细胞的衰老和凋亡-教案

细胞的衰老和凋亡-教案（共13篇）（共13篇）

1.细胞的衰老和凋亡-教案 篇一

教学准备

教学目标

1.描述细胞衰老的特征。

2.简述细胞凋亡与细胞坏死的区别。

3.探讨细胞的衰老和凋亡与人体健康的关系。

教学重难点

1.教学重点

(1)个体衰老与细胞衰老的关系,细胞衰老的特征。

(2)细胞凋亡的含义。

2.教学难点

细胞凋亡的含义以及与细胞坏死的区别。

教学过程

导课

观看图片和视频,感受个体衰老过程。

一、细胞的衰老

1、讨论细胞衰老与个体衰老的关系。

单细胞生物 个体衰老=细胞衰老

多细胞生物 个体衰老=细胞的普遍衰老

2、通过实例归纳细胞衰老的特征。

1.形态变化:细胞萎缩、体积变小。

2.成分变化:水分减少、色素积累。

3.结构变化:

(1)细胞膜:通透性改变。

(2)细胞核:体积增大,核膜内折,染色质收缩, 染色加深。

4.功能变化:细胞内多种酶的活性降低,细胞新 陈代谢的速率减慢,呼吸速率减 慢,物质运输功能降低。

二、细胞衰老的原因

1.自由基学说:

异常活泼的带电分子或基团,称为自由基。

2.端粒学说:

随着细胞分裂次数的增加,端粒DNA序列载短,端粒内侧正常的基因DNA序列受到损伤,使细胞活性渐趋异常。

三、细胞的调亡

学生观看图片及视频,阅读课本。

1、定义:是一种自然的生理过程,由基因决定的细胞自动结束生命的过程,就叫细胞凋亡。

2、原因:细胞凋亡受严格的遗传机制的程序性控制

3、细胞凋亡的类型:个体发育中细胞的编程性死亡、保证多细胞生物体正常发育、成熟个体中细胞的自然更新。

4、细胞凋亡的意义:维持内部环境稳定、被病原体感染的细胞的清除、抵御外界干扰。

四、细胞凋亡与细胞坏死

1、细胞凋亡:

是由基因决定的细胞自动结束生命的过程。(细胞生理性死亡)

2、细胞坏死:

指在种.种不利因素影响下,由于细胞的正常代谢活动受损或中断引起的细胞的损伤和死亡。(细胞病理性死亡)

课后习题

检测

1、老年人有老年斑,对此最合理的解释是( D )

A、细胞内水分减少,细胞萎缩;

B、细胞核体积增大,染色体固缩,染色加深;

C、细胞中的酪氨酸酶活性降低;

D、细胞内脂褐素占有的面积增大。

2、下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中,错误的是( D )

A、细胞凋亡是一种自然的生理过程;

B、细胞坏死是一种病理性变化;

C、蝌蚪尾的消失,是有基因决定的细胞自动结束生命的过程;

D、被病原体感染的细胞,因为细胞坏死而被清除。

2.细胞的衰老和凋亡-教案 篇二

1 材料与方法

1.1细胞株来源与主要仪器和材料CHL由中科院上海细胞生物学研究所提供,RPMI 21640培养粉 (美国Gibco公司),总RNA提取试剂盒(北京普利莱基因有限公司),AMV第1条链c DNA合成试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司),CO2电热恒温培养箱 (德国Heraeus公司),FACS420流式细胞仪(美国B&D公司)。

1.2 CTP溶液的配制 称取250 mg CTP粉, 溶解在50 ml二甲亚砜(DMSO)中,常规高压灭菌,使用时运用培养液稀释到相应浓度。

1.3 c-jun和fos m RNA表达检测将细胞接种于6孔板,待细胞融合度达到70%~80%时,给细胞换液,加入CTP浓度为20和40 mg/L的培养液,每个剂量组设2个复孔,同时设空白对照组。继续培养24和72 h后分别提取细胞的总RNA;取1~5μg总RNA,建立逆转录反应体系,将m RNA逆转录为c DNA(操作程序参考说明书)。

取逆转录产物1μl建立PCR反应体系,同时扩增fos、c-jun、EGFR和内参β-actin的基因片段。对PCR产物行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin基因为内参检测c-jun和fos m RNA的相对表达水平。用于目的基因扩增的引物序列如下:c-jun:5′-ATGACT GCAAAGATGGAAACGACC-3′和5′ -TGATGTGCCCAT TGCTGGACTG-3′(265bp);fos :5′ -TAGTGCCAACTTT ATCCCCACGG TG-3′和5′ -CAGGAGATAGCTGCTCTA CTTTGC-3′(236bp);β-actin:5′ -TGACCCTGAAGTAAG TACCCCATTGAAC-3′和5’-ATGTCACGCACGATTTCC CTCT CA-3′(442 bp)。相对表达水平=目的基因条带亮度/ β-actin条带亮度,每个样品重复检测3次。

1.4细胞周期和细胞凋亡率检测常规消化细胞并调整细胞,将适当数量的细胞接种于培养瓶中,待细胞贴壁大约24 h后分别加入含CTP浓度为0、20和40 mg/L的培养液,每个剂量组设6个重复样品,分别加入抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC), 调整抗氧化剂的浓度为0、20和40 mg/L,CTP浓度保持不变,48 h换液1次;连续作用120 h后,常规收集细胞,用4℃预冷的70%的乙醇固定细胞,4℃存放备用。检测前先采用PBS洗涤2次,收集细胞沉啶,加入碘化丙啶,孵育3 h后上机检测细胞凋亡率和细胞周期的构成比。

1.5统计学分析采用SPSS 10.0进行数据分析。2组均数的比较采用独立样本t检验,多组均数的比较采用单因素方差分析。采用卡方检验对2组和多组之间的率和构成比进行比较。以α=0.05作为统计学的显著性水准。

2 结 果

2.1 CTP对c-jun、fos和EGFR m RNA表达的影响20和40 mg/L CTP作用24 h后,fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。40 mg/L CTP作用72 h后,fos m RNA表达水平显著增加(P<0.01);在20和40 mg/L CTP作用72 h后,c-jun和EGFRm RNA的表达水平显著增加(P<0.01)。见表1~3。

注:CTP—煤焦沥青。

注:CTP—煤焦沥青。

注:CTP—煤焦沥青;EGFR—表皮生长因子受体。

2.2 CTP及其与GSH和NAC相互作用对CHL细胞凋亡和细胞周期的影响CTP对细胞周期和细胞凋亡的影响见表4和表5。从表4可以看出,在无GSH或NAC作用下,20 mg/L煤焦沥青组的S期细胞构成显著高于0 mg/L组(P=0.037)。在NAC作用下,煤焦沥青20 mg/L组S期细胞的 构成比为13.7% ,显著低于0 mg/L组(P <0.05)。在20 mg/L煤焦沥青组,2.5和10 mmol/L GSH作用下的S期细胞的 构成分别 为20.3%和19.7%,显著低于0 mmol/L组(P<0.05);2.5和10 mmol/L NAC作用下的S期细胞的 构成分别 为17.1%和13.7%,显著低于0 mmol/L组(P<0.05)。在40 mg/L煤焦沥青组,2.5 mmol/L NAC作用下的S期细胞的构成显著低于0 mmol/L组(P<0.05)。

从表5可以看出,20和40 mg/L作用后,细胞凋亡受到抑制,但在CTP作用组,GSH和NAC对其抑制作用具有一定的拮抗效应,细胞的凋亡率增加,尤其是NAC的抑制效应更为明显。

的影响(n=100)

注 :CTP—煤焦沥青;GSH—谷胱甘肽;NAC—N-乙酰半胱氨酸。 CHL—中国仓鼠肺细胞;a与 0 mg/L 煤焦沥青组相比,P <0.05;b与 0 mmol/L GSH 或 NAC 组相比,P <0.05 。每个样本进行 3 次实验。

注 : CTP—煤焦沥青;GSH—谷胱甘肽;NAC—N-乙酰半胱氨酸; CHL—中国仓鼠肺细胞。

3 讨 论

CTP是一种混合物,其中所含有的苯并(a)芘是重要的致癌物,在职业环境下所导致的肺癌是我国的法定职业病,但该化合物对细胞增殖和恶性转化的机制尚不明确。本研究旨在揭示CTP对肺细胞相关癌基因表达和细胞周期和凋亡的影响,以抗氧化剂GSH和自由基清除剂NAC对煤焦沥青作用的影响。研究发现, CTP可以诱导fos、c-jun和EGFR m RNA的表达,同时抑制细胞的凋亡和周期发生改变,GSH和NAC对这种效应具有拮抗作用。

AP-1是参与基因转录活化的转录蛋白,其中fos和c-jun是构成该蛋白的重要成分,其表达水平增加可以促进基因的转录和蛋白表达的增加,通过检测该基因的表达水平可以了解基因转录活化的情况和细胞增殖的变化。本研究也发现,在CTP作用下,fos和c-jun的转录水平均显著增加,进而促进细胞的增殖。EGFR是参与细胞异常增殖的信号通路受体之一,该基因的异常表达可以促进细胞信号通路的活化,促进细胞细胞增殖的活性。本研究发现,在20和40 mg/L CTP作用24和72 h后,EGFR m RNA的表达水平显著增加。

研究表明,CTP可以诱导细胞内的脂质过氧化和自由基(ROS)水平增加[5],而自由基则可以细胞转导信号的活化,抑制细胞凋亡的发生,同时促进细胞的增殖活化,GSH和NAC作为常见的抗氧化剂和自由基清除剂,可以有效拮抗CTP的凋亡抑制效应,提高细胞的凋亡率。

细胞周期变化是细胞增殖活性变化的重要特征之一,其中S期是细胞基因组DNA合成的重要时期,S期细胞构成比的增加提示处于增殖状态的细胞比例增加。本研究发现,在20 mg/L CTP作用下,处于S期的细胞构成显著增加。而在GSH和NAC干预下,S期的细胞构成显著降低;尤其是在NAC作用下,S期细胞的构成比下降更为明显。提示GSH和NAC可以消除CTP的诱导效应,提示氧化水平和ROS水平增加,是细胞异常增殖的分子机制之一。

细胞的凋亡是清除损伤和突变细胞的重要机制之一。本研究发现,在CTP作用下,细胞凋亡率出现下降。而在GSH和NAC的作用下,CTP对细胞凋亡的诱导效应受到抑制,细胞凋亡率上升。尤其是在NAC作用下, 其细胞凋亡的抑制效应更为显著,由此可以看出该抑制效应与ROS诱导的细胞凋亡有关[6]。本研究发现,在40 mg/L CTP作用下,处于S期的细胞构成却无显著变化,提示该剂量的CTP存在明显的细胞毒性,从而抑制了细胞的增殖活性。同时可以看出,不同暴露剂量的CTP产生不同的效应,低剂量下产生细胞增殖的诱导效应,但剂量较大时则产生细胞毒性,对细胞活性产生抑制效应,使细胞内的分子调控机制也受到抑制。

本研究结果提示,在GSH和NAC作用下,细胞的凋亡率出现上调,其中的机制与化学物的刺激和诱导作用有关,但具体的分子机制有待通过进一步的研究进行探讨。由此本研究得出以下结论:CTP可以诱导CHL细胞的c-jun、fos和EGFR m RNA表达上调,可能是其诱导细胞增殖的因素之一;CTP在适当浓度下具有抑制凋亡的作用,而具有抗氧化作用的GSH和清除自由基作用的NAC可以抑制促进细胞的凋亡效应。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 探讨煤焦沥青对中国仓鼠肺(CHL)细胞c-jun、fos和表皮生长因子受体(EGFR)m RNA表达和细胞周期和凋亡的影响。方法 常规培养CHL细胞,常规消化细胞后,将细胞接种于6孔板中,待其融合度达到40%左右时,加入含有煤焦沥青的培养液,调整浓度至0、20、40 mg/L,分别于作用24、72 h后提取细胞总RNA,采用半定量RT-PCR技术检测c-jun、fos和EGFR m RNA的表达水平;将等量的细胞接种在50 ml的培养瓶中,待细胞融合度达到40%左右时,加入含煤焦沥青的培养液,调整浓度为0、20、40 mg/L,每组设置6个重复样品,分别加入谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC),调整浓度至0、2.5、10 mmol/L,作用120 h后收集细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和S期细胞的构成比。结果 在20 mg/L煤焦沥青作用24 h后,CHL细胞的fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平均高于0 mg/L剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05);作用72 h后c-jun和EGFR的表达水平显著高于0 mg/L剂量组(P<0.05)。在40 mg/L剂量组作用24和72 h后,fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平均高于0 mg/L剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。煤焦沥青作用后,细胞凋亡率降低,在GSH作用下,凋亡率有所增加,NAC作用下的凋亡率增加的幅度更加明显,但以上差异均无统计学意义(P>0.05);20 mg/L的煤焦沥青作用120 h后,S期的细胞构成显著增加(P<0.05);GSH和NAC可以显著抑制S期的细胞构成改变,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 煤焦沥青可以诱导fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平和S细胞周期的构成增加、抑制细胞凋亡率,而GSH和NAC可以抑制这种诱导效应。

3.浙科版细胞的衰老与凋亡教案设计 篇三

【教学内容分析 】 “细胞的衰老和凋亡”是浙科版必修1第4章第3节的内容。本节介绍了细胞衰老与人体衰老的关系、细胞衰老的特征和原因、细胞凋亡的概念和意义等内容，细胞的衰老和凋亡是正常的生命现象，与人的衰老和寿命有关，为我们认识生命过程奠定了基础，它与前面所学的细胞增殖及后面所学的细胞癌变等内容有密切联系，在教材中占有重要的地位。

【教学目标】

知识目标：通过人外部形态的观察，让学生们描述细胞衰老的特征；

区别细胞衰老与个体衰老的关系；

掌握细胞凋亡的意义；

掌握细胞凋亡与坏死的区别。

能力目标：学生针对具体问题开展讨论，提出质疑，培养合作、交流、讨论解决问题的能力；

通过对所展示实例的提问，培养学生提取有用信息的能力及语言表达能力。

情感目标；体验自然科学的价值；增强学生学习生物学的兴趣和珍爱生命的情感。【重点难点】

重点：了解个体衰老与细胞衰老的关系；

了解细胞衰老的特征;

细胞凋亡的概念理解。

难点：理解细胞衰老和凋亡是细胞生长中的正常现象；

细胞衰老和细胞坏死的区别。【教学用具】课件 【教学设计】一课时 【教学过程】

导入

每个生物个体都要经历出生、生长、成熟、繁殖、衰老直至最后的死亡，生物体内的细胞也是一样，要经过增殖、分化、衰老和凋亡。前面我们已经学习了细胞的增殖和细胞的分化，今天我们就来学习第三节，细胞的衰老和凋亡。

问题一：婴儿体内有没有衰老细胞？为什么老人表现出衰老，但是婴儿却没有表现出衰老？

答案：有。老人体内的衰老细胞非常多，而婴儿体内很少。

总结：个体衰老是组成个体细胞的普遍衰老。但是对于单细胞生物来讲，单个细胞的衰老就会导致整个个体的衰老。

问题二：现在请同学们想一下，在45十以后，我们来参加同学聚会，你的同学会有变化吗？大家现在就来想一下我们老了之后会变成什么样？ 答案：（1）那时候，我们的头发都会变白，这主要是由于人体内酶的活性降低。黑色素是酪氨酸酶催化酪氨酸造成的，酶的活性降低，黑色素不能形成。

（2）那时候，我们脸上可能已经出现了老年斑。这主要是由于色素的积累。

（3）大家有没有发现老年人特别怕冷。在冬天的时候，我们年轻人只穿了2-3件衣服，但是老年人却要穿4-5件衣服。主要是由于人体的能量主要是由于呼吸作用提供的，呼吸作用减弱了，人体得到的热能就少了。而人体的呼吸作用主要是在线粒体内进行的，所以衰老的细胞线粒体的数量也是减少的。

（4）大家有没有注意到老年人的皮肤皱巴巴的，这主要是由于什么原因呢？

这主要是由于老年人体内的水分减少的原因。而体内许多化学反应都要在水中进行，所以水分的减少，必然导致人体的新陈代谢的减慢。

（5）有的老人还会出现“救生圈”，这也主要是由于老年人新陈代谢减慢的引起的。在吃进相同的食物后，他们消耗能量的能力下降了，自然就化成脂肪堆积了。总结：个体衰老是由于细胞的衰老引起的，现在就让我们来总结一下细胞衰老的特点：（1）水分减少，体积变小，新陈代谢速度减慢。（2）细胞内酶的活性降低。

（3）细胞的呼吸速度减慢，细胞核体积增大，线粒体数量减少，体积增大。（4）色素会积累。

（5）细胞的通透性有所改变，使物质的运输功能下降。问题三：大家能不能举出这方面的一些离子？

答案：比如，老年人的肠胃功能会下降，吃进去的东西一般都不容易吸收。胰岛细胞的衰老，就会导致胰腺功能下降，导致糖尿病。

引入：细胞在衰老之后就要死亡，接下来我们就来学一下细胞的死亡。就像人一样，细胞也分老死和死于非命两种。一种就是细胞凋亡，也称编程性细胞死亡，还有一种就是细胞坏死。

细胞凋亡：由基因决定的细胞的正常代谢活动受损引起的细胞死亡。

细胞坏死：在不利因素下，由于细胞的正常的代谢活动受损引起的细胞死亡。

细胞凋亡——自寻短见（自杀）

细胞坏死——死于非命（他杀）

问题九：假如我不小心被开水烫伤，细胞死了。这些细胞是死于是属于细胞凋亡还是细胞坏死？

答案：细胞坏死。

问题十：大家想一下，如果细胞没有死亡，人体会有什么异常？

答案：如果该死的细胞没有死亡，就会导致细胞的恶性增殖，导致癌症。所以说，细胞凋亡对于多细胞生物完成正常发育，维持体内环境，抵御外界各种因素干扰有着非常重要的作用。但是对于单细胞生物来讲，细胞的凋亡，就会导致个体的死亡。

例子：人体胚胎发育早期要经历有尾的阶段，后来尾部的细胞死亡，尾才消失。

人体在胚胎发育早期五个手指是愈合在一起的，后来随着之间细胞的死亡，五个手指才分开。

人体胚胎发育的过程中会产生过量的神经细胞，所以要调节神经细胞数量，使之与受神经细胞支配的细胞数量相适应，以保证神经系统对生命活动的精确调节。总结：这节课我们主要学习了： 个体衰老与细胞衰老的关系； 细胞衰老的特征；

细胞凋亡与坏死的概念和区别。巩固练习

()1.细胞衰老是一种正常的生命现象。人的细胞在衰老过程中不会出现的变化是 ．． A.细胞内有些酶的活性下降 B.细胞内色素减少 C.心细胞内水分减少 D.细胞内呼吸速度减慢（）2.人体内衰老的红细胞具有下列哪些特征 ①水分减少，细胞萎缩 ②新陈代谢的速度减慢 ③某些酶的活性降低 ④呼吸速率上升 ⑤色素积累增多 ⑥细胞的呼吸速度减慢 ⑦细胞核体积增大 ⑧细胞膜的通透性功能改变 A.①②③④⑤⑦⑧ B.①②③⑤⑥⑦⑧ C.①②③⑤⑥⑧ D.①②③④⑤⑧（）3.下列说法不正确的是

A.细胞的凋亡会导致个体的死亡 B.正常细胞编程性死亡对生物体是有益的 C.人体每天都有衰老和凋亡的细胞 D.每一个细胞都要经历过新生、衰老和凋亡过程（）4.关于细胞衰老和凋亡的说法，不正确的是 A.细胞凋亡受到严格的遗传调控

B.老年人术后伤口愈合慢就是由于细胞衰老造成的 C.个体衰老的过程实际上就是组成个体细胞普遍衰老的过程 D.细胞的衰老和凋亡就是个体的衰老和凋亡（）5.关于细胞凋亡的说法，不正确的是

A.细胞凋亡就是细胞坏死

B.细胞凋亡发生在多细胞生物生命历程的各个时期 C.红细胞的正常死亡过程就是细胞凋亡

D.细胞凋亡对于多细胞生物体完成正常发育，维持内部环境的稳定，以及抵御外界各种因素的干扰起着非常关键的作用

【板书设计】

细胞的衰老和凋亡 一．细胞的寿命

二．细胞衰老的特征：

（1）水分↓，体积↓，新陈代谢速度↓。（2）细胞内酶的活性↓。

（3）细胞的呼吸速度↓，细胞核体积↓，线粒体数量减少，体积↓。（4）色素↓↑。

4.细胞衰老与凋亡说课稿 篇四

尊敬的各位老师、同学们：

大家好！我说课的题目是《细胞的衰老与凋亡》，首先我对本节内容进行分析。

一、说教材

《细胞的衰老和凋亡》是教材高一生物必修本第6章第3节内容。在此之前，学生们已经在第一节和第二节的学习中学习了细胞的增殖和分化，细胞的分裂、分化、衰老、死亡是生命的必然。因此，细胞的衰老和凋亡是生命活动中必不可少的过程。对于细胞衰老和凋亡的学习，能使学生对细胞的整个生命过程有个完整的认识。同时细胞衰亡机制的研究与生物科技的发展息息相关。对细胞衰亡知识的学习，有助于培养学生的科学兴趣，培养学生的创新意识。而细胞的衰老与凋亡是细胞必须经过的阶段，因此，本节内容在细胞的生命历程中具有不容忽视的重要地位。

根据本教材的结构和内容分析，结合着高一年级学生他们的认知结构及其心理特征，我制定了以下7个教学目标： 知识目标：

1.描述细胞衰老的特征；

2.简述细胞凋亡与细胞坏死的区别；

3.分析细胞衰老的原因，认识细胞的衰老、凋亡与人类健康的关系。能力目标

1.进行与社会老龄化相关问题的资料搜集与分析；

2.通过学习细胞衰老和凋亡知识，培养自学能力、分析理解能力、理论联系实际能力。情感目标

1.探讨细胞的衰老与凋亡与人体健康的关系，关注老年人的健康状况； 2.通过有关细胞衰老的问题的讨论，树立科学发展观。

综合考虑本节内容在整个细胞生命历程知识体系中的地位和作用，以及高一学生的认知水平，我确定了以下的教学重点和难点： 教学重点：个体衰老与细胞衰老的关系和细胞衰老的特征

重点的依据：衰老是生物界的普遍现象，只有掌握了细胞衰老的特点，才能进一步掌握细胞衰老与个体衰老的区别，并且可以在本节课的讨论中，联系到个体衰老的特征。

教学难点：细胞凋亡与细胞坏死的区别

难点的依据：在掌握细胞凋亡的概念后，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别，从而肯定细胞凋亡的生物学意义，可通过观看图片，认识个体生长过程中的细胞凋亡。

二、说教法

我们都知道生物是一门培养人的实践能力的重要学科。因此，在教学过程中，不仅要使学生“知其然”，还要使学生“知其所以然”。我们在以师生既为主体，又为客体的原则下，展现获取理论知识、解决实际问题方法的思维过程。

考虑到高一年级学生的现状，我主要采取学生活动的教学方法，让学生真正的参与活动，而且在活动中得到认识和体验，产生践行的愿望。培养学生将课堂教学和自己的行动结合起来，充分引导学生全面的看待发生在身边的现象，发展思辨能力，注重学生的心理状况，当然，教师自身也是非常重要的教学资源。教师本人应该通过课堂教学感染和激励学生，充分调动起学生参与活动的积极性，激发学生对解决实际问题的渴望，并且要培养学生以理论联系实际的能力，从而达到最佳的教学效果。同时也体现了课改的精神。

基于本节课内容的特点，我主要采用了以下的教学方法： ①直观演示法：

利用图片的投影等手段进行直观演示，比如在讲到细胞衰老的特征时，可用图片进行比较，以此来激发学生的学习兴趣，活跃课堂气氛，促进学生对知识的掌握。

②活动探究法

引导学生通过创设情境等活动形式获取知识，以学生为主体，使学生的独立探索性得到充分的发挥，培养学生的自学能力、思维能力、活动组织能力。比如在第一部分讲到个体衰老时，可让学生运用自己的经验来说说老人身上与我们相比有哪些不同，培养学生的总结组织能力等； ③集体讨论法

针对课堂上提出的问题，组织学生进行集体和分组讨论，促使学生在学习中解决问题，培养学生解决问题的能力以及团结协作的精神。比如在比较细胞凋亡与坏死是区别时可以让学生先进行小组讨论，再进行总结，而不是单一地接受教师传授的观点。

三、说学法

我们常说：“现代的文盲不是不懂字的人，而是没有掌握学习方法的人”，因而，我在教学过程中特别重视学法的指导。让学生从机械的“学答”向“学问”转变，从“学会”向“会学”转变，成为真正的学习主人。在本课的学习中，教师指导学生在自主学习的基础上，通过小组讨论，分析比较，归纳对比等方法完成学习任务，在学习过程中，教师可以将学生分为若干学习小组，让成员间协作学习，进行讨论，从而创设一个自主的良好的学习氛围，让每个学生积极参与其中，认真思索，充分体现主体作用。

四、说教学程序

由于细胞的衰老和凋亡与人的衰老和寿命有关，学生易感兴趣。可从人体衰老的特征入手，引出细胞衰老的特征，借助多媒体辅助教学，化抽象为具体，在此基础上对比个体衰老与细胞衰老的区别，并讨论如何延缓衰老，延长寿命，倡导健康的生活方式。因此本节课主要围绕细胞衰老与细胞凋亡的特征及与机体的关系展开，分4个环节来设计教学程序

（一）导入新课（5min）

展示图片：受精卵、胚胎、婴儿、少年、青年、成年、老年，让学生总结出人的生长发育过程，得出衰老是生命进程中的一个自然的必经的过程，向学生提问“人体的衰老都表现出哪些特征？”学生思考后回答问题，达到活跃课堂气氛，发散思维的效果，总结学生的发言。通过对人体衰老的认识，引出细胞衰老，向学生提出问题“细胞是否也会衰老”，导入本节课的内容，进入第二环节。

（二）学习新课（30min）

首先让学生阅读课本回答前面提出的问题，教师总结细胞与机体一样也会经历衰老死亡。通过描述人体衰老的特征，讨论如何延缓衰老，延长寿命，引出个体衰老与 细胞衰老的关系。个体衰老与细胞衰老有关，但二者又不能划等号。a.单细胞生物体：细胞的衰老或死亡就是个体的衰老或死亡；

b.多细胞生物个体总是在不断更新着，总有一部分细胞处于衰老或走向死亡状态。但从总体上看，个体衰老的过程也是组成个体的细胞普遍衰老的过程。

可围绕这一问题创设问题情境，让学生展开课堂短时讨论，并为讲述细胞衰老的特征做铺垫。

接下来介绍细胞衰老特征，其中可通过图片比较来总结细胞衰老的特征。细胞衰老的原因一直是研究的热点和难点，至今有多种学说，学生接受起来有一定的难度。但同时这个问题与现实生活联系紧密，学生易感兴趣。这方面教科书处理为选学内容，可适当介绍给学生。

最后从生物的寿命引入，探讨细胞的死亡。强调细胞死亡有两种形式：a.细胞坏死，它是由某些外界因素造成细胞急速死亡，是一种被动性死亡；b.细胞凋亡，这是一种由特定基因控制的主动性死亡。细胞坏死与细胞凋亡在形态学和生物化学上有着明显区别。细胞凋亡有广泛的生物学意义，比如胚胎发育期手的发育如果没有细胞的凋亡就不会有纤细的手指；如果没有正常的细胞凋亡，蝌蚪的尾部就不会消失，它将永远不能变成青蛙。正常的细胞凋亡还肩负着维持各种组织器官固有体积和形态功能，还会使机体内异常的细胞得到及时消除，去除潜在的隐患，例如癌症就是异常的细胞没有及时死亡的结果。因此，细胞的正常死亡是生物体是一种非常重要的调节机制，是机体平衡细胞增殖，调节机体细胞树目恒定的方式，是必不可少的生命过程。

（三）课堂小结（5min）

可以把课堂传授的知识尽快地转化为学生的素质；简单扼要的课堂小结，可使学生更深刻地理解政治理论在实际生活中的应用，并且逐渐培养学生具有良好的个性。以提问的方式，引导学生将本节课所讲的重点难点进行总结整理，明确其中的重要概念，带领学生再次温习一遍主要脉络，巩固知识结构，查漏补缺。

（四）布置课后作业（5min）

对学生进行关爱他人、关注社会问题的情感教育，并引导学生课后进行书本中的关于社会老龄化相关问题的资料搜集和分析，要求以小组为单位书写一份社会老龄化的相关问题的活动报告。

[板书设计]

第3节

细胞的衰老和凋亡

一、个体的衰老与细胞衰老的关系

单细胞生物：细胞衰老＝个体衰老

多细胞生物：细胞衰老≠个体衰老，细胞时刻在更新

二、细胞衰老的特征

三、细胞衰老的原因及预防措施

四、细胞凋亡以及与细胞坏死的区别

五、说教学成果分析

各位领导、老师们，本节课根据高一级学生的心理特征及其认知规律，采用直观教学和活动探究的教学方法，以“教师为主导，学生为主体”，教师的“导”立足于学生的“学”，以学法为重心，放手让学生自主探索的学习，主动参与到知识形成的整个思维过程，充分调动学生的学习兴趣，发挥学生的能动性，力求使学生在积极、愉快的课堂氛围中提高自己的认识水平，从而达到预期的教学效果。本节课的教学，在确定目标和教学实施等过程中，教师不仅备了“知识点”，而且深入挖掘了其中的“情感生长点”和“能力培养点”。以“细胞衰老与个体衰老的关系—细胞衰老的特征—细胞凋亡和坏死”为知识教学的主线，通过课前的资料收集和课中的资料分析，在传授知识的同时突出培养了学生利用资料探究问题的能力，在这一过程中将“关注老龄化问题、关爱老人”等情感教育主题有机地、自然地融入教学，使教学目标在三个维度上都得到了很好的达成。

这节课的具体教学方式呈现多样化，有PPT演示、讲授和资料搜集和分析等，在联系学生生活经验和以往所学知识解决问题的过程中，体现了民主和谐的师生关系和求真求实的氛围，通过学生的自学教材、阅读资料、相互讨论与交流等环节充分突出了学生学习的自主性。

5.细胞的衰老和凋亡-教案 篇五

为了研究转录因子Foxo3a高表达对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞周期和凋亡的影响,采用电穿孔法将真核表达载体pEGFP-N1/Foxo3a转染小鼠T淋巴瘤细胞系EL-4细胞,并通过聚合酶链式反应和免疫印迹法分别检测Foxo3a mRNA及蛋白表达.转录因子Foxo3a高表达后,采用细胞计数法绘制其细胞生长曲线;采用荧光显微镜法及流式细胞仪定性和定量观察典型EL-4细胞凋亡形态特征、细胞凋亡百分率及细胞周期变化情况.结果表明,转录因子Foxo3a真核表达质粒pEGFP-N1/Foxo3a经酶切鉴定及测序检测序列正确.转染pEGFP-N1/Foxo3a的小鼠EL-4细胞表达Foxo3a mRNA和蛋白水平显著升高.Foxo3a高表达明显抑制EL-4细胞的.增殖能力,并使EL-4细胞发生明显G2期阻滞(P<0.001).Foxo3a基因高表达后,荧光显微镜可以观察到典型凋亡的细胞形态.同时,EL-4细胞凋亡百分率显著升高(P<0.01).结果提示,Foxo3a高表达可以有效抑制小鼠T淋巴瘤细胞体外细胞增殖,使细胞周期G2时相阻滞,并具有诱导细胞凋亡的作用.

作 者：马晓杰 刘光伟 王娜 崔F 李景鹏 赵勇 MA Xiao-Jie LIU Guang-Wei WANG Na CUI Min LI Jing-Peng ZHAO Yong 作者单位：马晓杰,MA Xiao-Jie(中国科学院动物研究所 生物膜与膜生物工程国家重点实验室移植生物学研究组 北京 100080;东北农业大学生命科学中心基因部 哈尔滨 150080)

刘光伟,王娜,崔F,赵勇,LIU Guang-Wei,WANG Na,CUI Min,ZHAO Yong(中国科学院动物研究所 生物膜与膜生物工程国家重点实验室移植生物学研究组 北京 100080)

李景鹏,LI Jing-Peng(东北农业大学生命科学中心基因部 哈尔滨 150080)

6.细胞的衰老和凋亡-教案 篇六

1 材料与方法

1.1 实验动物

100 g左右4周龄雌性F344大鼠18只[购自北京维通利华实验动物中心, 许可证号SCXK (京) 2012-0001]。随机分为三组, 正常对照组、D-半乳糖诱导衰老组和雌激素诱导垂体瘤组, 每组各6只。本研究经牡丹江医学院动物伦理委员会批准, 严格按照NIH实验动物伦理原则进行操作。

1.2 主要试剂及设备

≥98%的β-雌二醇 (Sigma公司) , ≥98%的D-半乳糖 (Sigma公司) , 医用硅胶管 (内经2 mm, 外径3 mm, 济南晨生医用导管公司) , 鼠抗鼠单克隆PTTG抗体 (ab cam公司) , 鼠抗鼠单克隆P16抗体 (abcam公司) 。SYBR green master rox (Roche公司) , transcriptor first strand c DNA Synthesis Kit (Roche公司) 。

1.3 构建大鼠衰老模型及垂体泌乳素腺瘤模型

10%水合氯醛按0.2 m L/100g腹腔注射麻醉, 将含有10 mg E2无菌硅胶管植入雌激素诱导垂体瘤组大鼠背部皮下, 正常对照组及D-半乳糖诱导衰老组植入含有生理盐水的硅胶管。D-半乳糖诱导衰老组于术后7 d连续腹腔内注射D-半乳糖200 mg/ (kg·d) , 造成亚急性衰老;正常对照组、雌激素诱导垂体瘤组术后7 d腹腔内注射同等量生理盐水对照。观察各组大鼠的精神状态、体重、进食及尿量、肌肉是否有萎缩、毛发光泽度及有无脱毛等。术后第8周, 断头处死全部大鼠。解剖垂体, 观察垂体形状、大小、质地及颜色, 同视神经及颈内动脉比邻关系, 观察垂体窝鞍底形状, 骨质是否破坏。

1.4 垂体病理学检测

垂体标本常规HE染色, 采用S-P法进行免疫组化染色, 一抗为大鼠PRL单克隆抗体 (murine, Dako公司, 美国) 。用PBS代替一抗平行染体做阴性对照。

1.5 RT-PCR检测垂体组织中PTTG、P53、P21、P16m RNA表达

PTTG、P53、P21、P16基因的引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。按照93℃, 3 min;95℃, 1 min, 60℃30 s, 72℃30 s, 72℃30 s, 72℃4 min;30 cycle扩增目的基因, 对每个基因设β-actin做内参, 内参基因为Rps16。

1.6 Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21表达

每组取3只大鼠垂体组织, 提取垂体组织总蛋白, 进行SDS-PAGE电泳, 滴加稀释的Anti-p16 antibody、Anti-p21 antibody, Anti-PTTG antibody, DAB显色。照相记录图像, 蛋白感光条带用Kodak Carestream Molecular Imagine软件测量积分灰度值, 以各组蛋白表达量与β-Action比值进行半定量分析, 显示目的基因的蛋白表达水平。

1.7 统计学方法

实验数据采用Graph Pad Prism 5.0进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状态

6周后, D-半乳糖诱导衰老组大鼠出现精神萎靡、毛色晦暗, 背部及面颊部脱毛;与正常对照组比较, 尿量有所增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。与正常对照组比较, 雌激素诱导垂体瘤组大鼠尿量明显增加, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。

注:与正常对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与雌激素诱导垂体瘤组比较, ▲P<0.01

2.2 解剖学观察

雌激素诱导垂体瘤组大鼠垂体重量高于正常对照组, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。D-半乳糖诱导衰老组大鼠垂体重量小于正常对照组大鼠, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;D-半乳糖诱导衰老组大鼠垂体重量明显小于雌激素诱导垂体瘤组, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。正常对照组垂体粉红色, 位于鞍内, 双侧视神经之间, 其上覆盖鞍隔。D-半乳糖诱导衰老组垂体明显缩小, 表面皱缩, 质地较韧。雌激素诱导垂体瘤组垂体窝明显扩大, 形成大于正常对照组数倍体积的肿瘤, 鞍底骨质受压变薄, 视神经移位, 鞍隔上抬, 肿瘤有假包膜存在, 质地软, 分离肿瘤易出血。

2.3 垂体组织学观察

雌激素诱导垂体瘤组细胞排列紊乱, 正常垂体腺管样结构消失, 核大小不一致, 可见不典型性增生呈肿瘤样改变;D-半乳糖诱导衰老组垂体细胞明显减少, 细胞间隙扩大, 血管网稀疏, 部分细胞浆内出现空泡样改变, 细胞膜皱缩, 异染色质形成存在于细胞内。D-半乳糖诱导衰老组内PRL基本没有表达, 无明显细胞内颗粒染色, 正常对照组有PRL低表达, 镜下阳性细胞占比例很少, 雌激素诱导垂体瘤组大于80%细胞内表达阳性。见图1 (封三) 。

2.4 RT-PCR检测垂体组织内PTTG、P53、P16、P21m RNA表达

RT-PCR显示雌激素诱导组PTTG m RNA表达最高为 (12.99±1.86) , D-半乳糖诱导衰老组PTTG表达最低为 (2.10±0.23) , 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;D-半乳糖诱导衰老组P53、P16、P21 m RNA表达最高为 (113.51±23.87) 、 (29.26±4.44) 、 (67.21±10.08) , 在雌激素诱导垂体瘤组中表达略升高, 分别为 (83.26±8.06) 、 (9.83±2.13) 、 (28.19±2.01) , 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图2。

2.5 Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21蛋白表达

Western-blot条带积分灰度值显示D-半乳糖诱导衰老组PTTG、P21、P16蛋白表达为 (0.198±0.032) 、 (1.239±0.051) 、 (1.673±0.055) , 雌激素诱导垂体瘤中表达为 (1.002±0.041) 、 (0.202±0.055) 、 (0.409±0.059) , 两组比较差异有统计学意义。其中雌激素诱导垂体瘤组PTTG表达最高, D-半乳糖诱导衰老组垂体中表达最低。P16、P21在D-半乳糖诱导衰老组垂体表达最高, 在雌激素诱导垂体瘤组中表达最低。见图3。

3 讨论

组织学上大多数垂体腺瘤是良性肿瘤, 虽然部分垂体瘤表现侵袭性生长, 但很少有恶变和远处转移。部分垂体微腺瘤表现为停止生长, 微小泌乳素腺瘤能够进行自我消除, 说明在垂体瘤发生中存在内在的衰老机制[6]。不可逆的生长抑制和具有代谢活性是细胞衰的老两个标志性特征, 表现为半乳糖苷酶 (β-galactosidase, SA-β-GAL) 活性增加和异染色质凝聚 (senescence-associated heterochromatic foci, SAHF) , 研究发现DNA损伤和癌基因活化均可诱导细胞衰老[5,7]。癌基因诱导衰老是癌基因突变所产生的异常增殖信号, 通过P16INK4A-Rb, ARF-P53-P21信号通路激活衰老, 造成癌基因不稳定性增加, 恢复和提升肿瘤抑制基因活性, 使细胞处于生长停滞状态, 抑制肿瘤细胞增殖, 是预防肿瘤发生及恶变的重要保护屏障[7,8,9]。所以对垂体泌乳素腺瘤的癌基因———PTTG进行研究, 探讨其是否参与垂体细胞的早熟及增殖衰老中, 有助于重新认识垂体瘤的发生机制, 为垂体瘤治疗提供新的思路和方法。

PTTG是有丝分裂中的安全素样蛋白具有分离蛋白抑制酶活性, 能阻断有丝分裂过程中姐妹染色体的分离, 引起非整倍体出现, 导致基因不稳定和细胞恶性转化, 同时PTTG有效调控下游目标靶基因, 如成纤维细胞生长因子2 (b FGF-2) 及C-myc、P21、MMP2、cyclin D3等表达, 导致肿瘤血管形成、转移、侵袭力增强等, 与肿瘤的转移、预后密切相关[10,11,12]。近期研究发现PTTG能够干扰P53与DNA的结合能力, 抑制P53下游基因P21的转录活性和蛋白表达, 从而抑制P53介导的细胞凋亡, 促进肿瘤增殖, 在垂体腺瘤的形成和生长过程中起重要的作用。PTTG发挥调节衰老和凋亡主要通过蛋白-蛋白之间相互作用、细胞因子旁分泌-自分泌刺激和激活靶基因三条途径完成[13,14,15]。本次实验结果显示在雌激素诱导垂体瘤组大鼠中PTTG m RNA表达水平较其他组明显增高, 在D-半乳糖诱导衰老组垂体中PTTG表达明显降低, 所以PTTG可以看作垂体瘤的癌基因, PTTG的持续作用可以促进肿瘤细胞增殖。

癌基因诱导衰老能抑制肿瘤细胞增殖, 主要是通过P16INK4A-p Rb和ARF-P53这两条信号通路发挥作用, P16和P21-P53是衰老信号通路网络中的两个重要的控制节点[13,16]。对垂体瘤细胞衰老的研究发现, 敲除PTTG的垂体细胞启动了依赖P53-P21的衰老途径, 抑制了细胞周期进展所需的CDK2活性、Rb基因磷酸化等, 从而抑制肿瘤增殖[4,17]。研究发现PTTG基因缺失裸鼠中表现明显垂体衰老特点, 触发ARF-P53-P21衰老信号通路, 使凋亡阻滞, 诱导衰老产生, 阻止垂体瘤产生。PTTG主要通过调控P21的表达而影响细胞衰老的进程。但是奇怪的是, 在GH3细胞系中, 过表达PTTG反而会上调P21的表达, 从而促进衰老的发生。PTTG表达与P21呈负相关, 调节P21会减弱PTTG表达, 抑制肿瘤增殖。此研究同时指出PTTG表达水平过低诱发垂体细胞衰老, PTTG表达过高, 绕过衰老, 形成肿瘤。说明PTTG的表达失衡, 诱发和绕过衰老, 本实验也证实垂体内PTTG表达失衡导致垂体瘤生成[15,17]。

细胞衰老及凋亡都是通过激活P53下游靶基因P21而触发。本实验发现亚急性衰老大鼠垂体P53蛋白表达明显增高, 研究也指出P53仅仅在肿瘤生长早期 (未成熟衰老) 表达升高[13,18], 本实验也发现P53在雌激素诱导垂体瘤中表达比正常对照组高, 说明垂体细胞在经历了癌基因刺激后, 产生DNA损伤突变, 肿瘤生成过程中存在P53蛋白参与的细胞衰老, 引进并保持垂体肿瘤细胞一定程度的衰老, 抑制垂体瘤细胞进一步增殖, 说明在垂体衰老中P53蛋白参与调控衰老和维持衰老。

P21是P53的一个经典靶基因, 同时也是细胞周期负性调控因子, 与细胞凋亡和衰老密切相关[19]。本实验发现P21在衰老组垂体细胞中的表达是肿瘤细胞组的3倍, 提示垂体细胞衰老与P21的诱导密切相关。衰老组PTTG表达水平降低, 癌基因表达失衡能激活P53使P21表达增加, 引起细胞衰老, 表明P21参与诱发垂体细胞衰老与癌基因刺激的丧失密切相关。当癌基因表达水平下降的时候, P21由于失去癌基因刺激产生早熟衰老, 引起细胞生长停滞, 设想提高P21表达能够诱导衰老和限制垂体瘤细胞增殖和恶变[13]。

P16基因是细胞周期依赖性激酶CDK4抑制剂, P16INK4A同CDK4结合调控视网膜母细胞瘤Rb蛋白磷酸化水平, 使Rb基因与转录因子E2F相结合, 处于非磷酸化状态, 进而抑制细胞由G1期进入S期, 导致细胞生长停滞, 产生衰老, 因此又称为衰老相关基因[20]。P16有特异的自我更新功能, 能够持续的表达, 维持衰老通路的完整性[19,20]。本实验发现正常对照组内P16水平也较垂体瘤组内升高, 也行正常垂体内存在一定程度的衰老, 正常的垂体衰老是抑制内分泌细胞过度增殖导致分泌激素过量, 是机体的一种平衡和保护机制。垂体瘤内P16水平下降并与P21表达正相关, 说明大鼠在雌激素及癌基因的持续刺激下, P16表达下降, 早熟衰老消失, 肿瘤增殖。所以如何提高肿瘤进展期衰老相关基因表达, 诱导衰老限制肿瘤增殖和恶性变, 是将来研究的重点。

本实验证实在衰老垂体呈中PTTG表达水平明显下降, 与P53、P21、P16表达负相关, 说明D-半乳糖激活垂体细胞ARF-P53-P21/PRb-P16衰老通路, P53、P21表达提升, 抑制PTTG的表达, 引起细胞生长停滞。而雌激素作用引起PTTG表达增高, 导致姐妹染色体分离受限, 细胞周期停滞, 非整倍体形成, 发生了癌基因表达水平失衡诱发的早熟衰老, 但是由于雌激素持续释放, PTTG明显升高产生衰老绕过, 进一步引起细胞损伤, 产生垂体瘤细胞增殖。设想通过调控PTTG诱发衰老, 使垂体瘤细胞增殖停滞、侵袭性降低、激素异常分泌, 有较大临床应用前景。

7.细胞凋亡检测方法小结 篇七

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）

进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。

二、区分凋亡和坏死

可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。

不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。

三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。

四、细胞凋亡检测

1、早期检测: 1)PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4)线粒体膜电位变化的检测

2、晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。

对于晚期检测通常有以下方法：

1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)2)LM-PCR Ladder(连接介导的PCR检测)3)Telemerase Detection(端粒酶检测)

3、生化检测：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP（多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

4、LM-PCR Ladder(连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。其它方法：

1）Telemerase Detection(端粒酶检测)端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X(长的)作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X(长的)基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

5、细胞内氧化还原状态改变的检测：

正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

6、细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、线粒体膜电位变化的检测：

1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系

2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。

3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：

1）若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。2）形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；

3）凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例； 4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。用于流式细胞仪检测的染料：

PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342双标：

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。PI和Annexin-V双标：

磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性

五、形态学观察

1、普通光学显微镜观察

2、透射电子显微镜观察

3、荧光显微镜观察

1、普通光镜下观察：

1)用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色 直接用倒置显微镜观察： 1）细胞体积变小，全面皱缩；

2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。

2、透射电子显微镜观察

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

3、荧光显微镜

常用的荧光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。1）PI双染色法基本原理

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

六、细胞凋亡的分子生物学检测方法: 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。过氧化物酶标记测定法

原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一)试剂配制

1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。

4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。

5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。

6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17.4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）

（二）实验步骤

1、标本预处理：（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。

（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。

3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。

4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。

9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

（三）注意事项

8.细胞的衰老和凋亡-教案 篇八

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综!述!

”崔国辉

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综述#周克元

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审校

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通讯作者%周克元

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基金项目%国家自然科学基金%37P#H-0I0+)&

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#摘

要$

!”#$%&’(信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一“通过影响下

游多种效应分子的活化状态”在细胞内发挥着抑制凋亡!促进增殖的关键作用“它与人类多种肿瘤的发生发展密切相关$本文综述了!”#$%&’(信号通路的组成与功能!调节以及其抗肿瘤细胞凋亡作用机理等方面的研究进展“并就其抗细胞凋亡作用在肿瘤治疗中的应用作了评述”期待为以!“#$%&’(信号通路中关键分子为靶点的肿瘤治疗研究提供参考$

关键词%!”#$%&’(+信号转导+细胞凋亡+肿瘤+靶向治疗中图分类号%K0#L#

文献标识码%&

文章编号%MHHHJ+-0N(IGG4)G#OH##)JH-

细胞凋亡是机体细胞在正常生理靶点的肿瘤治疗研究正在深入&4’$

或病理状态下发生的一种自发的!程序化的死亡过程“它的发生受到机体!”#$%&’()信号通路的组成与

的严密调控#目前认为“细胞内的基因功能

直接控制着细胞凋亡的发生和发展”#%磷酸肌醇激酶(56785679:789(9;

而细胞外部因素通过信号转导影响这#%’9:=8

些细胞内基因的表达或其表达产物的因“

是肌醇与磷脂酰肌醇

活化”从而间接地调控细胞凋亡$细胞(567856=(9;>?9:789(7?“!”)的重要激酶“凋亡异常与多种疾病的发生发展有着正常情况下”由其活化而产生的类脂直接的联系“包括肿瘤%病毒性疾病及产物有#”+%二磷酸磷脂酰肌醇&!“(#”

多种退行性病变$研究表明“组成性活+)!*’%#”,%二磷酸磷脂酰肌醇&!“(#”化的!“#$%&’(信号通路在广泛的人类,)!*’和#”+“,%三磷酸磷脂酰肌醇&!”

肿瘤谱中失调“如卵巢癌&)’”乳腺癌&)’“(#”+“,)!#’#!”(#“+”,)!#作为细胞恶性胶质瘤&*’“子宫内膜癌’”成神经内的第二信使“是&’((又名蛋白激酶

管细胞瘤&+’”鼻咽癌&,’“骨髓增生异常@”!$@)转位于胞膜并被活化所必需

综合征&-’等$其主要是由于!“$#.&基的#!”#$与&’(组成的!“#$%&’(信号因编码的!”#$扩增和/或其他多种因通路在细胞的增殖和存活中起着重要素导致的&’(的过度活化&0’“或者是该的作用&A’#

通路某些调控成分如!123的突变所!”#$是一种可使肌醇环第三位羟

导致的功能缺失&+’$目前“以!”#$%&’(基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶#已发现信号通路中组成性活化的关键分子为

三种!“#$同工酶”其中研究最广泛的

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9.细胞的衰老和凋亡-教案 篇九

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人肝癌HepG2细胞株(武汉凯泰新生物技术有限公司馈赠)、RPMI1640培养液由干粉(美国Gibco公司)按说明配制并加10%新生胎牛血清(杭州四季青公司)和青链霉素混合液(碧云天公司),胰蛋白酶(美国Amresco公司)、钼酸氨(天津化学试剂厂,纯度99.0%)、AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(南京凯基公司)、碘化丙啶(PI)和RNA酶试剂(Sigma公司)。

1.2 主要仪器与设备

超净工作台(BCM21000型,苏州净化设备有限公司)、CO2恒温培养箱(SWJ2300TVBB,美国Quene公司)、倒置显微镜(OLYMPUS2CK40,日本OLYM-PUS公司)、酶标仪(STATFAX22100型,广州市倍威仪器有限公司)、流式细胞仪(BDLSRⅡ,美国BD公司,)。

1.3 方法

1.3.1 药物制备

钼酸氨以生理盐水溶解配成1000 mg/L的溶液,滤菌后置4℃冰箱保存,临用前用培养基稀释成所需浓度。

1.3.2 细胞培养

人肝癌HepG2培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各1×105U/L的RPMI1640培养基中,在5%CO2、37℃的培养箱中换液传代培养,至稳定生长。

1.3.3 CCK-8法测定细胞抑制率

收集处于对数生长期的HepG2细胞,制成4×104/L单细胞悬液,以4×103细胞/孔接种到96孔板(每孔接种100μL),细胞贴壁后,吸去培养孔中的液体,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404、0.606 mol/L)的培养液200μL,继续分别培养24、48、72 h,同时设空白调零组(不加细胞仅加入等量培养液),以及阴性对照组(加细胞同时加入等量培养液),每组设6个复孔。在上述药物作用不同的时间点,各孔加入CCK-8 10μL,继续培养3 h,在酶标仪上以490 nm的波长测定吸光度(OD)值。结果判定:细胞生长抑制率=(对照孔平均OD值-实验孔平均OD值)/(对照孔平均OD值-空白孔OD值)×100%。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的HepG2细胞,用胰酶消化后按每孔4.0×105个细胞接种于6孔板2 m L,24 h后换液,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404 mol/L)的培养液4 m L,继续分别培养24、48、72 h,同时设阴性对照组(加细胞和等量不含钼酸氨的培养液)。在上述药物作用不同的时间点收集细胞,PBS洗涤1次,-20℃预冷的70%乙醇固定3～4 h,PBS洗1次后各管加入600μL PI和RNA酶混合液,避光染色30min,流式细胞仪检测细胞周期,Modfit LT-Unititle软件分析数据。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞培养、接种、分组及作用时间同细胞周期测定,不同的时间点收集细胞,预冷PBS洗涤2次,用90μL Annexin V Binding Buffer重悬细胞,加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL,室温避光孵育15 min,加入200μL Annexin V Binding Buffer,于1 h内流式检测,BD-FACSDiva软件分析数据。

1.4 统计学处理

应用SPSS 11.5统计软件进行Friedman检验,以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 钼酸铵作用后Hep G2细胞形态学变化

不同浓度的钼酸铵作用于HepG2细胞24、48、72 h后,倒置显微镜下观察,对照组细胞贴壁生长状态佳,细胞轮廓清楚,呈梭形,随着培养时间的延长,细胞数量明显增加,而0.101 mol/L组细胞,随培养时间的延长细胞变化不明显:0.202 mol/L组细胞,1～2 d变化不明显,培养3～4 d,可见贴壁细胞中部分为圆形,有少量细胞漂浮在培养液中,细胞数目与对照组相比明显少:0.404、0.606 mol/L组细胞培养2d,细胞出现明显变化,细胞贴壁状况不良,圆形细胞及细胞碎片较多,有较多细胞漂浮在培养液中,贴壁细胞密度下降,培养3～4 d,上述变化更加明显。

2.2 钼酸铵对Hep G2细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示随着药物浓度增大和作用时间延长,钼酸氨对HepG2细胞增殖抑制存在着明显的剂量-效应关系和时间-效应关系(P<0.05)即剂量越大、药物作用时间越长,则对HepG2细胞的抑制率越高,见表1和图1。

注:Friedman检验不同浓度、不同时间抑制率的χ2,P值分别为

2.3 钼酸铵对Hep G2细胞周期分布的影响

流式细胞仪检测细胞周期结果显示不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72 h后,与对照组相比,细胞周期中各期细胞发生改变,即G0/G1期细胞及细胞凋亡率上升,S期和G2/M期细胞下降,差异性有显著(P<0.05),且与钼酸铵浓度和作用时间具有剂量依赖性和时间依赖性。见表2和图2-4。

注:Friedman检验χ2=9,P=0.029

2.4 钼酸铵对Hep G2细胞凋亡的影响

不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡,与对照组相比,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间延长,活细胞数百分比(Q3)逐渐减少,凋亡细胞数百分比(Q4+Q2)逐渐增加,且呈剂量依赖和时间依赖关系,差异有统计学意义(P<0.01),见表3和图5-7。

注:Friedman检验χ2=19.2,P=0.000

3 讨论

钼是人体14种必需的微量元素之一。其生理功能主要是通过各种钼酶的活性来实现。钼是醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等的重要组分。钼酶存在于所有生物体内,参与蛋白质、含硫氨基酸和核酸的代谢[4]。

十多近年来,随着人们对钼的认识的逐步深入及国内外大量的流行病学调查研究和试验研究[5,6,7,8]的进展,进而发现钼除了作为人体必需微量元素发挥多种生理功能外,还对肿瘤的发生、发展具有预防和抑制作用,其抗癌机理可能有:(1)钼是抗氧化剂,有阻断过氧化物生成的作用,从而防止氧化损伤。(2)钼是硝酸还原酶的组份,此酶防止硝酸盐及亚硝酸盐与二级胺生成亚硝酸胺化合物;(3)钼对肝P450酶和去甲基化酶的活性有影响,小浓度可促进亚硝胺代谢并减少肝脏DNA化合物的生成;大浓度钼可减慢亚硝胺的代谢;(4)钼有封闭类固醇类激素受体的作用,像黄体酮受体,雄性激素受体,钼也是体内转失活雌激素进入活性体的抑制剂,因为乳腺是雌激素调节的靶器官,雌激素是促进乳腺正常和异常生长的因素,钼使乳腺雌性激素受体失活减弱激素致癌过程的促进作用[9]。

该实验结果表明:(1)钼酸铵在体外能明显抑制人肝癌细胞HepG2的生长和诱导细胞凋亡,并呈一定的量效和时效关系,不同浓度钼酸铵对HepG2细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率随着药物浓度的增加和时间的延长而升高,明显高于对照组(P<0.0l)。(2)钼酸铵对HepG2细胞周期各时相有一定影响,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间的延长,G0/G1期细胞显著增多,S期和G2/M期细胞减少,并出现凋亡峰。说明钼酸铵可以诱导肿瘤细胞出现G1期→S期阻滞和细胞凋亡,使许多肿瘤细胞不能进行DNA合成,从而起到抑瘤作用。抑瘤药物对细胞周期的影响可以通过阻滞G1期→S期阻止DNA复制或阻滞S期→M期抑制细胞分裂而抑制肿瘤细胞的生长。G1期是细胞DNA复制前期,是合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA等重要物质的关键时期;S期完成DNA合成,DNA含量在此期增加一倍,此两期皆是药物等因素作用的靶点,抑制细胞周期G1期或S期,从而抑制肿瘤细胞增殖[10]。该研究说明在钼酸铵的作用下,HepG2肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制,导致细胞增殖分裂减慢并部分凋亡。

综上所述,钼酸铵能抑制人肝癌细胞的体外增殖,其机制可能与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关,其作用的具体分子机制尚需进一步探讨。

参考文献

[1]YAN XM,HONG M,ZHANG H,et al.Progress in studies oftrace element selenium and organoselenium compounds as phar-maceticals[J].Guang Dong Wei Liang Yuan Su Ke Xue,2003,10(9):1-10.Chinese

[2]PENG XE,YANG XH,SHI XS,et al.Study on geographiccharacteristics of esophageal cancer in fujian province[J].Chin.j.Prey Chron Non-commun Dis,2003,11(5):212-213.Chinese

[3]JIA RB.New progress research on molybdenum elements andgastric cancer[J].China Molybdenum Industry,2000,24(1):46-49.Chinese

[4]HU XH.Essential trace element molybdenum of human body andhuman health[J].Mondern Preventive Medicine,2001,28(3):353-355.Chinese

[5]DENG Y,LU XM,PANG XL.The anticancer and antitumouractivity of the molybdenum-containing complex[J].Chemistry,2005,7:522-527.Chinese

[6]JOHNS PG,KAY S.A novel agent for the treatment of solidtumors[J].Anticancer Drugs,2001,12(8):639-646.

[7]MITSUI S,OGATA A,YANAGIE H,et al.Antitumour activityof polyoxomolybdate,[NH3Pri]6[Mo7O24].3H2O,against humangastric cancer model[J].Biomed Pharmacother,2006,60:353-358.

[8]OGATA A,MITSUI S,YANAGIE H,et al.A novel anti-tumouragent,polyoxomolybdate induces apoptotic cell death in AsPC-1human pancreatic cancer cells[J].Biomed Pharmacother,2005,59:240-244.

[9]ZHANG AH,ZHANG Q.Cobalt,molybdenum mutagenesis resis-tance and anti-cancer effect[J].Studies of Trace Elements andHealth,1994,11(4):55-56.Chinese

10.细胞的衰老和凋亡-教案 篇十

(0+12!“#信号通路中一个重要的调节

因子$在人类的多种肿瘤中高表达$包括有软组织肿瘤%骨肉瘤%血液系统肿瘤%乳腺癌%结肠癌和前列腺癌等”34#!

56789:等研究证明./.$的反义寡核

苷酸具有明显的抗肿瘤活性&它能特异性地抑制./.$的表达&增强癌细胞对化疗和放疗的敏感性&增强表皮生长因子抑制剂对激素抵抗和激素依赖的前列腺癌细胞的增殖%凋亡和蛋白表达的影响“3*&3$#’王宏梅等”3+#研究证明!;.

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突变和

(?@7AA@:AB9CAB68D6E6#:F?&

’.0?)&它们具有选择性的抗肿瘤活

性*G:F#@78868和HI$-344$是两种广泛应用的(0+1抑制剂&它们特异性抑制(0+1J**4亚单位的催化活性&阻断

(0+12!“#通路的活化&能有效的增加

化疗药物对癌细胞的敏感性”33#*但由于这两种抑制剂潜在的副作用&目前还都限于体外研究*!“#抑制剂是当前研发的热点&它能拮抗!”#的抗凋亡作用&破坏癌细胞耐药性&诱导癌细胞凋亡*较早发现的!“#的抑制剂有抗炎药物塞莱考昔()BAB9:K6E&是一种)LM2$抑制剂)及其衍生物L’N2

4+4*$和L’N24+4*+&其中L’N24+4*$

在抑制!”#方面表现更高的专一性&并且研究表明L’N24+4*$在体内具有很高的生物活性&产生很低的毒副作用*现在&研究进一步证实)BAB9:K6E能够通过使!“#失活而抑制乳腺癌细胞的生长&成为乳腺癌治疗研究中的主要药物之一”3O#*(BF6P:?68B是一种基

于脂的!“#抑制剂&通过抑制!”#的膜转位&降低!“#的活性&抑制多种肿瘤细胞的生长”3Q#*!期临床研究正在评价JBF6P:?68B对于复发性胰腺癌+前列腺癌%复发性或转移性头颈癌和晚期软组织肉瘤的疗效

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膜定位!在临床前研究中&每日腹腔注射(M2+*Q能够抑制!“#活性并减缓.)U2R裸小鼠移植瘤的生长&但是对于T;2$-裸小鼠移植瘤仅有微弱的疗效”O*#!.78V7A等“O$#研究发现了!”#的抑制剂*H2Q2DWVF:KW@B#DWA2

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和N,R细胞形成集落的能力&而对正常的星形胶质细胞和人成纤维细胞没有抑制效应”O+#!最近&XD78Y等“O3#研究发现了一种新的!”#抑制剂).=((-29DA:F:2$2@B#DWABAA6J#69686C@79B#7#B)&

).=(是通过抑制!“#’BF3R+和;DF+4,的磷酸化下调!”#的活性&而

对(0+1%(/1*或.!(1的活性则没有影响!研究证明).=(对多种!“#高度活化的前列腺癌细胞具有抗增殖和诱导凋亡的效应&而对于!”#没有激活的其他癌细胞的抑制作用极微!相同的效应在荷瘤小鼠的试验中也得到了证实!雷帕霉素(%7J7@W968)是一种@;L%的抑制剂&是美国食品药品管理局批准适用于临床移植的免疫抑制剂&但其衍生物))02RR-%%!/244*和!(2$+OR+被明确定位为抗肿瘤药物!临床前研究结果表明&这类化合物无论是单药还是与细胞毒药物联用&都能够有效的抑制肿瘤生长!在临床

#%!期研究中&雷帕霉素衍生物有明

显的抑制多种肿瘤的作用!在非小细胞肺癌%乳腺癌%子宫颈癌%泌尿系统

肿瘤%肉瘤%间皮瘤%淋巴瘤和胶质瘤的治疗中&均观察到雷帕霉素衍生物使患者病情部分缓解和病程稳定!同时&在上述临床研究中引入了一个作为监测临床响应的指标&即检测外周淋巴细胞中@;L%下游底物3=25(2*和’Q1*的磷酸化程度!临床上&用常规手段治疗肾癌易复发&在一项针对肾癌的!期临床研究中&雷帕霉素衍生物))02RR-产生一例完全缓解&数例部分缓解&还有半数患者病程稳定达$3周以上“OO#!)DF6?#678等”OQ#研究证明./.$的小分子拮抗剂8C#A682+$可用于(O+途径失调的肿瘤&8C#A682

+$结合(O+的口袋蛋白&破坏(O+与./.$的结合&使(O+稳定&激活(O+

依赖的凋亡途径!另外&一些小分子抑制剂通过间接作用于(0+12!“#信号通路中的凋亡相关蛋白&促进肿瘤细胞的凋亡&抑制肿瘤的生长!目前&已经应用于临床试验的抑制(0+12!”#信号通路的小分子抑制剂有0@7#686E

@B?WA7#B(’;0OR*)和表皮生长因子受

体(BJ6VBF@7AYF:Z#DP79#:FFB9BJ#:F&

=[U%)抑制剂/*,+-!’;0OR*是一种

靶向).H5)%2!5H融合蛋白的小分子&研究表明’;0OR*能够下调5)%2

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诱导细胞凋亡!在=[U%高表达的多种癌细胞中&/*,+-的抗肿瘤活性可能是通过抑制=[U%下调!“#的活性%诱导凋亡%抑制增殖”OR&O,#!综上所述&对于(0+12!“#信号通路中过度活化或过度表达的关键性组成分子&特异性的小分子抑制剂能够有效地阻断该通路过度活化引起的凋亡抑制效应&增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性&诱导细胞凋亡&抑制肿瘤细胞的生长!

!展望

多细胞生物通过细胞增殖和凋亡来维持自身的稳定&若两者之间的动态平衡失调&则可导致肿瘤的发生!

(0+12!”#信号通路对于细胞的增殖和

凋亡的调节是必需的&其组成性活化与人类肿瘤的发生发展密切相关!通过基因干预方法敲除或小分子药物抑制(0+12!"#及相关基因&阻断其对下

11.细胞的衰老和凋亡-教案 篇十一

关键词：康莱特,肝细胞癌,细胞增殖,细胞凋亡

康莱特(KLT)注射液是从传统中药薏苡仁中提取的新型双相广谱中药抗肿瘤药物,临床上多用其静脉乳剂,研究表明[1,2],KLT具有阻滞肿瘤细胞有丝分裂,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,影响癌基因表达,抑制肿瘤新生血管生成,调节细胞因子水平以及逆转多药耐药等作用,而且能明显改善患者的生存质量[3,4]。目前KLT对小鼠肝癌细胞Hepa1-6抗肿瘤作用的机制还缺少全面的研究。本实验旨在分析康莱特是否是通过抑制Hepa1-6细胞增殖、诱导Hepa1-6细胞凋亡来发挥抑瘤作用,为其在临床应用中提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂

康莱特注射液(100 ml/瓶,浙江康莱特药业有限公司,国药准字:Z10970091);DMEM培养液为Invitrogen公司产品,小牛血清、胰蛋白酶及噻唑兰(MTT)均购自武汉博士德生物工程有限公司;青霉素、链霉素为HyClone公司产品。二甲基亚砜(DMSO):天津市化学试剂公司。

1.1.2 主要仪器

ZS-2板式酶标仪(中国航天工业总公司),SW-CJ-FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),流式细胞仪,CO2细胞培养箱,普通台式离心机。

1.2 细胞培养

小鼠Hepa1-6肝癌细胞株购于中国农科院细胞库,以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养。隔天换液一次,3~4 d传代一次。取对数生长期细胞制备单细胞悬液进行不同的实验。

1.3 MTT法检测细胞抑制情况

取对数生长期细胞稀释为1×105/ml密度每孔200μl移入96孔培养板中。加入KLT组B(10 ml/L)、C(20 ml/L)、D(30 ml/L)、E(40 ml/L)、F(50 ml/L)的10%胎牛血清DMEM培养液。另设A组(空白对照组,10%胎牛血清DMEM培养液)。分别培养24、48、72 h,实验终止4 h前加入MTT液(5 mg/ml)20μl。弃上清,加入DMSO 150μl,振荡10 min使结晶溶解,用酶标仪(波长490 nm)测定吸光度(OD)值,重复3次取平均值。药物对细胞生长的抑制率:抑制率(IC)=(空白对照组OD均值-用药组OD均值)/空白对照组OD均值×100%。

1.4 光镜观察细胞形态学改变传代试验

取对数生长期细胞稀释为1×105/ml密度每孔1 ml接种于放有盖玻片的6孔板中,细胞贴壁后,随机分为四组,分别加入KLT(B、D、F),并设A组作为对照(每孔总液量均为2 ml),培养48 h后取出覆盖有细胞的盖玻片,PBS洗3次,浸入40 g/L多聚甲醛中固定15 min,PBS洗2次,常规苏木精-伊红染色,光镜下观察细胞结构变化。

1.5 流式细胞术测定细胞凋亡率

取对数生长期细胞消化成单细胞悬液置6孔培养板,培养24 h后弃上清,加入KLT(B、D、F),每种浓度设平行4孔(即每种浓度重复4次),并设A组作为对照,继续培养48 h后,加入0.25%的胰酶1 ml将细胞消化,置入离心管中,离心(1 000 r/min,5 min),弃上清;PBS洗2次,离心、弃上清,加70%无水乙醇2 ml固定,振荡混匀,离心,弃上清,过300目筛子,PBS洗3次,加入1 ml PI工作液,4℃避光染色30 min,流式细胞仪分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行分析,计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析及LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLT对Hepa1-6细胞生长的抑制效应

Hepa1-6细胞在KLT不同剂量、时间作用后,MTT法观察细胞生长情况结果示:随着KLT剂量的逐渐增加、作用时间逐渐延长,其细胞生长抑制率逐渐增加。各给药组与A组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01);各给药组组间比较示:与B组比较,C组与B组(P>0.05),D组与B组(P<0.01);与D组比较,E组与D组(P>0.05),F组与D组(P<0.01)。提示,KLT对Hepa1-6细胞的抑制作用呈剂量、时间依赖关系;并且KLT以10、30、50 ml/L作用时,细胞抑制率显著,因此,后续实验用此三种浓度进行。见图1。

2.2 KLT对Hepa1-6细胞形态及传代试验的影响

光镜示,Hepa1-6胞质呈粉红色,胞核呈深蓝色。A组细胞形态呈多边形或三角形,伪足多、长,满视野瘤巨细胞及核分裂相。随着给药浓度增加,细胞伪足渐回缩,细胞形态变小、圆,细胞轮廓清晰度增强,排列松散或聚集成团,细胞分裂相渐减少,瘤巨细胞渐减少。传代试验表明,A组细胞生长快,分裂增殖旺盛,3~4 d传代一次,随着给药浓度增加,传代能力逐渐下降且失去传代能力,出现悬浮现象。上述现象表明,细胞形态及传代试验与药物浓度呈依赖性,见图2。

2.3 KLT对Hepa1-6细胞凋亡的影响

不同剂量KLT作用Hepa1-6肝癌细胞48 h后,均在G0/G1期前出现一个亚二倍体峰,且该峰随着KLT作用浓度的增高而升高(图3)。经KLT(B、D、F)作用48 h后,细胞凋亡率分别为(7.86±0.40)%、(12.34±1.09)%和(28.67±0.85)%,而对照组仅为(2.88±0.30)%,各药物组与对照组比较、各药物组间比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。

(A:对照组;B~F:依次为KLT 10、30、50 ml/L组。1:凋亡峰;2:G0/G1期细胞;3:G2/M期细胞;2-3:S期细胞)(A:Control group;B-F:The group of KLT 10、30、50 ml/L.1:The peak apoptosis;2:G0/G1cells;3:G2/M cells;2-3:S cells)

3 讨论

原发性肝癌系全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,且近年来发病率有上升趋势[5]。目前临床治疗肝癌仍以手术、放疗、化疗为主,但70%~80%的患者就诊时已失去手术最佳时期。临床常用的西药化疗物虽有很强的癌细胞杀伤性,但药物的毒副作用使体质较差的患者难以耐受,极大地降低了患者的生存质量。因此,临床上寻求一种既能抑制肝癌的生长,又无明显的毒副作用、提高患者生存质量的药物迫在眉睫。

恶性肿瘤包括肝癌在内,共同生物学特征是细胞的失控增长,即细胞凋亡与细胞增殖失衡。因此,抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前肿瘤综合治疗的重要途径之一[6]。KLT注射液是从传统中药薏苡仁中提取的新型双相广谱中药制剂,具有多靶点治疗、提高晚期癌症患者的生存质量和毒副作用小等优点,目前临床已应用于非小细胞肺癌[7]、胃癌[8]、大肠癌[9]等恶性肿瘤的综合治疗中。本研究通过MTT法观察,结果表明,KLT能够有效抑制肝癌Hepa1-6细胞增殖,抑制率呈明显的时间、浓度依赖性,且10、30、50 ml/L抑制作用明显。

苏伟贤等[8]将不同浓度的KLT作用于人SGC-7901胃癌细胞,研究发现随着药物浓度增加,胃癌细胞核浆比例显著缩小,细胞恶性程度降低,细胞分化趋向良性;本研究细胞爬片HE染色示,发现给药后Hepa1-6肝癌细胞伪足回缩,细胞变小、变圆,核分裂相减少,出现悬浮现象,传代能力减弱,且呈浓度依赖性。进一步提示KLT可能在一定程度上能够诱导肿瘤细胞向正常细胞分化。

12.生物细胞凋亡总结 篇十二

都在说二十一世纪是生命科学的世纪，很荣幸能够进入生物科学这个行业。

关于对自己所学专业，可能最初是兴趣让我来到这个专业，不是太清楚为什么会对这个专业有这么大的热情，但真的很喜欢它。生物技术，最官方的定义是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。它主要包括发酵技术和现代生物技术。现代生物技术综合基因工程、分子生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、有机化学、无机化学、物理化学、物理学、信息学及计算机科学等多学科技术，可用于研究生命活动的规律和提供产品为社会服务等。

再我自己看来生物技术其实是一个既可以看做一个基础学科也可以看做是一个很新兴的，综合性的学科。其实生物技术这是一个很综合性的学科，现在和很多领域接轨，对我们而言这是机遇和挑战。

对我自己而言，我想在生物技术这方面有所建树，最主要的还是在科研方面能攻克一些难题，虽然可能现在想法不是太成熟但是我相信经过几年的磨练与努力我能够攻破这些难题。希望能够在大一下就能够进入实验室，学一些基础的实验技能为以后自己做项目打下基础。

然后关于自己的专业，现在我们所学的知识其实普遍落后，教科书的编排更新不及时，可能我们学到的东西可能学校外面已经开始产业化了，测序技术已经开始第四代了，而我们可能毕业前一年才开始学习切片制作，学习的东西很古老，再就是我们这个专业，并没有像其他几大理科领域一样有清晰的逻辑和量化，这导致了很多小领域只有开头和结果而没有一个可复制的过程，而没有可复制的过程就代表着无法带领这个行业产业化，因此，这个行业在没有开源的情况下就无法支撑这个领域下的大多数学生的温饱，就只能节流，这样就导致了本专业的人才无法继续从事与本专业有关行业，转而从事其他行业，从而导致人才流失，最终专业发展缓慢。而谈到生物技术不得不说到它和其他行业接轨这一问题，的确，和其他领域接轨形成交叉学科是一个理想的出路，如合成生物学，生物信息学，的确给生物注入了一股生机。但是我们都知道越巨大的事物迈步子很大也很缓慢，何况在人才流失的情况下。

说到这里，可能真的学习这个专业我们更多的是在学习了基础课程后，自己学习最新更新的知识，在老师的指导下自己收集资料自己进行实验，再完成项目。

很多人对生物技术这个专业有很多的误解，我们在完成自己研究项目的同时也有义务科普大众。毕竟这也是吸引人才的重要途径，同时也是解决本专业人才流失的好方法。

我自己有一个不成熟的想法，很久之前曾了解到俄罗斯的“永生计划”它的设计活体意识转移到机器人身上，对此几乎大多数人是不看好，不支持的。而对于这个“永生计划” 我有一个想法，癌细胞是无限增殖，如果我们能够完全弄清楚癌细胞的增殖过程及机理，并能够运用到人体衰老细胞中，对衰老细胞进行基因修饰添加经过改良的癌细胞中能够无限增殖的基因，或许“永生”并非不可能。同样的癌细胞的无限增殖基因或许也能在器官移植这一领域有所贡献，也是利用无限增殖，让器官细胞增殖，成长成完整的细胞。或许研究出癌细胞无限增殖的机理并提取其这个基因对人类会有很大贡献。

至于疑惑这个方面就是在教材更新换代不及时的情况下，我们是否只能通过课外阅读这些方式来扩展自己的知识面，还有就是技术的更新我们是否能够跟的上，倘若有同学本科毕业便想进入行业工作，最新的技术他们又要从何学习。最后关于实验室，毕竟如果想要真的从事生物研究该如何合理利用现有资源来完成自己的项目。

最后我个人的话最想获得的是关于癌细胞无限增殖机理方面的指导，和我不成熟构想的可实施率。

以上是我个人对本专业的认识及理解，以及对未来设想。

13.细胞的衰老和凋亡-教案 篇十三

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)也称为退行性关节炎,是一种以关节软骨组织变性、破坏及关节非承载面骨赘形成,软骨下骨硬化增生为特征的慢性关节炎疾病[1]。OA疾病病变发生于全身各处大小关节,其中以髋关节、膝关节为主,伴随着关节疼痛和功能障碍、畸形[2]。近年众多关节炎分子生物研究表明,骨性关节炎发病发展涉及多种因素诱导其发病:年龄、外伤、异常重力应载、遗传易感性、软骨组织新陈代谢失平衡以及软骨细胞凋亡和增殖异常[3]。但是,临床上治疗骨关节炎疾病的药物少之又少,主要是氨基葡萄糖类药物,所以研究骨关节炎病理生理发展和信号级联调控通路是非常必要的。

MicroRNA(miRNA、miR)是一类由内源基因编码的长度约18~22个核苷酸的非编码单链RNA分子,在转录后期靶向结合mRNA 3’非编码区,抑制mRNA翻译或促进mRNA降解,以致调节蛋白质表达,参与介导细胞内活动,例如细胞凋亡、细胞增殖和分化[4]。尽管miRNAs家族广泛地分布人体组织内,但是miRNAs的表达呈现细胞表型、组织特异性以及细胞分化阶段特异性[5]。据报道,miRNAs参与多种疾病病理生理发生、发展[6]。MiRNA作为多种疾病发生发展的重要调节因子是因为人体处于某种疾病情况下,特定miRNAs表现出调节功能障碍[7,8]。近年来研究表明,miRNAs在调节关节内稳态、在OA发病机制中起着重要的调节作用。Silvia Díaz-Prado等利用miRNA基因芯片技术筛选出在OA软骨组织中具有潜在调节作用的miRNA[9]。在我们之前研究miRNA-25过表达促进OA软骨细胞合成蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白,miR-25介导OA发病发生、进展中发挥着保护性调节作用[10]。但是关于miRNA-25参与调节OA软骨细胞凋亡和增殖尚未见报道。本次试验研究,miRNA-25是否参与调控OA软骨细胞凋亡、增殖,可能对OA具有潜在的治疗作用。

2 材料和方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠20只,SPF级,重200~250 g,购于斯莱克景达实验动物有限公司(SCXK(湘)2011—0003),中国湖南)。

2.1.2 实验试剂

木瓜蛋白酶(0.2g/m L)(Solarbio,中国上海)、戊巴比妥钠(2%,w/v)(全式金,中国北京)、胰蛋白酶(0.25%,w/v)(全式金,中国北京)、Ⅱ型胶原蛋白酶(1%,w/v)(全式金,中国北京)、100μm尼龙细胞过滤网(Canspecsci,中国上海)、生长培养基(含青霉素和链霉素)(博士德,中国武汉)、胎牛血清(BI,以色列)、MiRNA-25(模拟物和抑制剂的质粒载体)及其空质粒载体、miR-25引物(吉玛公司,中国上海)、Lipo2000(全式金,中国北京)、Annexin V-FITC/PI(贝博公司,中国上海)、细胞计数盒CCK-8 kit(全式金,中国北京)。

2.2 实验方法

2.2.1 骨关节炎动物模型制作

雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),称重约200~250 g,购于斯莱克景达实验动物有限公司(中国湖南)。动物抵达后,立即饲养于南昌大学第二附属医院动物研究中心。每4只大鼠饲养在同一鼠笼(大小25 cm×40 cm)。大鼠均给予标准实验动物饲料和饮用水,并保持室内温度(26±1)℃,实行12 h明暗更变方案,早7点开灯照明。所有的动物实验操作均按照中国动物伦理委员会社会准则。南昌大学附属医院审查委员会正式批准实施的动物获得作为所描述的实验对象。

行膝关节腔注射木瓜蛋白酶(Solarbio,中国上海)诱发单侧骨关节炎模型[[11,12]]。以往研究表明分别于第1、4、7天总计3次注射诱导OA[11],但是单次注射木瓜蛋白酶后第7天OA关节负重面可能会恢复正常。因此,我们采用于第1、4、7、10、13天行膝关节腔注射木瓜蛋白酶。选取40只实验大鼠,首先使用戊巴比妥钠(2%,w/v)(全式金,中国北京)行腹腔注射麻醉大鼠,75%医用酒精消毒右侧膝关节区域,触诊膝关节髌骨位置,使用28号针头于髌骨下侧垂直进针,穿透髌韧带,向近端转向插入膝关节腔,直至感到落空感。100μL稀释0.2 mg木瓜蛋白酶注射入右膝关节腔,左侧膝关节不做处理,作为对照组。在第40天进行Kraus改良Mankin评分(评分标准如表1)。

2.2.2 SD大鼠软骨细胞分离和原代培养

为了软骨细胞分离并原代培养,软骨组织从股骨髁和胫骨平台剥离,利用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和青霉素(100单位/m L)和链霉素(100μg/m L)冲洗3次,于培养皿(直径=6cm)中手术刀刀片切成1mm×1 mm,接着使用胰蛋白酶(0.25%,w/v)(全式金,中国北京)在37℃培养箱中预消化30 min和使用Ⅱ型胶原蛋白酶(1%,w/v)(全式金,中国北京)消化3 h。经过3 h消化后,将组织样品通过100μm尼龙细胞过滤网(Canspecsci,中国上海)以消去未消化的软骨组织,过滤后软骨细胞离心分离(1 000 r/min,5 min)后再次重悬于生长培养基(含青霉素和链霉素的DMEM和10%胎牛血清)(博士德,中国武汉和BI,以色列),并贴壁生长。所有细胞培养置于恒温37℃、5%CO2培养箱,每2~3天更新一次培养基。

2.2.3 miRNA-25转染

MiRNA-25(模拟物和抑制剂的质粒载体)及其阴性对照购于吉玛公司(中国上海)。MiRNA-25模拟物(5μL),抑制剂(5μL)和阴性对照(5μL)利用Lipo2000(全式金,中国北京)分别转染至OA软骨细胞。转染后24 h后利用荧光显微镜(OLYMPUS TH4—200,日本)观察6孔板模拟物和抑制剂转染细胞活性,进行荧光素蛋白分析,计算转染率[10]。

2.2.4 软骨细胞增殖检测

按照试剂制造商说明通过细胞计数盒(CCK-8kit)检测软骨细胞增殖活性。简而言之,大约3×103细胞接种于每孔含有100μLDMEM的96孔板中,随后IL-1β(5ng/m L)加入培养基中,然后培养24 h。miR-25模拟物、抑制剂、阴性对照分别转染至各组。混有10μL CCK-8溶液的100μL新DMEM培养基(v/v,含有10%胎牛血清)加入每孔并于37℃孵育4 h。四块96孔板依次以miRNA-25转染后0 h、24 h、48 h、72 h检测(吸光度:490 nm)。每次检测重复3次。

2.2.5 软骨细胞凋亡检测

软骨细胞凋亡依据Annexin V-FITC/PI(贝博公司,中国上海)试剂说明检测。4℃PBS冲洗细胞培养皿3次后,无EDTA的0.25%胰蛋白酶(全式金,中国北京)消化30 s,轻轻吹打细胞,离心(1 000rpm,5 min)弃去上清液,分离细胞。避光下依次加入Annexin V-FITC和PI,各自室温下孵育15min、5 min。软骨细胞通过流式细胞仪(BD Biosciences公司,美国)分别在530/30 nm(FITC)和582/42nm(PI)下进行分析。使用Cell Quest软件进行细胞凋亡比例分析。每次试验重复3次。

2.2.6 统计分析

数据按Mean±S.E.M形式表示。统计使用两样本t检验行两组之间进行比较。P值<0.05被认为具有显著差异统计学意义。

3 结果

3.1 骨关节炎模型评价和分析

对照组和木瓜蛋白注射组进行骨关节炎动物模型评价分析,确定对照组没有软骨损伤,而木瓜蛋白酶注射组关节软骨表面形态变化明显,提示木瓜蛋白注射组软骨退变。依照Kraus改良Mankin评分,木瓜蛋白注射组明显不同于对照组,证明处理组明显关节退变(图1)。

图1(a)木瓜蛋白酶注射组软骨组织HE染色(200×);(b)对照组软骨组织HE染色(200×);(c)木瓜蛋白酶注射42D后骨关节Kraus改良Mankin评分明显升高,每组均包括5个软骨组织样本(n=5),**P<0.01 vs对照组Fig.1(a)HE staining of Papain injected cartilage(100×);(b)HE staining of Control group(100×);(c)Kraus modified Mankin score significantly increased 42 days after Papain injected cartilage,each groups included 5 samples,**P<0.01 vs.Control

3.2 miRNA-25转染OA软骨细胞

已发表的研究[10]MiR-25模拟物/抑制物转染至OA软骨细胞24 h经荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,并计算转染率为66%,证明了转染miR-25模拟物/抑制物成功。

3.3 miRNA-25对IL-1β促进软骨细胞凋亡和抑制细胞增殖调节作用

为了研究miRNA-25是否具有调节OA软骨细胞凋亡作用,IL-1β(5 ng/m L)刺激OA软骨细胞24h后,然后研究miRNA-25可能的调节作用。因此,转染miR-25模拟物或者抑制物后,通过Annexin V-FITC/PI检测细胞存活率。如图2A所示,转染miR-NA-25模拟物的OA软骨细胞组凋亡率显著降低,而转染miRNA-25抑制物的OA软骨细胞组的凋亡率明显增高。同时软骨细胞增殖活性通过细胞计数盒8(CCK-8)检测。如表2、图2B所示,miRNA-25模拟物转染组的细胞增殖显著增高;而miRNA-25抑制物转染组的细胞活性明显下降。

4 讨论

软骨外基质(ECM)新陈代谢平衡失调是骨关节炎在分子水平上的主要特点,该平衡失调主要由多种促炎性因子介导并发挥重要作用,例如白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[13]。IL-1β是退行性骨关节炎发病机制及病理发展过程中起重要促进作用的主要炎性细胞因子[14]。该细胞因子诱导基质金属蛋白酶合成和抑制软骨外基质合成[15]。IL-1β同样诱导软骨细胞凋亡,进一步导致关节软骨退变[16],提示IL-1β可以作为促进骨关节炎体外模型的炎性因子。

在之前研究[10]中,证明了IL-1β可以抑制软骨细胞合成蛋白多糖和II型胶原蛋白以及miR-25参与调节ECM合成,其过表达促进蛋白多糖和II型胶原蛋白合成。因此在本次研究中,检测了miR-25是否参与调节IL-1β诱导OA软骨细胞凋亡和细胞增殖,进一步参与调节骨关节炎疾病发展。分别通过Annexin V-FITC/PI和CCK-8检测miR-25转染后OA软骨细胞凋亡和增殖,miR-25过表达抑制IL-1β诱导OA软骨细胞凋亡和促进OA软骨细胞增殖;而miR-25低表达正好相反,提示miR-25可能参与调节细胞活性,延长细胞“寿命”,达到延缓骨关节炎疾病发展的目的。根据miRNA数据库其miR-25靶向结合基因序列预测并不收录ACAN、Col2a1,但是收录了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)4基因,然而丝裂原活化蛋白激酶信号通路涉及OA软骨细胞合成基质糖原,参与骨关节炎疾病发生与发展[17]。丝裂原激活通路蛋白激酶家族是信号转导过程中非常重要的信号分子,在疾病发生和发展过程中起重要调控作用,细胞内磷酸化级联反应的终反应是MAPK激活,而丝裂原活化蛋白激酶4是信号通路重要的激活剂[17]和丝裂原活化蛋白激酶4是P38重要的激活蛋白,P38通路在细胞凋亡中在Caspase通路上游起作用,因此P38信号通路参与了细胞增殖、分化以及凋亡过程[18]。所以我们假设miR-25通过靶向结合丝裂原活化蛋白激酶4基因,参与P38和Caspase通路,调节OA软骨细胞凋亡,但是需要进一步研究证实。

图2A miR-25转染OA软骨细胞24 h后细胞凋亡检测。(a)对照组,(b)miR-25 mimic组,(c)NC组,(d)miR-25inhibitor组,(e)NC组,(f)各组细胞凋亡柱状图,平均光度值(ODs±SEM)分别表示细胞凋亡。未转染miR-25的OA软骨细胞为对照组,*P<0.05,#P>0.05 vs control Fig.2A OA chondrocytes apoptosis tested by Annexin V-FITC/PI 24hours after chondrocytes were transfected with miR-25.(a)Control,(b)miR-25 mimic,(c)NC,(d)miR-25 inhibitor,(e)NC,(f)Histogram of cellular apoptosis,apoptosis rates were indicated with ODs±SEM.OA chondrocytes non-transfected with miR-25 act as Control group,*P<0.05,#P>0.05 vs.control

总而言之,试验结果表明miR-25延缓了OA疾病进展,抑制OA细胞凋亡和促进细胞增殖。MiR-25进一步研究,可能对OA发病机制有新的认识和提示OA新治疗策略。