枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达（精选6篇）

1.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇一

枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达

借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析.结果显示该脂肪酶基因全长635 bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBI GenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性.将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达.SDS-PAGE电泳显示分泌表达的.脂肪酶分子质量约为21 kD.对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD_(600)值为1 8、乳糖诱导浓度为1 5 mM、摇瓶发酵10 h后大肠杆菌分泌表达26 0 U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本.

作 者：李海军 王林刚 王治泽 陈芳 高剑峰 Li Haijun Wang Lingang Wang Zhize Chen Fang Gao Jianfeng  作者单位：石河子大学生命科学学院,石河子,83 刊 名：生物技术通报  PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)： “”(3) 分类号：Q93 关键词：乳糖诱导   IPTG诱导   枯草杆菌   脂肪酶基因   分泌表达   Induction of lactose   Induction of IPTG   Bacillus subtili   Lipase gene   Secretory expression  

2.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇二

胸苷激酶在几种抗病毒药物前体以及抗癌药物的激活方面有重要作用[4]。另外, 近期研究[5,6,7,8,9]表明, 胸苷激酶是细胞增殖的标志物, 被证实在肿瘤的普查筛选、对进程为肿瘤疾病的患者区分检测、评价治疗是否成功、监测治疗效果、病程发展的预后指示、评估癌症复发风险等方面都具有重要意义。

胸苷酸是合成胸苷三磷酸的重要前体, 后者参与DNA的合成。它可由传统的化学方法合成, 但过程繁杂、污染环境。细胞内胸苷酸可以在胸苷酸合成酶作用下, 由尿嘧啶脱氧核苷酸甲基化而合成。以此途径在实验室合成胸苷酸极其繁琐。本文为得到胸苷酸, 构建可表达胸苷激酶的重组菌株, 以胸苷为底物, ATP为磷酸基团供体, 高效地合成胸苷酸。该方法较之传统方法, 简单、有效同时无污染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 、DH5α、p ET-28a (+) 载体为作者实验室保存;p MD-18T载体购自Ta KaRa生物技术公司。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TAKARA生物公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司;2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技有限公司;由上海捷瑞生物工程有限公司合成PCR引物;由上海美吉医药科技有限公司完成测序。其它试剂药品均为市售分析纯。

1.1.3 仪器

Agilent Technologies 1200series高效液相色谱仪;TechneTC412PCR仪;DYCZ-24D电泳仪;DYCP-31水平电泳槽;DYCZ-24D垂直板电泳槽;752紫外光栅分光光度计;JY92-Ⅱ超声破碎仪。

1.1.4 培养基

LB培养基 (g/L) :胰蛋白胨10g, 酵母粉5g, Na Cl 10g, p H7.0, 固体培养基中添加1.5%的琼脂。使用固体、液体LB培养基时, 按抗性添加硫酸卡那霉素或羧苄青霉素 (卡那霉素终浓度50μg/m L, 羧苄青霉素终浓度为100μg/m L) 。诱导时IPTG终浓度为1mmol/L。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增tdk基因

抽取大肠杆菌基因组, 并以其为模板, PCR扩增tdk基因。根据Gen Bank中报道的大肠杆菌胸苷激酶基因 (tdk) 序列, 设计PCR引物, PCR引物为:5’-CGGGATCCATGGCACAGC-TATATTTC, 3’-GCGAGCTCTTAATCGTGGCGA TGC。其中下划线标注部分分别为Bam HⅠ和SacⅠ限制性内切酶酶切位点。PCR条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s, 63℃退火30s, 72℃延伸1min, 共30个循环, 最后72℃延伸5min。PCR产物经0.9% (W/V) 的琼脂糖凝胶电泳后, 用DNA回收试剂盒回收。

1.2.2 表达载体的构建

将回收的PCR产物按比例与克隆载体p MD-18T连接, 把连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞, 经过阳性克隆筛选、酶切鉴定等步骤, 得到克隆载体p MD-18T-tdk, 把连有目的基因的重组菌株进行测序, 然后将测序正确的基因片段连接到p ET-28a (+) 上以构成表达载体p ET-28atdk。最后将表达载体p ET-28a-tdk转化入宿主菌BL21 (DE3) 中得到重组菌株DTK。

1.2.3 tdk的诱导表达及SDS-PAGE检测

将带有目的基因 (tdk) 的重组菌株 (DTK) 在37℃、200r/min条件下, 培养到OD值为0.6左右, 加入1mmol/L的IPTG作为诱导剂, 37℃诱导4~5h。将所得的菌液12 000r/min离心1min, 用50mmol/L Tris-HCl (p H 7.1) 重悬菌体, 并超声破碎, 将所得样品的各成分进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 胸苷激酶的酶活测定[10,11]

1m L反应液 (30μL的破碎菌液为粗酶, 5mmol/L的ATP, 5mmol/L的TR, 5mmol/L的Mg Cl2, 5mmol/L的DTT, 7mmol/L的Na F, 0.2mg/m L的BSA, 50mmol/L p H 8.0的Tris-HCl缓冲液) , 45℃下反应10min, 沸水浴加热5min终止反应, 反应后将反应液稀释100倍, HPLC检测TMP的生成量。酶活力单位定义为:一个酶活单位 (U) 即一定温度和p H条件下每分钟催化产1μg TMP所需的酶量。计算公式如下:

S1和S2分别为样品和标准品峰面积;P1和P2分别为样品和标准品的稀释倍数;M为标准品的浓度 (mg/m L) ;V为反应液的体积 (m L) ;K为常数 (103) ;t为反应时间 (min) ;m为粗酶的量 (m L) 。

按照上述方法和步骤, 测定胸苷激酶的酶活, 并探究不同温度 (25、30、37、45、50、55、65、75℃) 和p H (6.0、6.6、7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) 对酶活性的影响。

HPLC条件为:Hypersil SAX 5μm (4.6mm×250mm) , 50mmol/L p H 3.0磷酸-磷酸二氢铵缓冲液为流动相, 流速1m L/min, 检测波长254nm, 柱温25℃。

1.2.5 不同条件对胸苷酸合成的影响

反应体系如1.2.4, 探究不同条件 (反应时间、酶量、ATP浓度、底物浓度) 对胸苷酸转化率的影响。由HPLC图谱计算出不同条件下的胸苷酸的生成量, 并根据以下公式, 计算其转化率。

TR转化率=TMP生成量/TR加入量×100%

2 结果与分析

2.1 重组菌株的构建与诱导表达

以大肠杆菌K-12基因组为模板, PCR扩增tdk基因, 得到一条610 bp左右

的条带, 与理论预期相符。将tdk片段先后与克隆载体p MD18-T和表达载体p ET-28a连接, 用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切鉴定克隆载体p MD18-T-tdk和表达载体p ET-28atdk, 可分别得到大小为2 700bp左右的p MD18-T载体和600bp左右的tdk条带以及5 300bp的p ET-28a载体和600bp左右的tdk条带, 并且基因测序与Gen Bank中序列一致, 由此得到重组菌株DTK。

SDS-PAGE结果表明, 经IPTG诱导后, 胸苷激酶在重组菌DTK中表达明显 (如图1) , 由于胸苷激酶蛋白分子大小约为23k D, 加上p ET-28a自身表达的His Tag, 所以表达的蛋白分子量在26 k D左右, 与图1正好相吻合, 可断定该蛋白正是胸苷激酶蛋白。另外, 由图2可知, 表达的蛋白绝大部分为可溶性蛋白, 破碎沉淀中基本无蛋白存在。

2.3 胸苷激酶的酶活测定

分别测定含空载质粒的大肠杆菌和重组菌株的酶活, 结果表明:含空载质粒的大肠杆菌酶比活力为40.8U/mg, 而重组菌株的酶比活力为1 639U/mg, 相对于宿主菌, 酶活力提高了40倍。

2.3.1 p H对胸苷激酶活力的影响

按照1.2.4所示方法, 在45℃下, 反应10min, 测定胸苷酶在不同p H下的酶活, 缓冲液分别为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液 (p H 6.0、6.6、7.0) 、Tris-HCl缓冲液 (p H 7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) , 结果如图2。

由图2可知, 酶的活力在p H 8.0时达到最大, 此时, 酶比活力为1 654U/mg, 当溶液过酸或过碱时, 其酶活迅速降低。

2.3.2 温度对胸苷激酶活力的影响

按照1.2.4所示方法, 在p H 8.0的Tris-HCl缓冲液下, 反应10min, 分别测定其在不同温度条件下的酶活, 结果如图3。

由图3可以看出, 在45℃之前, 酶活力随着温度的增加而不断增大, 在45℃时活力达到最大, 比活力为1 579U/mg。再升高温度, 酶活力降低, 由于部分酶已开始失活, 当达到55℃时, 迅速降低, 当温度升高到75℃时, 绝大部分酶已失活。

M:protein marker;1:p ET-28a空载诱导;2:诱导前破碎;3:诱导后破碎;4:离心后培养基;5:破碎沉淀;6:破碎上清。M:Protein marker;1:Empty vector plasmid of p ET-28a after inducing;2:Sample of proteins before inducing;3:Sample of proteins after inducing;4:Medium after centrifugation;5:Precipitate of resuspended cells after sonication;6:Supernatant of resuspended cells after sonication.

■-磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液 (p H 6.0、6.6、7.0) ;●-Tris-HCl缓冲液 (p H 7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) 。■-buffer solution of Na2HPO4-KH2PO4 (p H 6.0、6.6、7.0) ;●-buffer solution of Tris-HCl (p H 7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) .

2.4 不同条件对胸苷酸合成的影响

2.4.1 反应时间对胸苷转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 添加量为30U, 在45℃、50mmol/L、p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 测定不同时间TR的转化率, 结果如图4。

随着反应的进行, TR转化率也逐渐增加, 当反应时间到100min后, TR转化率达到60.8%, 此后伴随时间的增加, TR转化率有缓慢增加, 基本已达到平衡。考虑到时间和效益, 把反应的时间定为100min, 此时TR的转化率可达到60%左右。

2.4.2 酶量对TR转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 在45℃、50mmol/L、p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 酶添加量依次为5U、10U、15U、20U、25U、30U、35U、40U和45U, 反应时间均为100min, 测定结果如图5所示。

由图5可见, TR的转化率随酶量的增多而增加, 当酶添加量达到30U时, 转化率趋于稳定, 再增加酶量, 转化率基本不变, 可达到61%。

2.4.3 ATP浓度对TR转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 酶添加量为30U, 底物TR添加量为5mmol/L, ATP添加量分别为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L和25mmol/L, 在45℃、50mmol/L、p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 随着时间进行定点取样, 探究随着时间变化, ATP浓度对TR转化率的影响, 结果如图6。

由图6可知, 随着时间进行, TR转化率逐渐增大, 最大可达到65%左右, ATP浓度为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L时, TR转化率相差不大, 但当增加至20mmol/L时, TR转化率骤减为30%, 当增加至25mmol/L时, 基本没有反应。

2.4.4 底物浓度对TR转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 酶添加量为30U, 底物浓度按照TR:ATP=1:1等比例增加, 添加量分别为1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L, 在45℃50mmol/L p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 随着时间进行定点取样, 探究随着时间变化, 不同底物浓度对TR转化率的影响, 结果如图7。

由图7可知, 当TR和ATP浓度均为1mmol/L时, TR转化率为30%左右;当TR和ATP浓度均5mmol/L时, TR转化率为60%左右;当TR和ATP浓度为10mmol/L时, TR转化率为50%左右;当TR和ATP浓度为15mmol/L时, TR转化率为25%左右;当TR和ATP浓度均为25mmol/L时, 基本没反应。由此可得, TR和ATP最适浓度均为5mmol/L, 此时, TR转化率可达到60%。

3 讨论

本研究主要是针对胸苷激酶, 目前关于胸苷激酶方面的研究很少, 主要是在病毒中, 它也主要应用于癌症、肿瘤的检测过程中。而在大肠杆菌中, 曾有人研究过胸苷激酶的活性与胸苷转移的关系。另外, 关于胸苷酸的合成的研究也很少, 传统方法主要是化学合成, 步骤繁杂、污染环境, 本研究主要是构建带胸苷激酶基因的重组菌株, 经诱导可表达胸苷激酶蛋白, 并利用它来高效地合成胸苷酸。较之传统方法, 更有效、环保、简洁。

结论主要如下:胸苷激酶的最适p H为8.0;最适温度为45℃左右。以胸苷激酶作为催化剂合成胸苷酸时, 每毫升反应液加入30U胸苷激酶, 胸苷和ATP浓度可控制在5mmol/L, 反应时间约为100min, 胸苷的转化率可达到60%以上。反应中提高ATP的浓度并不能增加胸苷的转化率, 相反过高浓度的ATP抑制了反应的进行。

参考文献

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3.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇三

龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用PCR扩增方法得到真核红藻-龙须菜藻红蛋白亚基基因序列,与其它6种已知红藻相应序列比较,显示了很高的保守性.在7株藻中p亚基比α亚基保守,α亚基倾向于小区域保守,而β亚基倾向于大片段的`保守.该蛋白必需氨基酸的含量较高.藻红蛋白亚基基因在大肠杆菌中达到了较高的表达量,诱导4小时,特异表达产物占菌体可溶性蛋白的44%,表达产物呈溶解状态,而两亚基可能是分别翻译的.

作 者：隋正红 张学成 作者单位：青岛海洋大学海洋生命学院刊 名：高技术通讯 ISTIC EI PKU英文刊名：HIGH TECHNOLOGY LETTERS年，卷(期)：11(7)分类号：Q949关键词：PCR 龙须菜 藻红蛋白 基因表达

4.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇四

从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T SimpleVector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化.经测序,构建的`克隆质粒pMD-MPT83与GenBank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Westernblotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功.

作 者：鲁俊鹏 罗满林 宋延华 邹潍力 LU Jun-peng LUO Man-lin SONG Yan-hua ZOU Wei-li 作者单位：鲁俊鹏,罗满林,邹潍力,LU Jun-peng,LUO Man-lin,ZOU Wei-li(华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642)

宋延华,SONG Yan-hua(广东温氏食品集团有限公司,广东,新兴,527439)

5.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇五

利用RT-PCR技术扩增了编码烟实夜蛾Helicoverpa assulta触角化学感受蛋白(chemosensory protein)的全长cDNA.克隆和测序结果表明,烟实夜蛾化学感受蛋白基因核苷酸序列全长384bp(GenBank序列号:DQ285667),编码127个氨基酸残基,预测N-末端包含16个氨基酸组成的信号肽序列,因此估测其成熟蛋白分子量为12.97kD,等电点为5.32.将该基因重组到表达载体pGEX-4T2中,并转入原核细胞中进行表达.SDS-PAGE和Westem印迹分析表明,经IPTG诱导后,烟实夜蛾化学感受蛋白基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条约39 kD的外源蛋白,与预测的`融合蛋白分子量大小相符.

作 者：蒋金炜 高素霞 安世恒 王琛柱 JIANG Jin-Wei GAO Su-Xia AN Shi-Heng WANG Chen-Zhu 作者单位：蒋金炜,高素霞,安世恒,JIANG Jin-Wei,GAO Su-Xia,AN Shi-Heng(河南农业大学植物保护学院,郑州,450002)

王琛柱,WANG Chen-Zhu(中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080)

6.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇六

迄今为止,昆虫中发现超过200多种昆虫抗菌肽类物质。根据分子结构的特点,昆虫抗菌肽可分为四类:1、天蚕素(Cecropins)类——形成两性分子α-螺旋的抗菌肽;2、昆虫防御素(Insect Defensins)类——有分子内二硫键的抗菌肽;3、富脯氨酸抗菌肽(proline-rich peptides);4、富甘氨酸抗菌肽(glysine-rich peptides)[2]。

双翅抗菌肽Diptericins存在于双翅目昆虫中,是近几年才发现的一类富甘氨酸抗菌肽,分子量为9kD,C端富含甘氨酸,N端富含脯氨酸,仅对少数G-菌有抑制作用。来自双翅目的富含Gly的肽通常带净的正电荷,这使得它们可以和微生物的细胞膜相互作用[3]。

因Gly分子量小,不具有侧链,推测该类抗菌肽中含量很高的Gly,尤其是双翅肽中五联Gly的存在对增强肽链的弹性、形成多变的空间结构及其广谱抗菌等可能起着重要的作用[4]。本文确定了富甘氨酸抗菌肽外源表达最佳条件,为富甘氨酸抗菌肽大批量生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒:

大肠杆菌BL21(DE3)、pET32a+为本室保存菌株和质粒, pET32a+ABP为本室构建。

1.1.2 主要试剂:

标准分子量蛋白Marker购自fermentas,其它常规化学试剂为分析纯以上产品。

1.1.3 仪器:

台式离心机(hitachi),HYG-Ⅱ恒温摇床,BIO-RAD RAC 3000电泳仪。

1.1.4 培养基:

LB培养基;LB+:LB培养基中加入0.3%的葡萄糖[5]。使用时加入氨苄青霉素至终浓度为1μg/ml。

1.2 方法

1.2.1 将pET32a+和构建好的表达载体pET32a+ABP转化大肠杆菌BL21 (DE3)

1.2.2 不同诱导温度对蛋白表达量的影响

挑取单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌过夜。次日,将过夜培养物按1%转接于含氨苄青霉素的LB培养基中,当菌液浓度OD值为0.5时,分别于25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃。在1.0mmol/L IPTG浓度下诱导3h,收获细菌培养物,15% SDS-PAGE电泳,分析表达结果。鉴定温度对蛋白表达的影响,确定最佳诱导温度。pET-32a(+)作阳性对照。

1.2.3 不同IPTG浓度对蛋白的表达量的影响

将扩大培养后的菌液按1%接种量于LB培养基中培养,当菌液浓度OD值为0.5时,分别加入IPTG至终浓度0、0.1、0.2、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0mmol/L,37℃诱导培养3h,收获细菌培养物,15% SDS-PAGE电泳,分析表达结果。鉴定IPTG浓度对蛋白表达的影响,确定最佳IPTG浓度。pET-32a(+)作为阳性对照。

1.2.4 不同菌液OD值对蛋白表达量的影响

将扩大培养后的菌液,按1%接种量LB培养基中培养,分别在菌液OD值为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9时,加IPTG至终浓度0.7mmol/L,37℃诱导培养3h,37℃诱导培养3h,收获细菌培养物,15%SDS-PAGE电泳,分析表达结果。鉴定菌液OD值对蛋白表达的影响。

1.2.5 不同诱导时间对蛋白表达量的影响

将扩大培养后的菌液按1%接种量于LB培养基中培养,当菌液浓度OD值为0.9时,加IPTG至终浓度0.7mmol/L,分别按诱导时间为2h、3h、4h、5h、6h、7h过夜诱导收获细菌培养物,15% SDS-PAGE电泳,分析表达结果。鉴定诱导时间对蛋白表达的影响,确定最佳诱导时间。pET-32a(+)作阳性对照。

2 结果与分析

2.1 不同诱导温度对蛋白表达量的影响

15% SDS-PAGE电泳和软件分析结果显示(图1):表达蛋白绝对量随着温度增加而增加,蛋白绝对量37℃时最高。

2.2 不同IPTG浓度对蛋白的表达量的影响

15% SDS-PAGE电泳和软件分析结果显示(图2):表达蛋白绝对量随着IPTG的浓度增加而增加,IPTG的浓度高于0.6mmol/L时,表达蛋白的绝对量降低,其中IPTG的浓度为0.7mmol/L时,表达蛋白的绝对量较高。而相对量没变化。

2.3 不同菌液OD值对蛋白表达量的影响

15% SDS-PAGE电泳和软件分析结果显示(图3),在菌液OD值为0.7和0.8时,可以获得较高的表达量。菌液OD值过大或者过小,表达蛋白相对表达量均下降。

2.4 不同诱导时间对蛋白表达量的影响

15% SDS-PAGE电泳和软件分析结果显示(图4):诱导时间在3h到4h表达蛋白的绝对量较高。诱导时间7h表达蛋白的相对表达量增加,绝对量降低,诱导时间超过7h,表达蛋白的相对表达量下降,绝对量增加。

M. 蛋白分子量;1. pET-32a(+)对照;2~8.不同诱导温度:25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃。

M. Protein MW marker;1. pET-32a(+) control; different temperature 2~8:25℃,27℃,29℃,31℃,33℃,35℃,37℃.

M. 低分子量标准蛋白;1. pET-32a(+)对照;2~9.不同IPTG的终浓度(mmol/L):0、0.1、0.2、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0。

M.Protein MW marker;1. pET-32a(+)control;2-9. the last density of IPTG(mmol/L):0,0.1,0.2,0.6,0.8,1.0,2.0,4.0.

M.低分子量标准蛋白;1~5诱导时菌液的不同OD值:0.5、0.6、0.7、0.8、0.9。

M. Protein MW marker;1-5. the different OD value of bacilli solution:0.5,0.6,0.7,0.8,0.9.

3 讨论

抗菌肽是一类小分子多肽, 由于其在组织中含量少, 分离获得大量的天然产物困难很大, 人工合成多肽则成本高, 应用受到局限。因此, 抗菌肽重组表达的研究很有意义。

M. 蛋白分子量标准;1. pET-32a(+)对照;2~8. 2h、3h、4h、5h、 6h、7h过夜诱导。

M.Protein MW marker;1. pET-32a(+)control;2-8. 2h,3h,4h,5h,6h,7h over night.

本文显示表达蛋白绝对量随着温度增加而增加,蛋白绝对量37℃时最高,原因是37℃是细菌最适宜温度。当IPTG浓度大于0.7mmol/L时表达蛋白积累相对量下降,原因可能是IPTG过多对细胞的毒性作用不利于细菌生长;诱导时最佳菌液OD值为0.9,原因是细菌进入对数生长期时生命活动最旺盛,而菌液OD值过大或者过小均不利于表达蛋白的累积。

LB培养基中加入0.3%的葡萄糖后,目的蛋白的表达量有了很大提高,原因是抗菌肽是对细菌细胞有潜在毒性的蛋白,在细菌生长阶段,利用乳糖操纵子的葡萄糖效应或产物抑制将pET系统中T7基因的基础表达减弱了。让细菌进入对数生长期,当葡萄糖消耗完时再用IPTG诱导。由于其杀菌活性,抗菌肽不能在原核系统中直接表达,一般采用融合表达和在酵母中表达的方式来避免直接表达时宿主菌的"自杀"和保护抗菌肽免受蛋白酶的降解[6,7,8]。本文利用乳糖操纵子的葡萄糖效应在大肠杆菌中直接表达了富甘氨酸抗菌肽。优化条件是:37℃菌液OD值0.8时诱导7h蛋白表达量最高(IPTG 0.7mmol/L, AMP 100μg/ml,0.3%Glu)。

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