走近细胞知识点总结

走近细胞知识点总结（2篇）

1.走近细胞知识点总结 篇一

细胞生物学目录

第一章

绪论

第二章

细胞生物的研究方法和技术 第三章

质膜的跨膜运输 第四章

细胞与环境的相互作用 第五章

细胞通讯 第六章

核糖体和核酶 第七章

线粒体和过氧化物酶体 第八章

叶绿体和光合作用

第九章

内质网，蛋白质分选，膜运输 第十章

细胞骨架，细胞运动 第十一章

细胞核和染色体 第十二章

细胞周期和细胞分裂 第十三章

胚胎发育和细胞分化 第十四章

细胞衰老和死亡

第一章

绪论

1.原生质体：被质膜包裹在细胞内的所有的生活物质，包括细胞核和细胞质

细胞质：细胞内除核以外的原生质，即细胞中细胞核以外和细胞膜以内的原生质部分

原生质体：除去细胞壁的细胞

2.结构域：生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域 3.装配模型：模板组装，酶效应组装，自组装 4.五级装配：

第一级,小分子有机物的形成

第二级，小分子有机物组装成生物大分子

第三级,由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构

第四级,由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器

第五级，由各种细胞器组装成完整细胞 6.支原体：目前已知的最小的细胞

第二章 细胞生物的研究方法和技术

1.显微镜技术：光镜标本制备技术、2.光镜标本制备技术步骤：样品固定、包埋与切片、染色

3.电子显微镜种类：透射电子显微镜，扫描电镜，金属投影，冷冻断裂和冷冻石刻电镜，复染技术，扫描隧道显微镜

4.细胞化学技术：酶细胞化学技术，免疫细胞化学技术，放射自显影 5.细胞分选技术：流式细胞术

6.分离技术：离心技术，层析技术，电泳技术

第三章

质膜的跨膜运输

1.细胞功能：外界与通透性障碍，组织和功能定位，运输作用，细胞间通讯，信号检测 2.膜化学组成：膜脂，膜糖，膜蛋白 3.膜脂的三个种类：磷脂，糖脂，胆固醇

4.脂质体用途：用作生物膜的研究模型，作为生物大分子与药物的运载体

5.膜糖功能：细胞与环境的相互作用，接触抑制，信号转导，蛋白质分选，保护作用。6.膜蛋白类型：整合蛋白，外周蛋白，脂锚定蛋白

7.膜蛋白功能：运输蛋白，酶，连接蛋白，受体（信号接受和传递）8.不对称性的研究方法：冰冻断裂复型，冰冻蚀刻

9.膜流动性研究方法：质膜融合，淋巴细胞的成斑成帽效应，荧光漂白恢复技术 10.膜流动性的重要性：酶活性，信号转导，物质运输，能量转换，细胞周期 11.影响膜脂流动性的因素：脂肪酸链，胆固醇，卵磷脂/鞘磷脂比值

12.影响膜蛋白流动的因素：整合蛋白，膜骨架，细胞外基因，相邻细胞，细胞外配体、抗体、药物大分子 13.膜骨架的主要蛋白：血影蛋白，肌动蛋白和原肌球蛋白，带4.1蛋白，锚定蛋白 14.转运蛋白质包括：载体蛋白，通道蛋白 15.协同运输的方向：同向协同，反向协同

第四章

细胞与环境的相互作用

1.细胞表面结构：细胞外被、膜骨架、胞质溶胶 2.细胞外被功能：连接，细胞保护，屏障

3.糖萼：由细胞表面的碳水化合物形成的质膜保护层，又称为多糖包被。4.细胞壁成分：纤维素，半纤维素，果胶质，木质素，糖蛋白

5.细胞外基质成分：蛋白聚糖（成分是糖胺聚糖），结构蛋白，黏着蛋白

6.透明质酸：细胞外基质中游离存在，在结缔组织中起强化、弹性和润滑作用，具有抗压能力

7.胶原的功能：是骨、腱和皮肤组织中的主要蛋白，起细胞外基因骨架作用；促进细胞生长；维持并诱导细胞分化。

8.弹性蛋白：是弹性纤维的主要成分，富含甘氨酸和谷氨酸。9.黏着蛋白的种类：纤粘连蛋白FN，层粘连蛋白LN 10.FN功能：介导细胞黏着，是细胞外基质的组织者，影响细胞的迁移

11.LN功能：是基膜的主要结构；介导细胞黏着于胶原，使之发生铺展；影响细胞迁移、生长、分化。12.基膜的组成成分：层粘连蛋白，巢蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸肝素糖蛋白

13.基膜作用：对组织起支持作用，调节分子通透性，作为细胞运动的选择性通透屏障 14.细胞识别中起作用的事糖被，引起细胞黏着的是膜蛋白

15.细胞识别系统：抗原—抗体的识别，酶与底物的识别，细胞间的识别，酶与信号分子的识别 16.识别反应三类型：内吞，细胞黏着，信号反应 17.钙黏着蛋白能通过它们所在的细胞类型进行区别：

E-钙黏着蛋白（表皮），N-钙黏着蛋白（神经），P-钙黏着蛋白（胎盘）18.斑块连接分为：黏着连接，桥粒 19.黏着连接有两种：

黏着带：细胞-细胞间 黏着斑：细胞与细胞外基质 20.参与黏着连接的组分：钙黏着蛋白，肌动蛋白，细胞质斑 21.黏着斑组分：整联蛋白，纤连蛋白

22.桥粒分为：桥粒（钙黏着蛋白），半桥粒（整联蛋白）

细胞是通过中间纤维锚定在细胞骨架上。

23.通讯连接：一种特殊的细胞连接，位于特化的具有细胞间通讯作用的细胞。方式：间隙连接，胞间连接，化学突触

第五章

细胞通讯

1.细胞通讯的一般过程：识别，信号转导

2.细胞应答包括：酶活性的变化，基因表达的变化，细胞骨架，通透性的变化，细胞死亡程序的变化 3.细胞通讯的方式：信号分子，相邻细胞表面分子的黏着，细胞与细胞外基质连接

4.细胞通讯的基本过程：①信号分子的合成 ②信号分子的释放 ③信号分子的传递 ④靶细胞与信号分子识别 ⑤胞外信号的跨膜转导 ⑥靶分子的激活和细胞应答的开始 5.信号分子分为：水溶性，脂溶性

6.信号分子与细胞通讯：糖分泌，化学突触，内分泌

7.信号分子种类：激素（内分泌信号），局部介质（糖分泌信号），神经递质（神经元信号）8.受体存在位置：细胞表面受体（水溶性），细胞内部受体（脂溶性）9.细胞内部受体的基本结构：C端配体结合结构域，中间结构域，N端转录激活结构域 10.细胞表面受体主要种类：离子通道偶联受体，G蛋白偶联受体，酶连受体。11.跨膜受体：

12.研究细胞表面受体的方法：单克隆抗体标记法，亲和标记法 13.两种信号转导类型：G-蛋白，酶活性。14.信号转导包括：磷酸化和去磷酸化 15.级联反应：

16.第二信使特点：仅在细胞内部起作用，能启动或调节细胞内稍晚的反应，五种（cAMP, DG, IP3，cGMP , Ca2+）

17.细胞质膜上最多，最重要的信号转 导系统：G-蛋白连接的受体

18.信号转导系统的三部分：七个螺旋跨膜受体，G-蛋白，效应物

19.G-蛋白连接的受体的两个主要结构域：外部结构域（识别信号分子），内部结构域（连接到G蛋白，调控某种结合酶的活性，产生第二信使）

20.效应物：接收信息后能够产生第二信使的物质

21.G蛋白的α亚基的三个功能位点：GTP结合位点，GTP酶活性位点，ATP核糖化位点 22.PKA中，第二信使cAMP的类型：激活型，抑制型

23.激活型系统的组成：Rs激活型受体，Gs激活型的G蛋白，效应物 24.抑制型系统的组成：抑制型受体，抑制型G蛋白（Gi protein）,效应物 25.PKA信号途径：产生cAMP，信号放大（蛋白激酶A的活化），信号的解除和抑制 26.被激活的PKA作用方式：使关键把酶磷酸化，调节基因表达

27.毒素影响cAMP信号途径：霍乱毒素（cholera toxin），百日咳毒素(pertussis toxin)28.信号系统的组成：受体，Gq蛋白，PLC-β（激活PLC，在PKA途径中激活AC）29.PKC途径的第二信使：双信号（DAG和IP3的产生）30.细胞如何调控Ca2+浓度？

①细胞中存在Ca2+泵可帮助细胞进行Ca2+调控

②细胞质膜的一侧有和Ca2+结合的位点，一次可结合两个Ca2+，结合后使酶激活，并结合上一分子的ATP，伴随ATP的水解和酶被磷酸化，Ca2+泵构型发生改变，结合Ca2+的一面转到细胞外侧，由于结合亲和力低的Ca2+被释放，此时酶发生去磷酸化，构型恢复到静止状态。

③当细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+同钙调蛋白结合，形成复合物，该复合物同抑制区结合，释放激活位点，泵开始工作。当浓度低时，CaM同抑制区脱离，抑制区又同激活位点结合，使泵处于静止状态。④另一种情况。抑制区的磷酸化从而失去抑制作用，反之，起抑制作用。32.信号的终止：DAG的水解，IP3的水解，Ca2+的水解

33.酶连接受体的特点:不需要G蛋白，而是通过受体自身的蛋白激酶的活性来完成信号跨膜转换。该通过对信号反应慢。与细胞分裂有关

34.酶连受体的结构：配体结合区，像PK的区域，催化区域

35.酶连受体类型：受体酪氨酸激酶，受体鸟苷环化酶，受体酪氨酸磷酸酶，受体丝氨酸激酶，酪氨酸激酶偶联受体。内源酶促活性受体

36.Ras的信号放大作用：蛋白活性改变，基因表达改变

37.趋同（convergence）:不同的信号因子作用于不同的受体，但能整合激活一个共同的效应物。(信号不同，受体不同，激活产物相同）

趋异（divergence）：相同配体，能转换激活许多不同的效应物，引起细胞不同反应。（信号相同，受体相同，效应不同）交谈（crosstalk）:不同信号转导途径间的相互影响。（信号分子不同，受体不同，效应相互交谈、影响。）38.信号终止的途径：信号分子的水解，受体钝化，受体的减量调节

第六章

核糖体和核酶

1，核糖体的rRNA基因：选择性扩增，转录，前体rRNA的加工和修饰，5S rRNA的合成和加工 2，前体rRNA加工修饰时，甲基化修饰主要部位在核糖第二位羟基上。3，RNA聚合酶Ⅰ参与rRNA三大亚基的转录

4，5S rRNA的合成和加工时，在核仁外进行，通过聚合酶Ⅲ转录

5，小亚基的rRNA和蛋白质的装配关系：组成核糖体的蛋白质和rRNA在大小亚基中均有一定的空间排布 6，核糖体在组装过程中，蛋白质与RNA的结合具有先后层次。根据rRNA结合的顺序，将核糖体蛋白分为两种：初级结合蛋白，次级结合蛋白

7，大肠杆菌的核糖体与叶绿体核糖体亚基重组后具有功能，线粒体的核糖体亚基同原核生物核糖体亚基相互重组后核糖体没有功能。

8，核糖体与mRNA结合的位点：SD序列

9，嘌呤毒素（puromycin）对蛋白质合成有抑制作用

10，N端规则（N-end rule）:多肽链N端特异性的氨基酸与半衰期有关 11，真核生物中的小分子RNA种类：snRNA（核内小RNA），scRNA（胞质小RNA）

12,反义snRNA在前体RNA加工中的作用：与特定的蛋白质形成核小核糖核蛋白，在真核生物的前体rRNA加工时候需要大量的snRNA的帮助，snRNA与rRNA进行互补形成的RNA-RNA双链部分可作为前体rRNA进行加工的标志

13，核剪接：发生在细胞核中，从前体mRNA中切除内含子，加工成熟的mRNA被运送到细胞质。遵循GU-AU规则

14，Ⅰ组内含子剪接特点：需要游离的鸟苷，存在于低等真核生物细胞核rRNA基因和真菌线粒体基因中。基因：前体rRNA、mRNA、tRNA 15，Ⅱ组内含子剪接特点：内含子转录后形成6个发夹环，遵循GU-AU规则，不需要snRNA参与，不形成剪接体，形成套索，存在的细胞器：线粒体和叶绿体。基因：前体mRNA

第七章

线粒体和过氧化物酶体

1，外膜功能：半透性。参与磷脂的合成，将线粒体基质中进行彻底氧化的物质先进行初步分解

2，内膜功能：高度不通透。ATP的合成和电子传递链参与氧化磷酸化。转运蛋白参与。合成酶类：合成DNA、RNA、蛋白质

3，膜间隙功能：建立电化学梯度

4，细胞内Ca2+作用？细胞如何调控Ca2+作用？（三个部位）

5，（12分）蛋白质合成后如何转运到细胞的不同部位?（三条途径：内质网 高尔基体 溶酶体，线粒体 叶绿体，核内）

6，Ca2+有哪些功能？（膜内：Ca2+泵，Na+-Ca2+交换器，膜外：内质网Ca2+泵，线粒体，细胞质基质中钙调蛋白）

7，细胞质中的核糖体在合成蛋白质时有两种可能的存在状态：游离核糖体（free ribosome），膜结合核糖体（membrane-bound ribosome）

8，蛋白质的两种转运模型：翻译后转运（post-translational translation）、共翻译转运（Co-translational translation）

9，free ribosome：前导肽leading peptide，转运肽transit peptide，导向序列targeting sequence，导向信号targeting signal 10.membrane-bound ribosome：信号序列，信号肽

11，线粒体转运肽 转运蛋白质的特点：受体，接触点，去折叠，消耗能量，转运肽酶，分子伴侣 12，前导肽的特异性：具有细胞结构的特异性，前导肽的不同片段含有不同的信息 13，如何证明信号肽引导蛋白质进入线粒体？

实验设计：无细胞体系合成酵母线粒体蛋白质，分离线粒体，与具有线粒体基质定位信号的前体蛋白温育，胰蛋白酶处理

14，线粒体内膜空间蛋白的定位：保守性寻靶，非保守性寻靶 15，线粒体内膜蛋白定位涉及：TOM复合体，TIM复合体，OXA复合体 15，线粒体功能：氧化磷酸化

16，电子载体种类：铁硫蛋白。黄素蛋白，细胞色素，泛素

17，内膜上的F1-F0颗粒是呼吸链中ATP合成的部位，是氧化磷酸化的偶联装置。18，F1-F0颗粒结构：head section，stalk section，membrane section 19，电子传递链分为：主呼吸链（包括复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ，从NADH来的电子依次经过这三个复合物，进行传递），次呼吸链（包括复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，来自FADH2的电子不经过Ⅰ）20，过氧化氢酶体的标志酶：过氧化氢酶

第八章

叶绿体和光合作用

1，叶绿体的形态：前质体，色素体，白色体，叶绿体，有色体 2，类囊体成分：蛋白质，脂质

3，叶绿体蛋白定位机理与线粒体相似：post translational translation

第9章 Endomembrane System，protein sorting and membrane traffic 1，膜结合细胞器生物意义：形成特定的功能区域和微环境，合理使用资源，集团化管理，提高工作效率 2，内膜系统特点：独立性（内膜封闭的区室，执行独立的功能），协作性（生化合成途径，分泌途径，内吞途径）

3，与生俱来的三种信号序列：寿命信号，加工信号，定位信号 4，膜系统研究方法：放射性自显影技术，用离心的方法来分离微粒体 5，内质网（endoplasmic reticulum）的种类： 粗面内质网（rough ER）：合成蛋白质。滑面内质网（smooth ER）：形成小泡

6，核膜与内质网关系：①外核膜上有核糖体附着 ②核膜与内质网想通 7，内质网的外表面：溶胶面sytosolic space 内质网的内表面：潴泡面cisternal space 8，特殊类型的内质网：肌质网sarcoplasmic reticulum 9，SER酶类：糖代谢酶类，脂代谢酶类，蛋白质的加工酶类，脱毒与相关的氧化酶 10，磷脂转运方式：①小泡-内膜系统 ②磷脂转运蛋白PTP 11，离体实验证明了信号肽的存在：RER小泡对产物的影响，蛋白水解酶实验，多聚核糖体的离体翻译实验

12，信号肽种类：N-端信号肽，内含信号肽

13，SPR（signal recognition partical信号识别特例）的三个功能结构域：翻译暂停结构域，信号肽识别结合位点，SPR受体蛋白结合位点

14，DP（Docking protein停靠蛋白）是SPR在内质网膜上的受体蛋白 15，跨膜信号和膜蛋白的方向： 分泌蛋白：起始转移信号

膜蛋白：终止转移序列，可切割的信号序列cleavable signal sequence，内部新号序列internal signal sequence 16，BiP蛋白：一类分子伴侣，在ER中有防止错误折叠的作用

17，蛋白质在ER中的加工修饰：二硫键的形成，N连接的糖苷化，羟基化修饰，GPI脂锚定蛋白 18，高尔基体的极性：CGN高尔基内侧网络（顺面，形成面，初级分选站），中间潴泡（加工和修饰），TGN高尔基外侧网络（外侧面，成熟面，分类包装）19，高尔基体标记酶：糖基转移酶

20，O-linked glycosylation氧连接的糖基化：将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基上。

21，溶酶体膜的稳定性：溶酶体的膜蛋白高度糖基化，膜上含有能促进膜稳定性的胆固醇 22，溶酶体标记酶：酸性磷酸酶（去磷酸化）23，次级溶酶体包括：自噬性溶酶体，异噬性溶酶体 24，溶酶体的生物发生：甘露糖6磷酸途径、非甘露糖6磷酸途径

25，溶酶体的酶上有个特殊标记：6磷酸甘露糖 M6P,高尔基体外侧网络通过对M6P的识别将溶酶体的酶分选出来。

26，溶酶体膜中的糖蛋白：β葡糖脑苷脂酶

27，溶酶体膜结合蛋白前体被合成的溶酶体酶：酸性磷酸酶 28，溶酶体的非M6P途径的信号：酪氨酸

29，溶酶体功能缺失造成的疾病：包涵体细胞疾病，休克，糖原贮积症 30，细胞分泌经过：内质网，高尔基体，脂膜plasma membrane 31，分泌种类：组成型分泌途径，调节型分泌途径

32，细胞内吞：吞噬作用（巨噬细胞，中性细胞），吞饮作用（液相内吞，吸附内吞）

33，内吞过程中受体与配体的命运：①受体再循环、配体被降解 ②受体与配体一起再循环（转铁蛋白结合铁离子的内吞作用）③受体配体都被降解 ④转胞吞作用

34，网络蛋白小泡的形成过程：披网络蛋白小窝，披网络蛋白小泡，有被小泡，无被小泡，分子伴侣hsc70蛋白参与该过程，需要ATP。Ca2+参与了包被的形成和去被的过程。35，网络蛋白小泡包括：网格蛋白，衔接蛋白，发动蛋白

36，COP被膜小泡的形成种类：ARF：装配反应因子，参与COPⅠ被膜小泡的装配。Sar1：参与COPⅡ被膜小泡的装配

37，膜合成的两种类型：自装配模型，膜扩展模型 38，脂锚定蛋白：糖脂锚定蛋白，脂肪酸锚定蛋白

39，初级内体：是由于细胞的内吞作用而形成的含有内吞物质 的膜结合的细胞器, 通常是 管状和小泡状的网络结构集合体。

40，次级内体中的pH呈酸性, 且具有分拣作用，次级内体又被称为CURL(compartment of uncoupling of receptor and ligand),意思是受体与配体非偶联的区室。)

10章Cell cytoskeleton细胞骨架 and Cell motility细胞运动

1，微丝功能：①作为支架，②在细胞中形成框架结构，③为细胞内物质和细胞器的运输运动提供机械支持，④为细胞的位置移动提供力，⑤为信使RNA提供锚定位点，促进mRNA翻译成多肽 ⑥是细胞分裂的机器，参与信号转导

2，细胞骨架研究方法：荧光显微镜，电视显微镜，电子纤维技术 3，根据结构，MT种类：单体，双联体，三联体 根据稳定性，分为：动态的短寿微管，稳定的长寿微管

4，MAP蛋白功能：①使微管相互交联形成束状结构 ② 促进微管聚合 ③作为分子发动机转运细胞物质的轨道 ④提高微管的稳定性 ⑤同微管结合能控制微管长度，防止微管解聚 5，分子发动机分为：驱动蛋白家族，动力蛋白家族，肌球蛋白家族

6，微管功能：①维持细胞形态 ②细胞内物质运输 ③鞭毛和纤毛运动 ④纺锤体和染色体运动 7，微管的装配：原纤维→微管核化→片状结构形成→MT形成→加GTP帽子 微丝的装配过程：成核，延伸，稳定状态

8，影响微丝装配核去装配的因素：G肌动蛋白临界浓度，离子影响

9，肌动蛋白的结合蛋白 种类 ：单体隔离蛋白，交联蛋白，纤维割断蛋白，肌动蛋白丝 去聚合蛋白，膜结合蛋 10，三类肌球蛋白结构：myosinⅠ和Ⅴ：钙调素轻链。运输作用 myosinⅡ：必需轻链，调节轻链。肌收缩，胞质分裂

11，微丝的功能：①硬粒纤维和微绒毛 ②运输 ③胞质环流 ④细胞运动（微丝的装配假说和滑动假说）⑤细胞质分裂 ⑥细胞形状的维持 ⑦肌肉收缩

12，中间纤维特点：①没有极性 ②是纤维状，不是球形 ③自发装配，不需要ATP和结合蛋白 ④受细胞周期调控 ⑤具有组织特异性，不同类型细胞含有不同的IF 13，中间纤维的装配：单体→二聚体→四聚体→3个四聚体组成原丝→8条四聚体结构 14，中间纤维功能：①提供机械支撑 ②参与细胞联接 ③维持核的形态

第十一章

细胞核和染色体

1，核转运系统：核蛋白，核定位信号，核输出信号，输入蛋白，输出蛋白

2，染色质和染色体，在化学本质上没有差异，在构型上不同，是遗传物质在细胞周期不同阶段的不同表现形式。

3，Z型DNA与细胞癌变有关

4，DNA结构稳定遗传的功能序列：ARS（自主复制序列，复制起始序列），CEN（着丝粒序列），TEL（端粒序列）

5，人工染色体：人工构建的含有稳定染色体的天然结构序列，即ARS、CEN、TEL序列的微小染色体，可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定遗传。6，组蛋白种类：H1、H2A、H2B、H4 7，H2A、H2B、H4的作用：与DNA组装成核小体

H1作用：在构成核小体时起连接作用，并赋予染色质极性 8，非组蛋白功能:参与染色体构建，参与DNA复制，调控基因表达 9，反式作用因子：转录因子，影响位于其他染色体上的基因的表达 顺式作用元件：控制下游基因转录，影响同一DNA分子上基因的表达

10，反式作用因子：锌脂结构基序，螺旋-转角-螺旋基序，亮氨酸拉链基序，螺旋-环-螺旋基序 11，核小体：是染色体的基本结构单位，146bp的DNA盘绕组蛋白八聚体1.75圈。12，巨型染色体：多线染色体，灯刷染色体，13，核仁的结构: 纤维中心，致密纤维组分，颗粒区。

14，核仁的功能：rRNA的合成，rRNA前体的加工，参与核糖体大小亚基的装配，控制蛋白质合成的速度。15，核基质功能：①与染色体构建有关，②是基因转录加工的场所 ③为DNA的复制提供支架 ④结构支持

第12 章 Cell cycles and Cell division 1，细胞类型：持续分裂细胞，终端分化细胞，休眠细胞 2，G1: 12h S：6~8h G2：3~4h M ：1h 3，细胞周期时间的确定：标记有丝分裂百分率法：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分率的方法测定细胞周期 4，细胞周期的研究方法：条件突变体，细胞周期同化（自然同步化，人工同步化）5，人工同步化：诱导同步法，选择同步法 6，诱导同步法：采用胸腺嘧啶核苷阻断技术，高浓度的胸腺嘧啶核苷能阻断DNA合成所需的核苷酸的合成。7，选择同步法：有丝分裂选择法（单层细胞培养），细胞沉淀分离法（悬浮细胞培养）

8，成熟促进因子MPF：M期细胞中存在的促进细胞分裂的因子。是由催化亚基和调控亚基组成的异质二聚体。

9，泛素介导的细胞周期蛋白的降解：E1：遍在蛋白活化酶。E2:遍在蛋白缀合酶。E3:遍在蛋白剪接酶 10，蛋白质的降解过程：一是进行标记，由泛素完成。二是蛋白酶解作用，由蛋白酶体催化 11，泛素调节的蛋白质降解过程：

①被降解的蛋白质与多个泛素分子共价结合，从而被标记 ②蛋白质-泛素共价结合的复合物与蛋白酶体顶部的帽子结合 ③泛素被切除。未折叠的蛋白质被送入蛋白酶体的腔 ④蛋白质在蛋白酶体中降解 11，APC（促后期复合物）的活性调节控制周期蛋白B的降解

12，三类周期蛋白-CDK复合物：G1期周期蛋白-CDK复合物，S期周期蛋白-CDK复合物，有丝分裂周期蛋白-CDK复合物

13，哺乳动物细胞周期的调控：

①G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D 表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录。②G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞进入S期。cyclinE的抗体能使细胞停滞于G1 期。③在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化，如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。④在中期当MPF活性达到最高时，激活后促进因子APC，将泛素连接cyclinB上，cyclinB 被蛋白酶体降解，完全一个细胞周期。

13，细胞分裂基因：酵母细胞的START（起始点），哺乳动物的R点或限制点（关卡）14，P53蛋白在细胞周期调控中的作用：抑制细胞周期，抑制DNA复制

15，MPF的作用机制：①使染色体凝聚 ②核被膜解体 ③高尔基体和内质网破碎 ④微管结合蛋白磷酸化

16，纺锤体微管类型：动力微管，极微管，星微管 17，中心粒：确定分裂极，形成纺锤体

18，染色体分离后期的两个阶段：后期A，后期B 19，力产生的两点机制~ 后期A：微管去聚合假说 后期B：纺锤体微管滑动假说 20，胞质分裂机制：MPF调节肌球蛋白和胞质分裂

21，减数分裂类型：配子减数分裂，合子减数分裂，孢子减数分裂

第13章 Embryo development and cell differentiation 1，受精作用：顶体反应（一级阻断）

皮层反应（二级阻断）

原核融合

2，受精后胚胎的早期发育主要包括：卵裂,胚泡形成，宫内植入

3，细胞决定子：从受精卵第一次卵裂开始，细胞核就受到内环境的影响，这些特殊的细胞质组分是细胞决定子。支配着细胞分化的途径。

4，胚胎诱导（embryonic induction）： 动物在一定的胚胎发育时期，一部分细胞影响相邻细胞使其向一定方向分化的作用。

5，转决定是一群细胞而不是单一细胞发生变化

6，持家基因house keeping gene：维持细胞最低限度功能所不可少基因。7，组织特异性基因tissue specific gene ：又是奢侈基因，因为这类基因与各类细胞的特异性有直接关系，是各种组织中进行不同的选择性表达的基因。

8，DNA重排：DNA片段在基因组中的位置变化，从一个位置变换到另一个位置。

9，同源异型基因homeotic gene：同一来源，决定不同器官。它们的突变使身体的一部分结合转变成另一部分。

10，控制果蝇发育的基因：母体基因，合子基因，同源异型基因。11，干细胞分为：胚胎干细胞，成体干细胞

12，成体干细胞adult stem cells，somatic cells：来自成体，未分化的细胞在某个机体内作的储备，可以更新自我，分化成各类组织或器官。

14章 Cell Senescence and Apotosis 1，衰老（senescing,aging）：是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程 2，人类面临的三种衰老：生理性衰老，病理性衰老，心理性衰老。

3，根据细胞寿命将细胞分为三类：①细胞寿命接近于动物的整体寿命 ②缓慢更新的细胞 ③快速更新的细胞

4，细胞死亡的两种形式：坏死性死亡，程序性死亡PCD 5，CDK（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制蛋白控制细胞质量。

6，细胞坏死Cell necrosis ：细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。

7，细胞程序性死亡programmed cell death ：又称细胞凋亡，指为维持环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，因而具有生理性和选择性。8，★内源性核酸内切酶的活化和表达造成的结果

9，程序性死亡的相关基因：程序性死亡抑制基因，程序性死亡促进基因 10，程序性细胞死亡的过程：死亡激活期，死亡执行期

11，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶cysteine containing aspartate specific：哺乳动物中，自杀性蛋白水解酶

12，caspase-3、6、7、8：在FAS/TNF介导的程序性细胞死亡途径中起作用。（FAS：NGF分子受体超家族成员。TNF：肿瘤坏死因子）

13，caspase-

9、3一起参与线粒体中Apaf-Ⅰ/细胞色素c介导的程序性细胞死亡 14，肿瘤坏死因子tumor necrosis factor , TNF 15，癌细胞的基本特征：接触抑制丧失，自分泌激活，细胞周期失控，细胞死亡特性改变，失去间隙连接，染色体异常，细胞骨架改变

16，原癌基因：是细胞内与细胞增殖相关的基因，当其基因的结构或调控区发生变异，成为癌基因。抑癌基因：

17，原癌基因产物：生长因子，生长因子受体，信号转导组分转录因子，抗凋亡蛋白，细胞周期控制蛋白

2.超全干细胞重点知识总结 篇二

一、干细胞(stem cells)与个体发育

正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官,这是一个彼此协调而又制约的复杂过程,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program),被记录在细胞基因组的结构中。不同物种有不同的遗传程序,这可能是物种在长期进化过程中逐渐形成的。

在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞。干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,这过程即是所谓细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。干细胞在胚胎和成体组织内部的活动,包括干细胞基本特性的分子机制和调节控制、胚胎细胞的迁移活动、时空程序与相邻胚胎细胞的相互作用,对细胞增殖和分化的关系等,虽已有所了解,但由于技术上的原因,直接证据还很少,因此,干细胞增殖和分化问题仍是今天发育生物学研究的主题内容之一.二、干细胞的定义和分类

因干细胞是指一类具有自我更新和产生分化后代这两种基本特性的细胞。一个充满生命力的雌雄两性机体都是由两类不同的组织和器官构成的。一类是全部由体细胞组成的,另一类是以生殖细胞为主的,也包括一些由体细胞组成的组织和器官构成的。前者是执行机体生命活动各种生理功能的;后者一切都为了保证生殖系统的卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命的。对人类来讲,从一个受精卵的单细胞要产生200多种不同类别的细胞来构成各种组织和器官,必然要靠全能性的早期胚胎干细胞通过自我更新和产生分化后代来实现的。

自我更新是指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化后代指的是干细胞还可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,而另一个是遗传特性有所不同的,要开始走上分化道路的定向祖细胞。早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,这包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞;而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。

干细胞可分为两类:一类干细胞包括从早期囊胚ICM(inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cells,简称ES细胞)和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,简称EG细胞);另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为组织干细胞(tissue stem cells),又称成体干细胞(adult stem cells)。

三、胚胎干细胞研究简史

哺乳动物早期胚胎体积小,又在母体子宫内发育,因此,要在体内对各类干细胞的分化及其机制进行实验研究几乎不可能。从20世纪50年代开始,人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全能性(totipotency)或多能性的(pluripotency)并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20世纪50年代末美国发育生物学家Stevens(1967)将着床前发育阶段的小鼠胚胎(包括受精卵)或12天胚龄的胚胎生殖嵴异位移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系,揭开了胚胎性干细胞早期研究的序幕。EC细胞既具有恶性生长又具有早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。在20 世纪70年代, EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型,并取得了一些重要结果。后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。

20世纪80年代初,英国Evans和Kaufman以及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系,开创了ES细胞生物学研究的新时代。但此后ES细胞在其他动物上的分离和建系却颇受挫折,直到20世纪80年代后期才有所突破,见表 19.1。20世纪90年代初,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系,同一时期,少数其他动物也相继建立了ES或EG细胞系。1998年美国威斯康星大学Thomson等人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养后,首次成功地建立了5株人类ES细胞系,同年, John Hopkins医学院Shamblott等人从5-9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。第二节胚胎干细胞

胚胎干细胞又称ES细胞主要是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞简称EG细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞,其最基本的重要特性是具有稳定地在体外自我更新并保持不分化和发育的多能性,即可以在体外分化为属于3个胚层的各种细胞。

一、ES和EG细胞培养、建系技术

体外培养建系ES和EG细胞的技术以小鼠的最为成熟,成功率最高,其基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题。目前常用的细胞分化抑制物主要有3种:饲养层细胞(feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium),如BRL(Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF),如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)。此外,也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,例如,白介素6(lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同样可达到维持小鼠ES细胞的不分化状态。因此,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类:饲养层培养法和无饲养层培养法。(一)饲养层细胞培养法

不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞。

不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。常用的饲养层细胞有下列两种:一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc(days post coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF)。经丝裂霉素C(mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM小鼠(S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷(ouabain, O)有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(LIF)。此外,SLCM)。一般以2-3份上述细胞条件培养液加120%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但往往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高,因此,正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES/EG细胞建系初期仍是成功的一个关键因素。(三)ES和EC细胞的体外培养 1.ES细胞

不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,例如,猪ICM细胞生长与小鼠的不一样,其生长速率很慢,且有一个休眠(quiescent)时期。因此,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。例如,一般小鼠多选用3-4 d的囊胚或210 d 的囊胚,绵羊取8-9 d的囊胚,人和牛取7-8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。

基本培养液为含15%4.5 dpc的小鼠囊胚主要由己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC),能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H10.5 dpc小鼠胚胎,在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织，以0.02% EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织, 37 0C , 15 min。吸管轻吹打散,接种于铺有MEF或STO饲养层细胞的4孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,480和GCTM-2抗体均可起反应。人与猴是近亲,因此,人与猴的ES细胞都表达 TRA分子,而啮齿动物小鼠却缺(见表19.2),推测TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记。

Oct-4是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都表达Oct3 d更换培养液,50 d后,这种拟胚体发育成软骨细胞,经Alcian blue液染色,显示出明确的软骨细胞特征,细胞间存在着11型胶原。小鼠ES细胞经过拟胚体阶段,结合无血清和多种生长因子、有丝分裂原处理,可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结构。近来利用人ES细胞经过悬浮培养获得胚体,再经如bFGF等生长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征的胰岛β样细胞,为临床糖尿病的细胞治疗提供了β细胞来源打下基础。

ES细胞定向诱导分化为肝细胞已有少数几篇报道。国内蒯小玲等成功地用RA、肝细胞生长因子(HGF)、β-神经生长因子(β-NGF)共同添加至细胞培养液,被诱导分化细胞从形态学、生化和肝细胞功能性标记等指标都证明是具有功能性的肝细胞。但仅使用RA,虽能分化为上皮样细胞,可是并不表达各种肝功能的生化指标,例如,白蛋白、AFP、G-6-P、α1-AT、肝核因子-4和SAPK/ERK激酶-1(SEK1)等,表明 HGF和β-NGF是诱导小鼠ES细胞分化为功能性肝细胞的重要因子。在现阶段,通过不同的诱导途径可将ES细胞诱导成肝细胞。但体外诱导,体内诱导以及体内外相结合的诱导分化,总的来看, ES细胞定向分化为肝细胞的分化率和在体内与正常肝的嵌合率都还不高,这是一个急需解决的问题。

由于ES细胞易进行遗传操作,近年日本科学家Toyooka将标记基因GFP或lacZ定点敲人(knock in)ES细胞Mvh基因(在生殖细胞分化中特异表达的基因)位点,用以ES细胞体外分化期间追踪生殖细胞的产生。体外ES细胞形成拟胚体时,出现Mvh阳性的生殖细胞,与分泌骨形态发生蛋白(BMP4)的细胞共培养下,可促进这种Mvh阳性生殖细胞分化。将这种Mvh阳性生殖细胞接种人CD-1(ICR)裸鼠辜丸被膜下,可进一步分化成熟为精子。同年早些时候,美国Hubner等人也报道了小鼠ES细胞在体外可发育为进入减数分裂期的卵原细胞(oogonia),在体外观察了卵子发生(oogenesis)过程。第三节成体干细胞

20世纪初, Pappenheim根据对骨髓中的造血细胞发生过程的形态学观察,提出了骨髓中存在着未分化干细胞的设想,认为未分化的干细胞通过各个中间阶段的前体细胞最终生成成熟的多种类型血细胞。第一次提出了成体干细胞(adult stem cell)的概念。成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞的干细胞,故又名组织干细胞。实际上,成体组织中存在干细胞是个体发育进化史的产物, 涉及组织器官的再生能力和创伤修复等基本特性。例如,骨髓组织的造血干细胞可分裂、分化为血液系统的各种细胞,定期补充细胞成分或失血。小肠和皮肤中的干细胞也分别能分化、补充和更新小肠和皮肤组织的一些细胞。传统的观点曾认为,干细胞一旦分化成熟,就不再分裂增殖了;人体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏的组织干细胞有一定的再生能力外,其他组织器官例如神经组织基本上不再具有再生能力。同时也认为在成体中存在的、属于某组织器官的成体干细胞是专能或限能的,例如造血干细胞只能分化为血液系统的各种细胞等。但是,新近的研究表明,这些成体干细胞的发育潜能可跨越组织或胚层的界限。例如,从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植入经X射线照射过的小鼠骨髓部位,则分化出血液细胞。此后,发现人和小鼠的神经干细胞具有分化为肌细胞和胚胎多种组织细胞的潜能。看来,神经干细胞随着微环境条件的改变,其分化潜能会有所变化。因此,神经干细胞同样具有可塑性,能分化为非神经类型的细胞。人们把成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的这一特性称为干细胞的可塑性(plasticity)或跨越分化(transdifferentiation).这些新概念从根本上动摇了早先经典的关于组织干细胞分化的胚层限制理论。成体干细胞分化的多能性表明：当机体需要的时候,细胞的命运不是一成不变的。成体干细胞可以“多向分化”的多潜能性的发现,不仅从理论上改写了“组织特异性干细胞只能向特定方向分化”的传统概念,而且还为许多疾病的细胞治疗提供了新的思路和有希望的前景。

目前,比较一致的看法是：成体干细胞是一种处于尚未终末分化的、处于干/祖或前体细胞状态的成体细胞,它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。在正常生理条件下,倾向于分化成并更新所在组织的各种细胞。但在特定的外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞能超越该特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞,补充参与其他组织损伤的修复等。

一、成体干细胞具分化可塑性

在成体干细胞的研究中,近年来最重要的发现是干细胞具有可塑性(plasticity)。证据大多数来自小鼠的实验,人们确信机体中成体干细胞的可塑性现象具有普遍性。(一)骨髓干细胞

骨髓是由不同类型多种细胞成分组成的组织,除了分化的血细胞和间质细胞外,其中主要有二类成体干细胞：一类是造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC),能生成各种血细胞;另一类是间质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC),能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等。一些实验室通过全骨髓移植实验证明,骨髓中的细胞在不同微环境的位点,除了形成各种血细胞和衍生于间质干细胞的各类细胞外,还可以被诱导分化为神经细胞、肌细胞、骨和肝细胞等外、中、内3个胚层的不同类型的分化细胞(表19.4)。证明骨髓组织中含有的干细胞具有多潜能性,在特定的条件下可跨越组织或胚层分化的能力,能够分化为内皮、神经元、胶质细胞和肝细胞等。

目前已知道骨髓中存在着造血干细胞(HSC)和间质干细胞(MSC)两类干细胞,为区别这两类干细胞在分化潜能上的不同,便把骨髓干细胞分离和纯化。体外培养的骨髓细胞,HSC细胞呈悬浮集落生长;而MSC细胞则贴壁生长,通过换液很容易把两者分开。发现两者也都具有多潜能性。

1.间质干细胞

从骨髓组织分离的MSC细胞在体外单独培养时,经证明具有分化为包括骨细胞、软骨细胞、腱、脂肪细胞和肌细胞等潜能,也能分化成内皮细胞和内胚层的肝细胞。MSC细胞移植至脑中,可分化为非间质细胞性质的神经细胞,特别是神经元、神经胶质细胞。当MSC细胞注射入早期囊胚,然后移植入假孕母鼠,分析嵌合体动物,发现MSC细胞可参与大多数(但不是所有)体细胞类型的分化;当MSC细胞移植入正常宿主时,则除了肝、肺和肠的上皮外,主要分化为造血细胞的谱系世代。当MSC细胞移植入小量射线照射的宿主,则造血系统和胃肠道组织有所增加。

2.造血干细胞

在成体干细胞中,HSC细胞是研究得最早和最多的一种异质性很强的干细胞。由于已知HSC细胞表面存在着一些标志,可用流式细胞仪或免疫磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出HSC细胞。经移植至不同的体内微环境,可分化为三胚层的各种类型细胞,包括心肌、骨骼肌、血管内皮系统,肝细胞、肺泡、食管、肠道、胃、胆管以及皮肤和神经细胞等。因此,骨髓中的HSC与MSC一样,分化潜能具有很大的可塑性,可分化为跨越胚层的各种类型细胞。HSC细胞在体外培养时,发现血细胞系之间,即淋巴细胞系与髓性细胞系之间和系内也存在分化方向的转变。

(二)神经干细胞

受经典的造血发生和无脊椎动物神经发育研究的启示,发现了神经干细胞。起初,把神经发育过程中未成熟的、增殖中的各类细胞称为神经前体细胞(progenitor cell)。因此,神经干细胞是神经系统中一类能自我更新并产生神经元和神经胶质细胞的前体细胞。早期研究是从哺乳动物胚胎的中枢神经系统和周围神经系统开始的,确证了胚胎的神经系统中普遍存在着这类神经干细胞。其后,进行成体神经干细胞分离,发现成体神经干细胞主要存在中枢神经系统的2个神经发生区域：即脑的海马区(hippocampus)和次脑窒区(subventricular zone, SVZ)以及包括脊髓等其他一些非神经性的区域。

总而言之,神经干细胞或神经前体细胞在个体发育过程中,经受发育上的时空变化,成体神经干细胞的可塑性受到限制。通过个体不同发育阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位,可以发现,神经干细胞移植物分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖性,成体中的神经干细胞分化潜能随发育遂受到限制。用成体中枢神经系统的干细胞经体外培养扩增的移植实验表明,其在成体微环境中尚有一定的可塑性。例如,成体脊髓衍生的干细胞通常不产生神经元,若注人成体脑的海马区,则能产生神经元;成年海马衍生的干细胞移植入SVZ,则能产生嗅球神经元。然而,至今却没有直接证据表明成体神经干细胞分化为如在胚胎中正常产生的有突触的神经元。当然,移植的神经干细胞或神经前体细胞在宿主不同部位也会受到所在微环境各种因素的相互影响;神经干细胞经体外不同方式处理后移植至宿主体内,也可能会改变其分化行为和表型。

倘若神经干细胞分化潜能被限制,这些限制能否撤消?即成体干细胞能否重新获得如在胚胎正常所产生各类细胞的能力?现有的研究资料表明,把体外培养的SVZ干细胞生长成神经球通过注射入鸡胚神经嵴(neural crest)途径,其分化潜能有所扩大,可产生周围神经系统。另外,神经干细胞的子代也有可能恢复发育多潜能性。例如,通常唯一产生神经胶质细胞的视神经O2A中枢前体细胞在体外可恢复其多能的、产生中枢神经系统的干细胞。表明环境因子能改变神经干细胞的命运或增加其可塑性。(三)肝干细胞

由于肝干细胞本身缺乏特异性标志,给肝干细胞分离和鉴定带来了困难。人们对肝干细胞存在与否一直有争论,直到最近才得以确认。早在1958年, Wilson JW等人认为“肝组织中存在着干细胞”,其依据是肝组织因营养损伤或部分切除时仍能再生,但已存在的肝细胞不能分裂和再生,因而,新生的肝细胞只能来源于肝干细胞。肝癌发生的研究也支持了肝干细胞存在的假设。化学致癌实验时,位于门管周围的小细胞发生增殖,这种具有卵圆形细胞核、少细胞质的细胞称为卵圆形细胞(oval cell)。在人的肝组织中,同样发现这种卵圆形细胞。对发育中的肝具有自我更新能力的细胞进行单克隆培养和分析,证明这种卵圆形细胞在体外能大量增殖,细胞移植后在形态和功能上可分别分化为肝细胞和胆管上皮细胞,表明肝卵圆形细胞是肝干细胞,具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双潜能性。近来发现,骨髓和血液中的细胞能分化为肝细胞,因此,肝干细胞来源可能有两条途径：一是肝组织外的来源,近年越来越多的资料证明,骨髓和血液是卵圆形细胞的来源,人的骨髓细胞也能分化为肝细胞和胆管上皮细胞;二是肝组织内处于休眠期的肝干细胞。双潜能的肝干细胞同时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物,细胞角蛋白CK7 和CK19为胆上皮细胞的特异性标志;白蛋白和肝代谢酶细胞色素P450可作为肝细胞的特异性标志物;而细胞角蛋白CK8和CK18在肝实质细胞和胆上皮细胞都有表达。角蛋白CK14可区分单层和复层上皮细胞。OV-6抗体是啮齿类卵圆形细胞的特异性标志物,但不是人肝干细胞的标志,原因不清楚。肝干细胞一般除了其特有的形态学外,常结合上述特有标志通过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。

双潜能卵圆形细胞不仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,当分别移植到胰腺和十二指肠时,还能跨越组织各自分化为胰腺细胞和肠上皮细胞。表明肝干细胞在适当的微环境能被诱导分化为仍是内胚层其他组织的细胞。但还未见有跨胚层分化的直接例证。但是,利用胚胎的肝组织在体外培养则大量生成血细胞,但很难说明这些血细胞就是来自肝干细胞,很可能这些血细胞是来自胚胎肝组织中混杂的造血干细胞。卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。国内外曾有报道,在培养液添加适当的分化诱导剂,如丁酸钠或二甲基亚砜,可诱导和促进肝干细胞分化为肝细胞。在培养液中添加转化生长因子β(TGFβ)或肝细胞生长因子(HGF),可诱导肝干细胞分化为胆管上皮细胞。因此,结合细胞分化诱导物等培养条件,有可能使肝干细胞定向分化为肝细胞或胆管上皮细胞。(四)骨骼肌干细胞 肌肉的生长、更新和修复是与肌纤维周围的卫星细胞(satellite cells)有关,故一般认为这就是骨骼肌干细胞。近年证明,从肌肉分离的干细胞不仅能分化出肌肉,还能产生血液细胞成分。Jiang等人从3天龄的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养骨骼肌细胞,得到一类被称为多能成年前体细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)的细胞。这种细胞具有类似于小鼠骨髓MAPC的表型和特征,能在体外增殖。肌肉来源的MAPC在体外特定的细胞因子条件下可被诱导分化成内皮、肝细胞样细胞和包括进一步分化为神经元及神经胶质样细胞的神经外胚层细胞。表明骨骼肌组织中确实存在着干细胞,并具有分化的可塑性。

二、成体干细胞研究中的问题(一)异质性

实际上,成体干细胞在组织中的所含数量极少,又缺乏特异性检测标志,很难从组织中将其分离纯化出来。因此,在一些成体干细胞“可塑性”的实验中,人们质疑所谓“可塑性”可能是组织中混杂着几种或一群不同类型的干细胞而分化的结果,这在骨髓组织的干细胞实验中更为明显。在肝细胞谱系分化的各类祖细胞中,就发现存在着异质性(heterogeneity)和可塑性。干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生相同或类似的表型。异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。造血干细胞异质性早已被证明。从骨髓肌干细胞的研究中发现,这类所谓的肌干细胞在特定环境下分别分化出肌肉和血细胞,其实这是由含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。这一实验结果使得成体干细胞“可塑性”理论受到质疑和动摇。

人们也曾设想成体组织中存在着类似胚胎干细胞那样的多能性干细胞。Zuk等人(2001)发现,从人体脂肪组织来源的干细胞可分化为肌肉、骨和软骨。但该作者指出不排除该组织中混入了诸如随血流循环进人脂肪组织的造血干细胞(HSC)或其他类型干细胞的可能性。因此,无法确证这类分化为肌肉、骨和软骨的就是“脂肪干细胞”。也有人相信“来源于肌肉组织的多能干细胞”其实就是随血液循环迁移或过客(itinerate)而停留在肌肉的造血干细胞。因为当这些细胞被移植入动物体内,在内皮细胞生长因子等细胞因子的剌激下,会被重新激活而分化为血细胞。甚至估计小鼠体内有100-400个HSC细胞处于这种状态。目前还不能确定成体干细胞的可塑性是否因干细胞异质性直接所致,因此,要明确一种干细胞与其组织来源及归宿之间的确切关系,还得进行大量的研究。(二)干细胞所处的环境

小鼠造血干细胞和胰腺干细胞都能分化出肝细胞并能修复小鼠受损的肝组织。但是,移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小鼠受损肝组织的效果远远不如移植成熟肝细胞本身。看来干细胞所处环境的信号对于细胞分化有重要影响。特殊稳定的微环境可以控制造血干细胞生长和分化,这种微环境在早期被称为壁鑫(niche)。现在微环境定义为能容纳一个或多个干细胞并能控制其自我更新和分化的组织细胞和胞外基质的组合。它是由各种调控活性成分组成的空间,细胞间保持的距离以及局部的近距离调控正适合于细胞间相互作用。从视网膜再生研究中发现一个很有趣的现象。将视网膜祖细胞分离出来在体外培养一些时间后,分化为视网膜感受器细胞。如果从小鼠眼中分离的干细胞移植入正常小鼠视网膜,它们将不能分化和被整合入正常视网膜;而当移植入损伤的视网膜中,则分化为感受器细胞,并整合入该受损组织,尽管尚未确证这类整合入的细胞是否具有正常细胞的功能,但组织环境确实对干/祖细胞的命运有决定性的作用;同时,也不可忽视干/祖细胞本身对所处环境信号的反应能力。众所周知,脊髓产生的运动神经元具有对来自各组织的信号具有反应的能力;从鼠脑中获取的神经干细胞在体外因中断了来自大脑的信号刺激,故在体外培养条件下,只能一过性地分化为多巴胶能神经元,不能维持长久的多巴胶能神经元的功能。因此,干细胞与所处的细胞环境之间精巧而默契的协调作用可能是干细胞“可塑性”的重要原因之一。(三)成体干细胞可塑性的调控

目前认为,人们对成体干细胞“可塑性”现象的解说有4种：①机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体,分别能定向地向各自的组织来源的细胞分化。②机体中存在着一种多潜能的成体干细胞,在不同的微环境信号的刺激下,可向不同组织的细胞方向分化。③某特定组织来源的成体干细胞,除了向该组织的细胞成分分化外,在特殊信号的剌激下,可重新编程(reprogramming),继续分化为其他类型的细胞。④某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合,成为具有来自2种细胞的遗传物质,染色体数量也是正常2倍的“杂交细胞”。但使前者具有了后者的分化潜能,因此,成熟的干细胞也许无法变成不同类型的细胞,但它们可自动与现有的干细胞融合,形成其他组织类型的细胞。例如神经干细胞与造血干细胞融合,从而“变性”为血液干细胞,分化为各类血细胞。

正如上所述,干细胞的“可塑性”一方面与其所处微环境密切相关,即受到外源性因素调控;另一方面也受到成体干细胞本身对这类外来信号做出反应的固有特性即内源性因子调控。外源性因素通常指各种体液因子、邻近同种或异种细胞的直接接触、细胞外基质等的作用。至今大多数干细胞的可塑性研究是基于组织损伤而造成的微环境,因而人们正把注意力集中在组织损伤后的微环境对干细胞的调控作用。

在内源性调控机制中,一般认为转录因子在其中起着重要的作用。细胞分化中,一个已明确定向分化程序的谱系特异性转录因子过表达会致使该谱系特异性转录因子功能发生颉顽作用,并使原有的基因程序活性保持沉默。这样,这类细胞对微环境中特定细胞因子的反应是分化成另一类新细胞。例如,在成肌细胞分化中,转录因子MyoD和Myf5起着调控成肌细胞调控因子(myogenic regulatory factor, MRF)网络中的颉顽作用。在成纤维细胞中, MyoD的过表达可致使这类细胞转变为成肌细胞,同时, Myf 5又抑制成肌细胞的分化活性。然而,在某些情况下,这一过程却是可逆的。在转基因C2C12细胞的肌管形成中,同源异形框基因的异位表达降低了成肌细胞调控因子MRF和MyoD表达水平,致使多核的肌管去分化而转变成单核的细胞, 进一步再分化为软骨细胞、脂肪细胞等中胚层类型的细胞。(四)分化细胞的功能

目前成体干细胞包括“可塑性”的研究的结果大多数是基于检测新生组织中终末分化细胞的特定蛋白或标记的表达,很少直接论及到终未分化细胞的生理功能。然而,有的不同类型的细胞却具有相同的标记, 例如,内皮细胞与成熟血细胞亚群表面标志都有CD31,甚至HSC表面也有CD31,因此,选用CD31作为进行分析HSC能否分化为内皮细胞时,显然是不合适的。不少人对仅仅检测到某种标志就证明该细胞或组织具有正常细胞功能的做法常持有质疑;特别是干细胞的异质性和类型以及环境的复杂性使得人们对体外培养的干细胞移植入体内能否发挥预期功能表示怀疑。确实,目前在技术学上还无法适当地证明成体干细胞在所移植的组织或器官中产生出来的细胞具有功能性,例如,在研究帕金森氏病的动物实验中,体外培养的多巴胶能神经元移植入脑内,可观察到被整合入动物脑组织,但不能证明这些新的神经元是否具有完整的功能。因此,欲要确定供体干细胞的终末分化状态应该包括细胞表面标志鉴别和细胞功能确定这2方面因素。例如,神经干细胞移植后，“可塑”为血细胞,既要鉴定出分化细胞具有血细胞的表面标志,又要肯定使已接受致死辐射剂量照射过的受体小鼠存活并使造血功能恢复。只有这样,才能完整地确定干细胞的分化细胞特性和功能。(五)体外增殖

成体干细胞从某一组织分离、纯化后,目前,尚未有现成的能较长期在体外维持其未分化状态并大量增殖的方法。因大多数成体干细胞研究是用于再生医学作细胞治疗的目的,常设计使用两种手段:其一是将分离的成体干细胞直接移植入动物或患者的损害组织器官,以期在受损组织原位分化出该组织中成熟的功能性的细胞;其二是在体外将干细胞诱导分化为所需要的成熟细胞,而后将细胞移植入损害组织或器官。鉴于成体干细胞很难分离、纯化和体外培养,因而,目前这两种手段都不能奏效。一个典型的例子是将烫伤患者的、含有皮肤干细胞的健康皮肤切取下来,进行短暂体外培养,再重新植回患者的皮肤损害部位,发现尽管皮肤可愈合,但不能产生汗腺和毛孔,无法行使正常功能。由于在体内观察组织行为极为困难,而且得到的结果不确定因素较多,因而,继续探索成体干细胞体外培养和增殖的条件和方法,将是一项极为重要的课题。

第四节干细胞在再生医学中的应用

干细胞(包括胚胎干细胞)生物学研究的最新进展,使人们对干细胞独特的生物学特性有新的了解。成体干细胞的“可塑性”或“跨越分化”潜能的发现具有重要的理论意义和应用价值。不仅向传统的细胞分化和细胞周期理论提出了挑战,而且成体干细胞在细胞生物学行为上与癌细胞很相似,成了研究癌症发生机制新的生长点。在再生医学中可望利用成体干细胞修复创伤、疾病的细胞治疗并介入整形外科学和组织工程学等方面,其中除了神经干细胞作为脑损害的细胞治疗研究有较多的报道外,大部分工作集中在组织工程学领域,干细胞在生物和再生医学中的应用主要有下列4方面。

一、哺乳类发育的体外模型

如前所述,体内研究哺乳动物胚胎发育和各类细胞分化极为困难。干细胞,特别是ES细胞因其富具独特的发育全能或多能性质,在嵌合体动物中,ES细胞又能参与个体发育,并产生包括生殖系在内的各种类型细胞,表明ES细胞类似胚胎的ICM细胞,不仅具有完整的发育潜能性,而且也持有对调节正常发育所有信号的应答能力。在特定的体外培养条件和诱导剂共同作用下,ES细胞在体外可被诱导分化属于3个胚层谱系的各种高度分化的体细胞,例如神经细胞、肌肉、血细胞、上皮细胞和成纤维细胞等。同时,在这些细胞分化过程中,必然先经过一定的前体细胞阶段。因此,ES细胞不仅是研究特定类型细胞分化的模型,而且也是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系。可能ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同,但在分子水平包括发育的遗传程序仍有共同或相似之处。小鼠的卵受精后的卵裂期较长,约 3天才到达16细胞期,进一步分裂,约在4.5 dpc时形成囊胚。这时胚胎出现第一次分化,产生以后参与胚外结构的滋养外胚层和原始内胚层。胚泡内约由20个左右细胞组成内细胞团(ICM)。胚胎进一步增殖和空腔化(cavitation),约在5.0 dpc时逐形成原始外胚层或上胚层(epiblast),后者在原肠期除了主要发育成胎儿本体的3个胚层组织外,还有部分细胞将来参与胚外中胚层的发育。悬浮生长的体外细胞拟胚体在结构排列上与在体胚体的有些不同,但一些类型的细胞分化秩序和方式却非常类似于在体的胚体。因此小鼠ES 细胞已被公认为是研究哺乳类发育较理想的模型。人ES细胞建系后,一些国家的法律和道德伦理禁止用于人体胚胎研究。但近来认识到,ES细胞本身缺乏胚外组织,不可能产生完整的胚胎。因此,许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下,已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞的体外实验那样,用于研究人类胚胎在体内所不能分析的发育、分化和调节信号等事件。这无疑将丰富、充实和完善人们对人类早期发育或畸胎发生等认识。

二、介导改造动物的基因

ES细胞介导的转基因优点明显超过常规如逆转录病毒载体整合至早期胚胎或显微注射DNA至受精卵原核等一般转基因方法,主要是因为在后一途径中,导人的多拷贝DNA存在着随意整合的问题,产生的转基因动物效果一般不太理想。利用ES细胞技术学的优点是在于产生一种新的经生殖系传递的转基因动物以前,可以通过在体外ES细胞系统中,研究和筛选外源DNA表达质粒的构建、整合和表达。从而可提高产生转基因动物的效率;同时,ES细胞在体外增殖迅速,可作为重组ES细胞取之不尽的来源;ES细胞的基因改造技术,如剔除(knock out)、敲入(knock in)能够精确地改造细胞内存在的基因,克服位置效应、插入失活和特殊内源性基因失活等弊病。重组ES细胞的基因组经生殖系传递途径,可不断地提供和产生同样基因型的、丰富的转基因动物的种子细胞来源。近年来,在制备转基因动物出现了一个新的策略利用体外培养的体细胞经外源基因转染后,取其细胞核显微注射至去核卵细胞,从而获得转基因动物,这一技术路线显然比直接显微注射DNA至去核卵细胞效果更好,特别是对那些至今还未建立ES细胞系但核移植已获成功的那些动物。

三、人体的基因和细胞治疗

干细胞生物学技术和理论的发展,促使医学产生了一门新的学科分支,即再生医学(regenerative medicine)。它是一门探索人体组织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力,并使用多种修复术手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复新兴学科。干细胞的基因和细胞治疗则是再生医学的重要组成部分之一。这里基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内,达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段,又称细胞治疗。人ES细胞经遗传操作后一般能稳定地在体外增殖传代,克服了目前基因治疗中需大量靶细胞来源的主要问题。