为GPV的扩增曲线, 其余模板均为阴性, 即该引物对GPV具有很好的特异性 (见图6) 。

3 讨论

试验建立的针对鹅细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法在病毒3.5×103～3.5×107个拷贝/μL的浓度范围内具有很好的检测效果。荧光定量PCR 技术较其他技术有灵敏度高的显著特点, 因此试验同时要严防污染问题, 即需要实验人员良好的操作技能和实验室的洁净环境。

在临床上, 仅依靠症状和病理变化不能很好地区分鹅细小病毒病和其他鹅病毒病。目前, 用于诊断鹅细小病毒的病毒分离培养和中和试验存在诸多弊端, 例如:达不到快速、准确诊断;依赖操作人员的技术判断误差较大;容易与其他鹅病毒病 (鹅源新城疫、鹅流感) 感染相混淆;更为重要的是不能很好地用于早期临床诊断 (敏感性差) 。而实时荧光定量RT-PCR的敏感性高、特异性强、操作方便, 便于早期临床检测[5], 但也存在技术操作复杂、成本高以及不能很好地现场应用等缺点[6]。本试验建立的鹅细小病毒实时荧光定量PCR检测方法可以结合传统的诊断方法, 为该病的防制提供技术支持, 但该方法与荧光杂交探针实时PCR方法相比, 其检测特异性、灵敏性还有待提高。

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6.实时荧光定量PCR技术综述篇六

由于猪瘟病毒不能产生细胞病变,国标中对病毒含量或疫苗效力检验主要依靠兔体定型热反应方法,该方法试验成本较高、操作繁琐、试验周期较长,且受试验动物个体差异、环境因素等多方面原因影响,检测结果不是十分准确[8,9]。因此,建立新型实用、标准化疫苗效力检验替代方法势在必行。荧光定量RT-PCR方法可以对病毒含量实时监测,具有特异、敏感、快速、高通量和实时等优点,为猪瘟病毒含量测定及猪瘟疫苗效力检验提供了新的技术支持[10]。本研究采用RT-PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术,通过荧光信号的变化检测猪瘟病毒RNA,相对定量对比各批次间猪瘟疫苗的抗原含量。

1材料与方法

1.1试验材料Hight Pure Viral RNA Kit购自Roche;PRRSV荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京生科尚仪;常规化学试剂、耗材和药品均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2待检疫苗收集省内使用的由10个厂家生产(A~J)的23种不同类型、不同批次疫苗,包括传代细胞苗、细胞苗、脾淋苗。

1.3病毒核酸提取将待检疫苗用灭菌生理盐水配制成20头份/m L原液,反复冻融3次后,3 000 r/min离心2 min,取上清。按照动物组织基因组RNA提取试剂盒(Hight Pure Viral RNA Kit)操作方法提取疫苗RNA,洗脱核酸,后置于-20℃备用。

1.4实时荧光RT-PCR检测方法猪瘟疫苗病毒含量检测按照北京生科尚仪的方法进行:反应体系25μL,其中RT-PCR反应液15μL、Taq酶0.25μL、模板RNA 10μL。反应条件为42℃、30 min,92℃、3 min后进入第一个循环,循环参数为92℃、10 s,45℃、30 s,72℃、60 s;5个循环后进入第二个循环,参数为92℃、10 s,60℃、30 s,40个循环;60℃时收集荧光。

2结果与分析

2.1实时荧光定量RT-PCR检测结果检测1-23#猪瘟疫苗样品,结果见图1。

2.2疫苗抗原含量检测结果分析通过荧光定量RT-PCR对疫苗的抗原含量进行检测,以9号标准品为参照校准相应的RID值。结果表明:17-23#猪瘟活疫苗抗原量不合格,抽检样品合格率仅为69.56%;传代细胞苗的抗原量明显优于细胞苗和脾淋苗,检测还发现脾淋苗的抗原量优于细胞苗;不同厂家生产的同一类型疫苗,疫苗抗原量差异大,同一厂家生产的同种疫苗批间差异较大;以9号样品为参照标准,换算出各批次的大致兔体反应量,检测仍发现有部分厂家生产的猪瘟活疫苗抗原量为0以及不符合国标的疫苗(见表1)。

3讨论

1)目前,我国猪群流行的CSFV基因型仍以2.1亚型为主,2.1b类毒株为绝对优势流行毒株。根据中国兽医药品监察所王琴等[11,12,13,14,15]证实,猪瘟“C株”兔化弱毒疫苗对不同基因型CSFV毒株仍能提供有效保护,产生良好的体液和细胞免疫。李安等[12]建立基于SYBR Green iv实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量,进一步说明荧光定量RT-PCR代替兔体定型热反应的可行性。尽管客观上讲,荧光定量RT-PCR方法只能对CSFV疫苗中的核酸进行定量,但当选择恰当的标准品并在同一反应体系的前提下,核酸含量的多少还是能在较大程度上反映出病毒含量的高低。

2)当前养殖场的猪瘟免疫意识和生猪的猪瘟免疫密度都较高,80%以上猪群均注射过兔化弱毒疫苗,种猪场几乎是100%免疫。但临床走访和检测发现,猪瘟免疫合格的养殖场比例并不高,仅在70%左右。猪瘟免疫失败的原因,一方面与临床使用的部分厂家猪瘟疫苗质量有关,另一方面与猪体的健康程度、免疫程序、母源抗体的影响及市场化疫苗的冷链系统等方面的问题有关。我国有优质的基础种毒,但因诸如细胞源疫苗、组织苗和传代细胞苗质量标准不同,生产工艺的多样化及不良市场竞争等,猪瘟疫苗的严格统一管理和质量控制存在一定困难,导致临床上猪瘟免疫效果不理想。

3)猪瘟病毒基因组稳定,变异频率低,只有一个血清型,且猪瘟疫苗依然是最优秀的疫苗[15,16,17],这些都为猪瘟的控制提供了技术保障。规模化养殖场只要做好生物安全措施,坚决淘汰病原阳性猪,隔离圈建设与全面定期消毒,加大后备猪筛选和监测力度,严格人员出入,使用合格抗原量高的猪瘟疫苗,猪瘟是完全能够控制的

7.实时荧光定量PCR技术综述篇七

MicroRNA (miRNA)是一类进化上保守的,长度约22个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA。在动物中,绝大多数miRNA可通过与靶mRNA的3'UTRs(untranslated regions)近乎完全互补结合在转录后水平使其降解,或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成,从而在基因表达中发挥重要的调节作用[3]。在人体内大约发现的500种miRNA,主要通过与mRNA碱基互补从而抑制目标mRNA的翻译或者降解目标mRNA,同一个miRNA可以调节多个mRNA。Lewis[4]等预测人类至少有三分之一的基因受miRNA调控,平均每个miRNA调节人类200种不同的mRNA,而且多个miRNA能够协调活动以调节一些特殊的目标靶基因。

在生物体中,miRNA的特异性不强,往往一个miRNA作用于多个靶基因[5],其调控主要通过两种机制调控基因的表达[6],其一是当miRNA序列与靶基因mRNA的3'UTRs碱基近似完全互补配对时则进行切割,促使靶基因的mRNA发生降解[7];另一作用机制是miRNA通过与靶基因mRNA的3'UTRs碱基不完全匹配结合,抑制靶基因mRNA翻译表达,进而发挥其功能,但不影响靶基因mRNA的稳定性[8]。近年来国际上对于miRNA与乳腺癌的相关研究进展很快。研究表明,在人类乳腺癌细胞中,特定miRNA的表达缺失或表达上调会使这些癌细胞具有潜在的转移性。Trvzoie等[9]采用微阵列芯片筛选多个转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞株,证明miR-126在抑制肿瘤转移中发挥关键作用。并且在大多数高侵袭性的乳腺癌细胞系中miR-126表达缺失或降低,通过恢复其表达可以使癌细胞的转移活性减少80%。其中miR-126表达能够抑制肿瘤的生长和增殖。另外miR-126也参与肺癌细胞的黏附、转移和侵袭,可能是信号接头蛋白Crk参与受体酪氨酸激酶和整合蛋白等多种分子的信号转导通路而改变细胞的黏附、转移和侵袭能力[10]。

1 资料与方法

1.1 标本来源

本实验所采用的标本来自云南省肿瘤医院乳腺病科及解放军昆明总医院普通外科2010年6月至2010年12月外科手术切除的乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织(距离原发病灶5cm) 20例。均为女性患者,平均年龄48.25岁,所有标本均经过病理学证实。患者手术前、手术中均未曾进行过放疗、化疗及免疫治疗等。手术切除的新鲜标本均立即放入加有RNAlater solution (AMBION) 5ml的Rnase free冻存管中,并且按照厚度小于0.5cm的新鲜组织(如果厚度大于0.5cm先切薄)浸入5～10倍体积的RNAlater solution中为标准保存组织。

1.2 总RNA的提取

按照Trizol法提取组织总RNA,先称取0.05～0.1g组织,放入EP管后加入Trizol (invitrgen) 1ml使用Handy pestle进行充分研磨。将研磨匀浆后的组织悬液严格按照Trizol(invitrgen)操作说明提取总RNA。提取后的样品均使用紫外分光光度仪评估RNA的浓度及纯度。

1.3反转录及实时荧光定量RT～PCR cDNA的合成采用Universal

cDNA synthesis kit(EXIQON),严格根据操作说明进行,每一合成反应体系中包含约2μl的5x Reaction buffer,5μl的Nucleasefree water,1μl的Enzyme mix和2 ul稀释为5ng/μl的总RNA,采取42℃水浴1h,95℃水浴5min或者PCR仪完成反转录。实时荧光定量RT-PCR反应采用LNAtmPCR primer set(EXIQON),严格按照操作说明进行,反应总体系为10μl,其中含有SYBR Green master mix5μl,PCR primer 1μl,cDNA模板4μl。其中的引物序列由EXIQON公司提供。最好应用ABI-7900HT荧光定量仪进行实时荧光定量RT-PCR。在扩增miRNA-126的同时,还扩增了U6RNA作为内对照,待测miRNA-126的量通过2-△CT法确定△△CCT=癌组织[CT(miRNA)-CT(U6RNA)]-癌旁正常组织[CT(miRNA)-CT(U6RNA)]。癌组织及癌旁正常乳腺组织均经过病理学证实,实时荧光定量RT-PCR结果为3次独立实验的校正结果。

2 结果

笔者所选择的miR-126在反应体系中均能有效扩增,根据CT值间的比较,采用配对t检验法分析每一组织miRNA-126的变化比率,用以评估miR-126在乳腺癌和癌旁正常组织的表达情况。根据数据分析得出的结果,发现癌组织中miR-126的表达量低于正常组织中的表达量P<0.0001。

3 讨论

LNA (Locked Nucleic Acid),即锁核苷酸,是由一类新的二环高亲和性RNA类似物组成,其中通过引入2'-O,4'-C亚甲基桥,使糖-磷酸骨架的呋喃糖环被化学锁定而形成N形(内部C3')结构的RNA模拟物,LNA修饰的寡核苷酸链在与其标靶RNA分子杂交时具有前所未有的热稳定性。故在此基础上,检测miRNA-126时利用LNA修饰的探针做Northern杂交。用LNA修饰的探针灵敏度比末端标记的同序列DNA探针至少高出10倍,这便能节省总RNA的用量。另外值得一提的是,LNA可以改善错配识别,使得LNA介导的高亲和性杂交符合标准Watson-Crick碱基互补配对原则而不会出现碱基配对差错。

实时荧光定量RT-PCR在空间表达分辨率、准确性、灵敏度、特异性等方面较之Northern杂交分析及芯片分析有绝对倾倒性的优势[11]。

相对于传统DNA及mRNA水平的诊断方式而言,在时间及准确性上miRNA能够更早的提示癌变。并且miRNA作为重要的肿瘤抑制基因或癌基因,可以对于那些作为癌基因的miRNA采用特异性敲除来抑制肿瘤生长,对于那些作为抑癌基因的miRNA采用人为引入的方法来针对肿瘤进行治疗,或者将来若使用合成的反义核苷酸与作为癌基因的miRNA互补,如抗miRNA的寡核苷酸,可靶向性抑制miRNA的功能,减慢肿瘤生长。这种更稳定及低毒性的特点很有可能在肿瘤的基因治疗中发挥巨大作用。因此,miRNA有望成为一些肿瘤早期诊断、恶性分级的重要指标[12]。

摘要：目的采用实时荧光定量RT-PCR分析miR-126在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达水平,探讨miR-126在乳腺癌疾病中的临床诊断意义。方法运用ABI-7900HT实时荧光定量仪对20例己由病理确诊的乳腺癌组织及癌旁正常组织的miR-126进行了定量分析。结果采用配对t检验的统计学方法将乳腺癌与正常组织表达量相比较,发现了miR-126在所有被检测的乳腺癌组织中有不同程度的表达水平下调,且结果有显著差异(P<0.0001)。结论乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中存在上述miR-126表达水平的改变,实时荧光定量RT-PCR方法检测miRNA-126水平在乳腺癌早期诊断和治疗方面提供了新的思路并具有广阔的应用前景。

关键词：miR-126,乳腺癌,早期诊断,相关性,LNA,实时荧光定量RT-PCR

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8.实时荧光定量PCR技术综述篇八

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

本研究中PCR扩增仪的型号是LightCycler480；而梯度PCR仪的型号则为ABIVeriti；选取安徽达安基因公司生产的HBV-DNA试剂，产品批号为2010005；选用日立760全自动化的生化仪和紫外可见光度计[3]。选用浙江利康生物科技公司生产的三酰甘油(TG)生化试剂，该产品的批号为20100105。

1.2 标本的采集方法

1.2.1 乳糜状的脂血因素相关标本

从2012年8月-2014年8月来笔者所在医院体检的健康人员中选取30例正常血脂并且无溶血的HBV-DNA血标本，每例均采集3 ml血液。依据标本中的HBV-DNA的浓度把30例血标本共划分成两个水平：(1)中高HBV-DNA浓度(即HBV-DNA在1.0×105 copies/ml以上)，标本共15例，将其设定成Ⅰ水平；(2)HBV-DNA临界浓度(即HBV-DNA为1.0×103～1.0×104 copies/ml)，标本共15例，并将其设定成Ⅱ水平。然后收集乙肝表面抗体呈现阳性或两对半全阴性并且肝功能正常且无溶血的重度的乳糜状脂血标本以及正常的血清标本，均为5例，每例采集3 ml血液，将血清及时地进行分离，然后在-20℃的条件下进行保存。

1.2.2溶血因素相关标本

收集30例乙肝患者的无脂血或黄疸血的标本，每例采集3管，每管需3 ml，然后把其中的两管在-20℃的冷冻条件下进行保存，由于不同的冷冻时间可得到不同程度的溶血，因此可将其留做平行实验[4,5,6]。

1.3 方法

1.3.1 设计实验步骤及方法

采集不同血脂浓度和溶血程度的标本，然后分析溶血和脂血两种因素对由PCR扩增仪所测定的两个水平的HBV-DNA的检测结果的影响。

1.3.2 制作标本的方法

1.3.2. 1 制作两种水平HBV-DNA且TG浓度不同的标本的方法

(1)根据HBV-DNA浓度把所收集的标本可划分成两个水平：(1)中高HBV-DNA浓度(即HBV-DNA在1.0×105 copies/ml以上)，标本共15例，将其设定成Ⅰ水平；(2)HBV-DNA临界浓度(即HBV-DNA为1.0×103～1.0×104 copies/ml)，标本共15例，并将其设定成Ⅱ水平；(2)在结合本实验具体情况的基础上，依据我国胆固醇治疗专家小组所规定的血脂标准而制作出3种TG浓度的标本：(1)A组，也即极高TG浓度的脂血，TG在5.63 mmol/L以上；(2)B组：也即高TG浓度，TG为2.24～5.65 mmol/L;(3)C组：正常的血脂浓度的标本；(3)混匀所收集的重度的乳糜状的脂血标本后进行TG的相关检测，TG为13.88 mmol/L;(4)Ⅰ/Ⅱ水平HBV-DNA的TG浓度不同的标本采集及制作方法，AⅠ/AⅡ组：重度的乳糜状的标本∶正常的血清∶Ⅰ/Ⅱ水平HBV-DNA=0∶1∶0/0∶1∶1；而BⅠ/BⅡ组：重度的乳糜状的标本∶正常血清：Ⅰ/Ⅱ水平HBV-DNA=0∶0.5∶0.5/1∶0.5∶0；而CⅠ/CⅡ组：重度的乳糜状的标本∶正常血清∶Ⅰ/Ⅱ水平HBV-DNA=1∶0∶1/1∶0∶1[7,8,9,10]。

1.3.2. 2 两种水平HBV-DNA而脂血浓度不同的血液标本的采集及制作方法

在-20℃的条件下行冷冻，冷冻的时间不同则可得到溶血程度不同的标本，借助于分光光度计氰化高铁血红蛋白法对血红蛋白的浓度进行测定，并把溶血标本可划分成三组：(1)D组：也即重度溶血组，其血红蛋白在5.0 g/L以上；(2)E组：也即轻中度溶血组，血红蛋白为0.9～5.0 g/L;(3)F组：也即无溶血组。Ⅰ/Ⅱ水平HBV-DNA的三种溶血标本(DⅠ组、EⅠ组、FⅠ组)/(DⅡ组、EⅡ组、FⅡ组)[11]。

1.3.3 提取以及检测HBV-DNA的方法

HBV-DNA的提取和检测均严格按照达安基因公司的试剂盒的具体说明书进行，而标本和室内的质控标本需同时进行检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18 0软件对所得数据进行统计分析，使用对数对三组血液标本的PCR结果进行数据的分析与转换，而所得的结果和正态分布相符合，计量资料用均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的TG对实时荧光定量PCR检测HBV-DNA的结果的影响

不同浓度的TG对实时荧光定量PCR临床检测HBV-DNA的结果均不存在明显影响，差异无统计学意义(P>0.05)，如表1所示。

U/ml

2.2 不同程度的溶血对实时荧光定量PCR检测HBV-DNA的结果的影响

在Ⅰ水平HBV-DNA和Ⅱ水平HBV-DNA中，不同程度的溶血对PCR检测的扩增结果无明显的影响，差异无统计学意义(P>0.05)，如表2所示。

3 讨论

PCR检测技术的灵敏度和特异性均较为显著，因此，在临床诊治各种疾病中，该技术得到了广泛的应用[5]。但是，基于临床标本的多种多样，荧光定量PCR的临床检测结果也可发生假阴性的情况。相关的临床研究结果指出，溶血标本中含有的血红素以及代谢产物均可对DNA聚合酶活性产生抑制作用，会降低检测结果的准确性。