pcr快速检测（15篇）
1.pcr快速检测 篇一
[临床应用] 检验科基因诊断室近日引进了德国罗氏的全自动荧光定量分析仪（Lighter Cycler）,并在近期内申请国家标准的PCR室。由于PCR技术具有高灵敏度、高特异性、快速简便及直接检测致病病原体或异常基因等特点，成为基因诊断在临床应用最为广泛的技术之一。
在90年代，PCR技术在我国临床诊断曾得到广泛应用，但由于PCR产品生产产家的良莠不齐，PCR技术本身的特点对于实验条件提出特殊的要求，造成各种假阴性或假阳性结果，反而给临床诊断带来困难和错误。目前荧光PCR的兴起以及标准试验室的认证为PCR的应用显示出更为光明的前景。
一、早期诊断:免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，许多病原体的抗体产生存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；而PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”。以HCV为例，免疫学检测的“窗口期”平均长达70天，而荧光PCR可将“窗口期”缩短59天，显然有利于疾病的早期诊断。
二、药物疗效观察：对原体的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考；同时药物治疗中可能引起的基因变异等情况更依赖核酸检测提供直接证据。
三、病情判断和预后评价：评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。
四、加快疾病的诊断：许多病原体到目前为止仍旧依靠传统的细菌培养作为诊断手段，操作繁琐费时。以结核杆菌为例，传统培养法需要1-2个月，而荧光PCR可将检测时间缩短至半天，能更及时地为临床提供诊断依据。
五、疾病的发病监控：许多病原体可以感染人体后整合入细胞内成为整合型，而一旦机体免疫力下降等又重新进入活动期并引致发病，临床上希望通过检测病原体基因的数量变化并结合临床表现找出其活动以及是否引起发病的规律，荧光定量PCR可以为此提供直接证据。
六、遗传疾病的诊断：荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。
七、献血员的筛选：PCR的高灵敏度及其对窗口期的缩短使其在提高输血安全方面有重要作为，目前美国、日本以及欧洲均已采用PCR对献血员进行筛选。
八、肿瘤的诊断：荧光PCR可对原癌基因的突变和易位等作出检测；对原癌基因的mRNA进行定量分析；有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断；探索癌变发生机理的研究提供参考；区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。
目前，检验科已开展乙肝、丙肝病毒核酸的定量检测，以及结核杆菌、淋球菌、衣原体的检测，随着检验技术的不断提高，陆续将开展其它项目，也希望临床广为利用。
2.pcr快速检测 篇二
1材料与方法
1.1 菌株及标本
空肠弯曲菌 (ATCC 11168) 。68份人及家禽粪便样品和34份环境水样品, 42℃微需氧 (微需氧产气袋) 培养24～48 h后, 挑选出11株可疑菌株, 传代培养做PCR检测。
1.2 引物设计与合成[5]
参照中国疾病预防控制中心扩增弯曲菌所用的引物, 由TakaRa宝生物工程 (大连) 有限公司合成 (表1) 。
1.3 方法
1.3.1 模板DNA
的提取 将1 ml过夜菌液培养物加到1.5 ml EP 管中, 直接水煮沸5～10 min, 4 000 r/min离心3～5 min , 吸取上清。
1.3.2 PCR 反应体系和循环参数
20 μl体系:10×buffer 2 μl , 2.5 mm Dntps 1 μl , 上下游引物各0.4 μl, Taq酶0.6 μl, 水11.6 μl , 加入4 μl模板 。循环参数为94℃预变性5 min, 94℃ 1 min, 52℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共35个循环;最后72℃延伸5 min。
1.3.3 PCR检测
用上述引物分别做空肠弯曲菌标准菌株及11份可疑样品PCR扩增, 通过电泳后对产物进行分析。
2结果
2.1 弯曲菌属的PCR检测
用上述弯曲菌属特异性引物扩增空肠弯曲菌标准菌株及11份可疑样品, 结果有7份可疑样品检测到阳性条带 (图1) 。
2.2 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的PCR检测
进一步用空肠弯曲菌的特异性引物MapA和结肠弯曲菌引物CeuE扩增7份可疑样品, 结果从7份样品中检测到3份空肠弯曲菌MapA片段, 4份样品中检测到结肠弯曲菌CeuE片段 (图2) 。
M:DL2000Marker;1:空肠弯曲菌标准菌株;2～12:检测样品
M:DL2000Marker;1, 2, 6:阳性标准菌株;3～5:空肠弯曲菌;7～10:结肠弯曲菌
3讨论
病原菌的分离和检测方法大致经历了传统培养和生化鉴定法、免疫学方法和基因检测等三个阶段。传统培养和生化鉴定法、免疫学方法因繁琐、费时、敏感性低等缺点, 不能适应现代流行病学调查和临床病原菌检测所需的快速、简便的要求。本实验所建立的PCR方法特异性好, 针对弯曲菌属16S rRNA片段设计的一对引物[6], 可以作为弯曲菌属的快速确认方法。同时, 传统的涂片染色、生化鉴定试验至少需要48 h才能鉴别出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌, 笔者针对空肠弯曲菌特有的MapA片段和结肠弯曲菌CeuE片段基因为模板设计的引物, 可以同时检测出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌, 而其他弯曲菌和其他细菌都不能扩增出特异性片段。全部实验 (包括PCR扩增、杂交、显色) 可在4～5 h内完成, 具有简便、快速的优点, 且特异性高、敏感性较好, 因此该方法为鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌提供了一种简便的方法。
参考文献
[1]Nachamkin I, Blaser MJ.Campylobacter〔M〕.2ed.WashingtonD.C.USA, 2000:1.
[2]Blaser MJ, Perez GP, Smith PF, et al.Extra intestinal Campy-lobacter jejuni and Campylobacter coli infections:host factorsandstrain characteristics〔J〕.Infect Dis, 1986, 153:552-559.
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3.pcr快速检测 篇三
关键词：PCR 原理与技术 食品检验 应用
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0038-01
1 引言
上世纪80年代中期，分子生物学领域诞生了一项新技术，称作DNA体外扩增法，简称为PCR技术。其基本原理是在生物体的体外，对指定DNA双链片断进行扩增。第一步：挑选出指定DNA双链片断，人工合成指定DNA双链片断端头邻近序列互补的寡核苷酸片断，将该互补片段称作引物（Primer），引物也是双链结构，分作左端引物和右端引物。第二步：加热指定DNA双链片断，使之发生变性，分裂成单链，把左右引物与之分别配对进行互补结合。第三步：在DNA聚合酶和4种dNTPs底物的共同作用下，引物沿模板DNA链按5/→3/方向延伸，合成DNA双链，这个步骤被称为DNA多聚酶链反应。第四步：以新合成的DNA双链作为扩增模板，重复DNA多聚酶链反应步骤。历经25～35次循环，可将DNA序列扩增到近百万倍。该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点，自诞生之日起，其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证。
2 PCR技术在食品检测方面的应用
2.1 PCR技术的检测原理
PCR技术最根本的鉴定依据是生物的DNA结构具有唯一性。在食品检测中，起到鉴定标准模板作用的是引物，从理论上说，①如果引物来自DNA保守区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA保守区的片段；②如果引物来自DNA特异区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA特异区的片段。以上两种理论依据就是PCR技术的检测原理。
在实际应用中，人工有选择地截取DNA片段，使用DNA多聚酶链反应，可以在2～3小时之内达到常规检测需要数天才能达到的培养效果，另外还省去了繁琐的种属鉴定等工作，简化了检测流程。
2.2 PCR技术的操作程序
（1）待检样品的浓集（增菌）。食品中待检的微生物群落浓度一般都是比较低的，达不到检测要求。这就需要进行待检微生物的浓集。
（2）核酸的提取。为了实现PCR扩增，必须提取待检样品的核酸。常用的处理方法包括：加热、反复冻融、化学裂解。
（3）PCR扩增。在扩增过程中，最关键的莫过于引物，它直接关系到PCR检测的成败。扩增需要20—40个反应循环，每个循环都由高温变性、低温退火、适温延伸组成。高温时，氢键打开，双链变为单链，生成扩增模板；低温时，左引物和右引物分别与模板DNA的2条单链做互补结合，完成配对；适温时，在聚合酶作用下，4种三磷酸脱氧核苷（A、T、G、C）按碱基互补配对原则不断进行配对添加，按5/→3/方向自动合成新的DNA双链片段。
变性温度一般需保持在94℃左右，如果待扩增区域DNA的G+C含量太高，则可考虑适当提高变性温度。
退火温度与引物的G+C含量有关，根据公式：Ta=4×（G+C）+2×（A+T）-5。
延伸温度一般需保持在72℃左右，此时DNA聚合酶的聚合速度约1000（碱基）/min。
（4）扩增产物的检测。常用的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法，琼脂糖质量分数在0.8%～2%之间。待分离DNA片断的分子量越小，所需琼脂糖质量分数则越大，反之亦然。
3 PCR技术用于食品检测的优缺点
3.1 PCR技术的优点
传统检测方法多采用平板培养法，通过菌落计数来判断菌体浓度。传统方法的优点是操作简单，其最大的缺点是消耗的时间太长，检测周期一般在3——10天。
PCR技术的最大优点就是检测速度快，使用特异区扩增检测，只要在几个小时内成功扩增，即可检验并判断出待检测样品的种类，非常迅捷、灵敏。
3.2 PCR技术的缺点
任何事物都不是完美的，PCR技术一样存在缺点，正是这些缺点的存在，导致其不能完全取代传统检测法。其主要缺点包括：（1）假阳性问题。核酸受到污染而造成假阳性的问题，是PCR技术的最大缺点。这个缺点来自扩增本身，在扩增的过程中，即使只有一个污染源，结果也会出现成十万成百万倍的污染现象，造成检测结果出现阳性，称之为假阳性。
防止假阳性问题，目前只有做好隔离这一种办法。（2）假阴性问题。假阳性问题来自PCR技术本身，假阴性问题则来自待测样品。食品成分复杂，其中多种成分发生了复杂的化学反应，不能排除模板液中带有某种或某些抑制PCR反应的成分。防止假阴性问题的办法是设置阳性对照环节。（3）定量检测困难。由于影响PCR产率的原因比较多，在定量检测方面不能提供较为精准的数据，导致PCR技术无法胜任定量检测。直至目前，尚没有实质性的突破与进展，限制了PCR技术在检测方面的应用范围。
4 结论
PCR检测有一定的局限性，但是，其高灵敏度的检测反应、明显的特异性辨别、快速简便的检测流程，是其它检测方法所不能替代的。相信随着生物技术的快速进步，PCR检测技术的应用范围會越来越广泛。
参考文献
[1]常玉华，仇农学.基于PCR技术快速检测食品微生物的原理方法与应用[J].农产品加工，2011（11）.
[2]张泽民，李曼.PGR技术在转基因食品检测中的应用与发展趋势[J].农牧产品工程，2011（7）.
4.pcr快速检测 篇四
羊流产衣原体的PCR检测方法研究
根据羊流产衣原体16S rRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼农原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的`卵黄囊膜均未扩增出相应的片段.敏感性试验表明,该体系可检测到2 pg的衣原体DNA.
作 者：张莉 王英珍 鄢明华 李秀丽 ZHANG Li WANG Ying-zhen YAN Ming-hua LI Xiu-li 作者单位：天津市畜牧兽医研究所,天津,300112 刊 名：天津农业科学 英文刊名：TIANJIN AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)： 15(2) 分类号：S852.67 关键词：羊流产衣原体 PCR 检测5.pcr快速检测 篇五
巢式-多重RT-Reahime PCR检测马铃薯黑环斑病毒的研究
马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)是马铃薯重要病毒病害之一.本研究根据PBRSV基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了两对巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Realtime PCR检测PBRSV的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM珊试剂盒快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达450fg/μL植物总RNA.利用4对引物和1条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高.
作 者：粟智平耿金培 鲁闽 张京萱 王颖 Su Zhiping Geng Jinpei Lu Ming Zhang Jingxuan Wan Ying 作者单位：烟台出入境检验检疫局,山东烟台,264000刊 名：检验检疫学刊英文刊名：INSPECTION AND QUARANTINE SCIENCE年，卷(期)：19(2)分类号：Q503 S435.32关键词：马铃薯黑环斑病毒(PBRSV) 巢式-多重RT-RealtimePCR 检测
6.快速检测工作制度 篇六
为规范*****工商所食品安全快速检测行为，发挥快速检测设备的作用和优势，进一步提高*****工商所食品安全监管水平，保障辖区食品安全，现就*****工商所开展食品安全快速检测工作制定本制度：
一、*****工商所应建立食品安全检测工作制度，指定工作责任心强的检测人员负责检测工作。该人员须经相关培训后方可上岗。
二、检测人员负责快速检测设备的使用与维护。操作前应对快速设备进行全面检查，确保设备（试剂）完好，符合检测条件；同时，仔细阅读设备使用说明书，并严格执行其中的规定和要求，保证自检结果的可靠性。
三、检测人员在对食品及其原料进行检测前，应先对待检样品进行初步感官检查，判断是否新鲜，对过期变质的食品及其原料予以初步筛选。
四、检测人员应随机抽取样品，保证待检样品的代表性。发现抽检样品不合格时，填写并下达《责令停止销售通知单》，并及时向巡查人员及所领导汇报，以便及进行下一步的处理。
五、检测每周开展至少一次，每次至少两个项目。中高考、节日等重大活动、重大节日期间，应增加检测频次，及时消除食品安全隐患。
7.pcr快速检测 篇七
关键词：金黄色葡萄球菌,葡萄球菌肠毒素B,聚合酶链反应
金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SA)是目前细菌性食物中毒和人类化脓性感染中最常见的病原菌之一,该菌产生的葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是引起食物中毒的主要原因。在美国,由SEs引起的食物中毒占细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占45%[1],我国每年发生的此类食物中毒事件也很普遍。近年来,SEs除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5种传统的血清型外, 还发现了SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK等新型的肠毒素[2,3]。以SEA 引起的食物中毒最多见,SEC和SED 次之,SEB 在医院感染分离的金黄色葡萄球菌中多见。SEB因其“超抗原”特性以及在中毒休克综合征中的特殊意义而倍受关注。近年发现,造成医院感染的耐青霉素金黄色葡萄球菌,80%以上产生SEB,个别医院分离株几乎100%产肠毒素[2,4]。对于SEs的检测[5],目前主要依靠免疫学的方法,但其特异性和敏感性较差,已不能满足公共卫生检测的需要,随着聚合酶链反应(PCR)技术的出现,已有较多利用PCR技术检测SEs的报道[6,7]。我们以葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因为检测靶基因,旨在建立快速、灵敏、特异地检测SEB的PCR方法,现报道如下。
1 材料及方法
1.1 菌株来源
阳性对照菌株:产SEB金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC 14458)购自中国药品生物制品检测所。9株阴性对照菌株:大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌、溶血性链球菌、非产肠毒素金黄色葡萄球菌均为本实验室保存菌株。
1.2 主要试剂
DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)为北京天根公司产品,Premix Taq PCR试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品,琼脂糖凝胶为英国Oxioid公司产品,5×TBE为生工生物工程(上海)有限公司产品,GelRed染料为美国Biotium公司产品,600 bp DNA Marker B(100bp Ladder,100 bp-600 bp)为美国Bio Basic公司产品.所有试剂均在有效期内使用,其配制严格按使用说明进行。
1.3 主要仪器
梯度PCR扩增仪C1000-SERIES(美国Bio Rad公司),核酸蛋白电泳系统(美国Bio Rad公司),GDS8000凝胶成像系统(基因公司)。
1.4 方法
1.4.1 引物设计与合成
引物序列,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成和纯化,各引物序列见表1。
1.4.2 模板DNA的提取
将阳性对照菌株和9株阴性对照菌株分别接种于营养肉汤增菌液中,37 ℃恒温培育16～18 h,取1 ml增菌液10,000 min离心1 min(RCF=9391),菌沉淀加入20 mg/ml的溶菌酶溶液180 μl,37 ℃处理45 min,其余步骤按TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒说明书进行,最后加200 μl TE洗脱DNA收集备用。
1.4.3 PCR反应体系
PCR反应体系体积为20 μl,其中模板DNA 2.0 μl,相应的上、下游引物(20 UM) 各0.2 μl,Premix Taq 10 μl,ddH2O 7.6 μl,轻弹混匀,稍微离心后放入PCR仪内进行PCR扩增反应,反应条件为:①95 ℃ 10 min;②95 ℃30 s;③54 ℃30 s;④72 ℃30 s;⑤72 ℃10 min,其中②～④步循环40次。
1.4.4 扩增产物的电泳检测
取0.9 g琼脂糖凝胶粉末与60 ml TBE缓冲液混合,于微波炉上加热煮沸,冷却至60 ℃左右加入GelRed 6 μl制备成1.5%的琼脂糖凝胶。取5 μl扩增产物与1 μl 6×loading buffer混匀后点样于琼脂糖凝胶中,于1×TBE电泳缓冲液中以70 V电泳70 min后放于凝胶成像系统中成像,观察PCR扩增产物有无预期大小的目标DNA片段(494 bp)。
1.4.5 特异性分析
将阳性对照菌株、阴性对照菌株按上述方法进行DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析。
1.4.6 灵敏度分析
产SEB金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC14458),37 ℃培养16～18 h,增菌液用无菌水作10倍梯度稀释,平板菌落计数得知各梯度浓度为2.6×104、2.6×103和2.6×102 CFU/ml,分别用上述方法进行DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析。
1.4.7 SEB基因情况分析
PCR检测本实验室保存的30株金黄色葡萄球菌SEB基因。30株菌株中分离自食物中毒患者的吐泻物10株,分离自市场采样检测食品16株,分离自医院(物体表面)消毒检测样品4株。
2 结果
2.1 SEB基因PCR扩增产物的电泳图谱及特异性分析结果
见图1。
注:SEB—葡萄球菌肠毒素。M:DNA marker(100 bp Ladder,100～600 bp);1:产SEB金黄色葡萄球菌;2:空白对照;3:大肠埃希菌;4:沙门菌;5:志贺菌;6:副溶血性弧菌;7:霍乱弧菌;8:小肠结肠耶尔森菌;9:空肠弯曲菌;10:溶血性链球菌;11:非产肠毒素金黄色葡萄球菌
图1结果显示,产SEB金黄色葡萄球菌PCR扩增产物有494 bp大小的目的DNA片段,9株对照菌PCR扩增产物未出现任何条带。SEB基因PCR引物只对产SEB金黄色葡萄球菌出现PCR阳性扩增反应,显示了良好的特异性。
2.2 产SEB金黄色葡萄球菌不同菌浓度SEB基因PCR扩增产物的电泳图谱
见图2。
注:SEB—葡萄球菌肠毒素。M:DNA marker(100 bp Ladder,100～600 bp);1:菌液浓度为2.6×104 CFU/ml;2:菌液浓度为2.6×103 CFU/ml;3:菌液浓度为2.6×102 CFU/ml
及灵敏度分析结果
图2结果显示,在菌液浓度分别为2.6×104 CFU/ml、2.6×103 CFU/ml时PCR扩增产物有预期大小的目标DNA片段(494 bp),在菌液浓度分别为2.6×102 CFU/ml时,PCR扩增产物无预期大小的目标DNA片段(494 bp)。
2.3 产SEB金黄色葡萄球菌不同菌浓度SEB基因PCR扩增产物灵敏度分析
见表1。
注:①PCR反应结果:未扩增出494 bp目标DNA片断为阴性;扩增出494 bp目标DNA片断为阳性。②试验中,取1 ml菌液进行DNA提取,DNA最终溶解于200 μl缓冲液TE中,PCR时取2 μl DNA作为模板,PCR反应体系中金黄色葡萄球菌菌落数=菌液浓度×增菌液体积×DNA模板体积/缓冲液TE体积。SEB—葡萄球菌肠毒素B。
2.4 30株金黄色葡萄球菌SEB基因携带情况
分离自市场采样检测食品的金黄色葡萄球菌SEB基因携带率高,为12.5%。见表2。
注:SEB—葡萄球菌肠毒素B。
3 讨论
在《WS/T 80-1996 葡萄球菌食物中毒诊断标准及处理原则》中规定,分离的金黄色葡萄球菌必须进行SEs的检测,且SEs为同一型别时才能作为引起食物中毒的病原学诊断依据。以往对于金黄色SEs的检测,主要用免疫学方法,但常出现假阳性或假阴性的结果,因为有些菌株虽然含有毒素基因,但基因表达不好,或是缺乏稳定的遗传成分,这就容易出现假阴性。有些菌株的血清型容易产生交叉反应,因而又常常出现假阳性[7]。为满足食物中毒快速检测的需要,很多实验室采用了PCR方法检测SEs。PCR检测金黄色SEs基因的方法具有快速、准确、灵敏度高、特异性好,具有广泛的应用前景。
本研究针对SEB基因进行检测,特异性好,可排除其他常见食物中毒病原菌的干扰,灵敏度高,菌浓度为2.6×103 CFU/ml,PCR反应体系中仅有26 CFU的金黄色葡萄球菌既可检出,快速,整个检测从模板制备到PCR产物分析只需4 h左右,为产SEB金黄色葡萄球菌引起的食物中毒和医院感染的快速查因及流行病学调查提供了可行的方法。
参考文献
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8.pcr快速检测 篇八
关键词：PCR技术 食品检测 微生物 多重PCR技术
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）04-0014-02
1 概述
PCR多聚酶链式反应（polymerase Chain Reaction），是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术。自从其问世就快速的应用于食品科学的许多领域中。
2 PCR技术
2.1 PCR技术的原理和基本步骤
2.1.1 PCR技术的原理
PCR技术的基本原理是在体外对已知的，待扩增的双链DNA片段，人工合成与该DNA两条链末端互补的两条寡核苷酸引物，在体外将待检的DNA序列在酶促作用下进行高效扩增。
2.1.2 PCR技术的主要检测步骤
PCR技术的主要检测步骤包括：运用化学手段对目标DNA提取，设计并合成引物，进行PCR扩增，克隆并筛选鉴定PCR产物，DNA序列分析。
2.2 PCR技术的优点
（1）快速，PCR技术用于食品检测，仅一天就能完成检测。（2）灵敏，PCR技术能够比较准确的检测出食品中的微生物，可以避免传统检测分离所有微生物的困难。（3）操作方便，PCR技术检测食品的操作简单方便，仅一人就能完成检测。
3 PCR 技术在食品检测中的应用
3.1 食品中成分种类及有效成分的检测
进行食物中动物成分种类的鉴定，是为了防范某种特定的动物病，例如：上个世纪的疯牛病，食品、药品、饲料中的牛源性成分开始受到严格限制，2004年，李林等应用PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成分种类。进行食品有效成分的检测是因为食品中各种营养成分有了数字指标。特别是对于那些加工后的食品，如果通过传统的方法，不能判断出食材的优劣以及相关成分，而PCR技术则不受限，对于加工后的产品有效成分的鉴定有重要的作用。
3.2 PCR技术在食品微生物检测中的应用
3.2.1 PCR技术检测食品微生物的优势
PCR技术的优势是监测时限短，操作简单，灵敏度高。例如在单核细胞增生李斯特氏菌检测中，在金黄色葡萄球菌的检测中，在顽固性梭状芽孢杆菌的检测中都显现出较之传统技术其具有极高的特异性和敏感性的特点。
3.2.2 传统PCR技术及其在食品微生物检测中的应用
PCR技术在食品检验中最早是用来监测食品中的病原体，但是传统PCR检测技术需要依赖不同类型的后处理过程来解决假阳性污染和定量准确度的难题。而且处理过程繁琐，可能产生有害物质，影响操作者的健康，所以近年来，PCR改进技术迅速发展起来，通常采用传统常规型与改进型相结合的方法进行研究。
4 PCR 改进技术在食品检测中的应用
4.1 实时定量PCR技术及其在食品检测中的应用
实时定量PCR技术是在反应体系中加入荧光染料或者荧光探针，通过信号的积累来监测整个进程，然后再通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法。有很多优点：快速灵敏，操作方便，全封闭反应，减小环境污染，不使用有毒试剂，操作安全，定量准确，监测结果直观等优点。
4.2 多重PCR 在食品检测中应用
4.2.1 多重PCR技术在食品病原微生物检测中的应用
食品污染的病原菌包括多种，例如：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌等。在检测时，易受其他微生物和本身的变异株的干扰。使实验结果呈现出假阳性和准确率低的现象。目前研究多采用多重PCR检测。如：肠出血性大肠杆菌利用多重PCR检测与传统的血清学方法检测相比，更高效灵敏。沙门氏菌利用多重PCR检测，可以提高食品沙门氏菌的检测率，还可以鉴定沙门氏菌的血清型和突变情况。金黄色葡萄球菌利用多重PCR检测，虽然检测结果与免疫学检测结果基本一致，但是多重PCR还可以检测一些免疫学方法不能检测的肠毒素基因。多重PCR在复杂的食品样品检测中有很好的重复性和高度的敏感性表明其是检测食品致病菌的可行性方法。
4.2.2 多重PCR技术在食品非致病菌检测中的应用
乳酸菌（LAB）是真空环境下存在的主要微生物，对致病菌的生长有着较强的抑制作用，但是乳酸菌的存在也是食品腐败的信号。乳酸菌在真空的包装中含量一般都很低，Yost等（2000）用16S rRNA、16S-23S rRNA ISR建立多重PCR检测与真空包装牛肉产品腐败相关的乳酸菌，Kye等（2006）用种特异性基因代替16S rRNA设计引物同时检测韩国泡菜发酵过程中的10种重要的LAB，随发酵的时间和菌群的变化多重PCR的检出率不断提高，试验建立的多重PCR技术重复性好，同时又解决了16S rRNA不能有效检测韩国泡菜乳酸菌的问题。
5 PCR技术在应用过程中可能存在的问题及解决方法
5.1 应用过程可能存在的问题
样品的预处理、样品DNA的提取等具体的操作过程可能会遇到不同的问题，PCR的反应过程中具体的操作，比如确定退火的温度、适温延伸时间的长短和循环数的确定等问题都是复杂的。
5.2 解决方法
在不同的反应体系中，为避免假阴性、假阳性的现象的出现，应该确定好与之相适应的反应条件。试验操作要规范化。在检测前，要进行预实验来进一步完善检测方法。
6 结语
PCR检测技术作为现代生物学技术的手段应用于食品检测，克服了传统检测方法的缺点和不足，尤其方便快捷，灵敏度高的特点，如果可以克服其缺点，前景一定会很广阔。
参考文献
[1]刘红芳，宋慧. PCR及其改进技术在食品微生物检测中的应用[J].现代化农业，2012，26（5）：34-36.
9.食品中农药残留的快速检测 篇九
一、前言
随着人们环境意识的不断加强，由农药引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。为了保障消费者的安全和健康，提高农产品的质量安全水平，增强农业产品的国际竞争力，我国政府决定加强农产品中农药残留的监控，建立健全农药残留的检测体系，实施对蔬菜、瓜果、茶叶生产全过程的农药监控，从源头抓起，加强农产品的产地检测，把住农产品的市场准入关。
（一）农药概念
农药(pesticides)是指农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草及其他有害生物，以及有目的地调节植物、昆虫生长的药物的通称。
现在农药不仅应用于农业，而且也广泛应用于畜牧业、林业和公共卫生事业等方面。
农药残留是指农药使用后残存于生物体、食品(农副产品)和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。
1.按化学成分可分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类及砷、汞、铜、硫磺等制剂。
2.按用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂和粮食熏蒸剂等。
农药除了可造成人体的急性中毒外，绝大多数对人体产生的慢性危害，多是通过污染食品的形式造成。
某些农药对人和动物的遗传和生殖造成影响，产生畸形和引 起癌症等方面的毒素作用。
1、有机氯农药
容易在人体内蓄积
慢性毒性作用，主要表现在侵害肝、肾及神经系统，动物实验证实有致畸、致癌作用
我国1983年停止生产，1984年停止使用这类农药
2、有机磷农药
早期的高效高毒品种：对硫磷（1605）、甲拌磷（3911）、内吸磷（1059）
后期使用得较多的为高效低毒低残留的品种，如：乐果、敌百虫、杀螟松、倍硫磷
毒性极低的马拉硫磷、双硫磷、氯硫磷、锌硫磷、碘硫磷、地亚农、灭蜈松
急性毒性：有机磷农药化学性质不稳定，分解快，在作物中残留时间短。
抑制血液和组织中胆碱酯酶的活性，引起乙酰胆碱在体内大量积聚而出现一系列神经中毒症状，如神经功能紊乱、出汗、震颤，精神错乱、语言失
主要表现为植物性食物残留，尤其是含有芳香物质的植物
如：水果、蔬菜，特别是叶菜类如小白菜、大白菜、鸡毛菜、甘蓝、芹菜、韭菜、芥菜、花菜、绿花菜、茼蒿、枸杞菜和黄瓜等
酶抑制法酶抑制技术是研究比较成熟、应用最广泛快速的农药残留检测技术，是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE)的特异性生化反应建立起来的农药残留的微量和痕量快速检测技术。
2、速测仪
原理:在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质。
用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。
免疫分析技术是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量分析技术，是基于抗原抗体特异性结合和反应为基础的分析方法。目前应用于农残检测的是酶免疫分析(EIA)和放射性免疫分析(RIA)。其中酶联免疫分析技术应用最为普遍。
3、酶联免疫技术
ELISA是一种以酶作为标记物的免疫分析方法，也是目前应用最广泛的免疫分析方法之一，它将酶标记在抗体／抗原分子上形成酶标抗体／酶标抗原，酶作用于能呈现出颜色的底物，通过仪器或肉眼进行辨别。
ELISA法基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。
该法因不需昂贵仪器设备，对人体无害等优点而被广泛采用，具有灵敏、特异、快速、稳定以及易于自动化操作等特点。
4、发光菌检测法
农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，通过细菌发光情况，可测出农药残留量。
此方法简便但是特异性差
5敏感家蝇对杀虫剂具有敏感性，记录家蝇存活情况，根据家蝇的死亡率可知农药残留情况。
该技术方法直接、过程简单、容易掌握，但定性粗糙，只对少数农药有效，而且由于其他生物对不同农药的毒性反应与人畜可能不同，因此影响对农药残留量的判断。如家蝇对毒性较低的除虫菊酯类敏感，远超过有机磷和氨基甲酸酯类中毒或高毒的农药。
三、农药残留快速检测技术展望
一些快速速检测方法与国家标准方法和仪器法相比具有操作简单、快速的优点，但由于大多数快速检测方法在食品样品前处理、操作规范性方面还有许多待完善之处，目前还只能作为快速筛选的手段而不能作为最终诊断的依据，兼具快速和准确两大优点是快速检测方法追求的目标。
10.pcr快速检测 篇十
水质毒性快速检测技术及其发展趋势
摘要：水质毒性快速检测可以及时提供水体的污染信息,为突发事件的紧急处理和水质毒性的预警提供依据.常见的`水质毒性快速检测技术主要包括基于细菌的发光检测技术、化学发光检测技术、呼吸作用的检测技术、光合作用检测技术、电化学检测技术等.文章综述了主要水质毒性快速检测技术的原理和技术现状,并展望了相关发展趋势.作 者：王广鹤 瞿Z琰 卢湘岳 何德富 WANG Guang-he QU Jing-yan LU Xiang-yue HE De-fu 作者单位：华东师范大学环境科学系,上海,62期 刊：环境科技 ISTIC Journal：ENVIRONMENTAL SCIENCE AND TECHNOLOGY年，卷(期)：,21(z2)分类号：X8关键词：水质毒性 快速检测 发光细菌 脱氢酶
11.pcr快速检测 篇十一
文章编号：1003-1383(2011)03-0337-02 中图分类号：R 759.204.46 文献标识码：B
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2011.03.042
当前性传播疾病在我国日趋流行，其中尤以淋病的发病率较高［1］，已成为威胁公众健康的重要疾病。目前，临床上检测淋球菌的方法有很多且各有利弊，其中主要采用的是聚合酶链反应（简称PCR）和细菌培养法两种。本文对我院于2008年6月至2010年12月采用PCR和细菌培养方法检测淋病奈瑟氏菌的结果进行比较，现报告如下。
资料与方法
1.标本来源 2007年6月至2010年12月在我院妇科门诊和男性科门诊诊断为淋病患者188例。按所选择的检测方法分为PCR组和细菌培养组各94例。PCR组中男35例，女59例，年龄最小19岁，最大66岁，平均年龄39.8岁；细菌培养组中男34例，女60例，年龄最小18岁，最大69岁，平均年龄38.6岁；两组患者性别、年龄、治疗前病程比较差异均无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。
2.检测方法 荧光定量PCR试剂由深圳达安公司生产；细菌培养基及生化试剂由湖南长沙天地仁有限公司提供。两组患者由临床医生采集生殖道分泌物(女性:阴道分泌物或宫颈黏液；男性取尿道分泌物、前列腺液)。置于无菌试管送检验科分别进行PCR检测和细菌培养。检测方法严格按操作说明书进行。
3.统计学处理 两组阳性率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
PCR组检出淋病奈瑟氏菌阳性84例，阳性率为89.4%；细菌培养组检出淋病奈瑟氏菌阳性46例，阳性率为48.9%。两组阳性率比较差异有统计学意义（χ2=36.004，P＜0.01）。
讨论
目前性传播疾病呈高发趋势，以淋病居多，位于非淋球菌尿道炎之后，居于第二位［2］。淋病是由淋病奈瑟氏菌感染引起，感染后引起泌尿生殖系统化脓性炎症。但因有60%为无症状的隐性带菌者（隐性淋病），不易觉察，危害性更大［3］。故对该病的准确诊断是指导用药并防止该病传播的关键。临床上检测淋病奈瑟氏菌的方法有多种，但最常用的是细菌培养法和PCR法。虽然细菌培养法是目前世界卫生组织推荐诊断淋球菌的“金标准”［4］，也是筛查和诊断淋球患者的主要实验室方法。但由于淋球菌对外界抵抗力低，生长条件苛刻，其检测敏感性受许多条件制约，且操作繁琐，等待报告的时间较长，尤其是不少患者在检测前已接受过非正规抗生素治疗，易产生假阴性结果，从而在一定程度上影响了培养法的检出率。
荧光定量PCR法检测属一种基因诊断技术，它是借助于一种DNA扩增技术，该法的敏感性和特异性高，对标本采集的要求不像细菌培养那么严格，同时它不管细菌是否存活都可以检测出来，即使患者用过抗生素后仍能准确检测其结果。本组资料显示，采用荧光定量PCR法检出的阳性率为89.4%，而细菌培养法的阳性率仅为48.9%，2种检测方法阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.01)。尽管采用荧光定量PCR方法成本较细菌培养方法要高，且操作过程复杂，但笔者认为，PCR方法应是目前临床上检测淋病奈瑟氏菌的最佳方法之一。
参考文献
［1］陈 昕，尚 红.常见性传播疾病实验室指标的评价［J］.辽宁医学杂志，2004，18(6):322-323.
［2］秦倩倩，朱 昊，张丽芳，等.2003年全国性病流行病学分析［J］.疾病监测，2004，19(10):381-383.
［3］陈永锋，张木有.性病诊断治疗［M］.广州：广东科学技术出版社，1997：58-383.
［4］张卓然.临床微生物学和微生物检验［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2004:476-477.
(收稿日期：2011-03-16 修回日期：2011-04-29)
12.pcr快速检测 篇十二
荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度高, 并且可以有效的防止检测过程中样品的污染, 极大的提高了检测的准确性。此外荧光定量RT-PCR检测方法灵活性也好, 可一次获得样品的多个遗传信息, 这就大大的缩短了检测时间, 为A型流感病毒患者的治疗创造了最佳治疗时间。本次研究选取2011年9月至2012年3月我院收治的10例A型流感病毒感染者, 随机分为两组, 对照组5例进行常规检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。两组临床资料进行分析, 情况如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究病例10例, 其中女性6人, 男性4人, 年龄5~70岁。小孩4例和老人3例比重较大, 男女比例相当。10例患者中, 发烧咳嗽的有1例, 浑身酸痛流涕的有2例, 出汗咳嗽流涕的有1例, 发烧浑身酸痛的有2例, 发烧并且出汗的有1例, 浑身酸痛兼出汗的有1例, 发烧、浑身酸痛、出汗、咳嗽流涕的有2例。两组在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
对照组5例进行常规检测, 采用血清学检测方法和病毒分离培养方法进行检测。实验组5例采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计学软件, 计数资料行χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
实验组荧光定量RT-PCR方法检测时间短, 且具有特异高, 敏感性高的特点。这些特性对疾病治疗也有极大的帮助。对照组发现有3例病情加重, 其中1例并发淋巴系统疾病2例并发肺部细菌感染, 继发性肺炎主要症状表现为持续发烧、头痛、呕吐、恶心、嗜睡、食欲不振、吐浓痰、痰液黏稠且黄、少数痰中带血、病人面色发黄。并发淋巴系统疾病的患者表现为淋巴结中大、身体浮肿、淋巴管扩张扭曲、局部淋巴管管壁及其周围组织发生炎症细胞浸润、浸润的细胞中有大量噬酸性粒细胞。实验组有2例病人并发肺部细菌感染, 症状表现为发烧、恶心、呕吐、嗜睡惊厥等症状, 没有发现有淋巴系统病变的病例。经化验科检验, 肺部细菌感染的继发性肺炎主要是感染金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌和肺炎链球菌。实验组治疗时间为1~3周, 对照组治疗时间为2~4周, 其中有1例病情严重的为6周左右。有1例因病情恶化转移到上级医院去接受治疗。值得提醒的是, 在研究过程中发现A型流感病毒容易感染其他住院病人。而这些病人都是些免疫能力相对比较低的病患。见表1。
注:*与对照组比较1) P<0.05。
3 讨论
A型流感病毒具有很强的侵袭力, 而且对药物的治疗具有抵抗力的突变或是变异, 可以对病人的健康造成威胁。对照组并发症较高, 可能是因为血清学检测特异性和敏感性不高, 检验的准确性低从而有误诊影响到对疾病的治疗或是错误治疗诱发病毒变异, 这些因素都可能加重疾病或是引起并发症;病毒分离培养方法至少需要21d才能得到检测结果, 检测时间过长, 有些患者所感染的病毒在检验过程中可能已经发生突变或者是变异, 从而影响到治疗的效果。A型流感病毒极易突变, 不正确的治疗以及治疗时间过长均易导致突变, 从而加重治疗的困难性。而且突变后的A型流感病毒株具有更强的毒力和攻击性。此外, 耐药性也是一个不可忽视的问题, 在确诊之前采用广谱抗病毒药物, 不仅易导致耐药还可能导致突变从而贻误病机。从感染A型流感病毒的人群分析, 老人和小孩所占比重相对较大, 老人免疫系统功能退化而小孩免疫系统尚未发育好, 这两大人群共同特点就是免疫力比较差。因此加强对老人和小孩的保护也很重要。感染A型流感病毒后, 人体的免疫力降低, 原本寄居于人体的正常菌群如金黄色葡萄球菌变成致病菌, 从而引发一系列的感染。早期识别以及采取长期隔离防范措施看来对预防受到感染的免疫功能受损患者发生 (医院性) 流感病毒爆发不失为是一种谨慎的作法[1]。然而, A型流感病毒感染早期症状并不明显, 只有50%左右的有明显的类似于呼吸道感染疾病的症状。这就加重了防治的难度。到医院就诊的都是症状明显、病情较严重的患者。这就需要医院有快速的检测结果和尽早的治疗。荧光定量RT-PCR检测方法正好弥补了血清学、病毒分离检测方法的不足, 对A型流感病毒的检测时间短, 异性高, 敏感性好, 为疾病A型流感病毒感染的尽早治疗创造了条件。荧光定量RT-PCR检测方法不仅对A型流感病毒的治疗有积极作用, 而且有利于隔离传染源, 切断传播途径, 保护易感者, 减轻人们的恐慌心里和心理压力。有利于提高治愈率, 缩短治病时间, 提高病人的生活质量。
摘要：目的:探析荧光定量RT-PCR检测方法对A型流感病毒检测的快速性、敏感性和特异性以指导临床治疗。方法:选择我院2011年9月至2012年3月收治的10例感染A型流感病毒病人, 随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果:实验组的确诊率和治疗效果均高于对照组, 且所用的检测时间和治疗时间均短, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:荧光定量RT-PCR检测A型流感病毒准确率高, 对临床治疗有积极的指导作用。
关键词：荧光定量RT-PCR,A型流感病毒,检测方法
参考文献
13.有机物料中砷快速检测方法的研究 篇十三
有机物料中砷快速检测方法的研究
有机物料中砷含量的.检测技术,采用快速微波酸消解前处理技术,原子荧光光谱仪定量.与国家标准检验方法GB/T 5009.11-2003<食品中总砷及无机砷的测定>比较,比国标前处理方法节省时间50%,试剂用量节省约50%.两种方法准确度未见显著性差异,精密度优于国家标准方法,适合对有机物料中砷进行快速测定.
作 者：姜佰文 杜欣谊 孙兰金 王春宏 JIANG Baiwen DU Xinyi SUN Lanjin WANG Chunhong 作者单位：姜佰文,王春宏,JIANG Baiwen,WANG Chunhong(东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨,150030)杜欣谊,孙兰金,DU Xinyi,SUN Lanjin(黑龙江省农垦科学院测试化验中心,黑龙江,佳木斯,154007)
刊 名：东北农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2008 39(3) 分类号：O613.63 O6-3 关键词：有机物料 砷 检测14.pcr快速检测 篇十四
快速检测技术，是近年来兴起的一种检测方法，具有快速简便的优点，目前已在商品生产领域、进出口领域等广为运用，本市工商部门也从2009年开始在食品安全监管中引入了该项技术，大大增强了对流通环节食品隐患的发现能力，提高了执法效率。但由于工商部门在食品检测方面的缺乏历史积淀和相关专业知识储备的不足，加之食品快速检测技术本身存在一定的局限性，使得食品安全快速检测工作在开展过程中也显露出了一些问题。
一、食品快速检测工作中存在的问题
1、食品检测能力、范围有限，还不能满足保障食品安全的需要。
工商部门的食品快速检测主要依托各工商所的食品检测员和食品快速检测箱来进行。但是，食品快速检测箱所能检测的项目仅有几十个，能检测的食品各类也有限，许多影响食品安全的隐患，许多民众关心的问题，如食品的真假、是否添加了禁止加入的添加剂等无法给出相对确定的结论。面对消费者各式各样的维权要求，常常使基层工商所的工作人员感到无所适从，更不要说以此为依托确保食品安全了。由此造成工商部门食品隐患总体检出量少，食品安全保障的力度尚有待进一步提高。
2、食品快速检测结果的准确度和效力不足，影响了开展检测工作的信心。在具体的检测实践中，工商所的监管人员往往希望能够通过检测快速准确地判定食品的质量状况，并以此为据展开执法工作。但是，按照《食品安全法》和国家总局的《流通环节食品安全监督管理办法》等法律规范的规定，快速检测的结果并不具有执法依据的效力，必须是由检验机构出具的正式的检测报告才能作为执法依据；另一方面，又不时地出现这样的情形：一些经快速检测为合格或不合格的商品经检验机构检测后却得出完全相反的结论的，形成快速检测结果的“假阳性”、“假阴性”现象。既然快速检测的结果不具有法定效力又不够准确，那么快速检测还有什么用呢？这在一定程度上影响了开展检测工作的积极性。
3、食品快速检测工作的消费者参与度较低，影响了实际效果。
食品快速检测的重点区域、重点对象，以及检测的样本的选取，目前主要还是由工商部门根据自己的监管经验和当前的重点工作来确定，较少会直接邀请消费者参与，从这些消费者的角度出发，选取其关心的食品种类和项目作为检测的对象。如某工商所近期先后接到多个消费者举报，怀疑某些虾仁、鸡蛋、面条等食品可能存在滥用添加剂的问题，但在制定检测计划的时候，仍然按照市局制定的检测计划，以蔬菜、生猪产品等食品为主，未适时对消费者的食品安全担忧做出回应。这样，使得检测工作既不能在与消费者的共同努力下更具精确性，也未能将工商部门的监管重点与消费者的安全诉求之间形成共鸣，影响了消费者对工商部门检测工作的公众满意度。
4、食品监管点多面广，重复检测现象严重。
当前的食品检测除检验设备、检测试剂由分局统一购臵外，工商所一方面需支付大量费用用于购买样品，另一方面要占用了大量的人力用于开展相关工作，形成了不小的工作压力。实际上，这些食品在进入流通领域之前，其中相当一部分依法已经由质监、农业等部门检测合格，如预包装食品、馒头等米面制品、猪肉等肉类产品，工商部门再次对其进行检测只是在重复其他部门已经进行过的检测而已，换言之，工商部门的部分检测力量被重复检测给占用掉了。而对如现制现售、水发产品等主要需要由流通领域负责监管的食品的检测，在总体检测力量有限的情况下，则不可避免地被削弱了。这无疑造成了在大量浪费了工商部门检测力量的同时，又对部分食品未能尽到监管责任的现象。
二、食品快速检测中问题的成因分析
1、工商所从事检测的人力资源构成状况不够合理。
食品快速检测工作无疑是一项严谨的技术工作，然而从目前的人员构成和职责分配情况来看，与切实承担起该项工作的要求还存有一定的差距。一是知识储备不足，难以适应检测工作的要求。长期以来，工商部门作为竞争秩序主管部门，主要负责对经营主体行为的监管，较少涉及产品质量的管理，一直处在既无相关专业知识的人员，也无相应的技术设备的状况之下，仓促之间怎能胜任？二是人员职责不专，难以深入钻研相关知识。食品工程做为一门学科，需数年的系统学习才能掌握，而工商所承担检测任务的往往是监管组的干部，还要负责日常巡查、消费者申投诉的处理、违法行为的查处等多项工作，重重负累之下，哪里还有时间和精力再去系统地学习相关的专业知识。
2、对食品快速检测技术认识不足。
食品快速检测技术已经在工商部门大量使用，但该项技术是如何产生的，共所依据的原理是什么，对许多人来说还是有些陌生的。
食品快速检测技术是为了解决传统检测过程中，检测仪器昂贵，步骤复杂，成本高昂，对操作人员要求比较高的问题而产生一种检测技术。但它在致力于简化检测的同时，也不可避免地造成了自身的先天不足。一是检测范围有限。为了保证实验结果的准确性，快速检测只适合运用在一些技术成熟、受环境变化影响小的项目上，对其他则无能为力。二是检测结果准确性有限。工商所目前使用的快速检测方法主要是利用显色反应的速测卡和光谱分析法中的分光光度法，这两种方法与实验室主要采用的气相色谱分析法和液相色谱分析法相比，都存在样品基质与待测物不能有效分离，可能产生干扰，形成检测结果的“假阴性”和“假阳性”现象。如对农药残留的快速检测结果，国标GB/T 5009.199-2003中即注明，“符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。”
因此，快速检测法既不能满足对食品质量的全面管理要求，其检测结果也不能直接用做最后结论，其作用主要还是对大量待检样品进行初步筛查，快速掌握待检样品的大致质量状况，从中挑选出可能存在质量问题的食品用于进一步的实验室检测，减少实验室检测量，是传统检测方法的辅助手段。要求仅凭快速检测结果即进行执法或是因快速检测结果不能作为执法依据而认为快速检测是无用的观点正是因为快速检测技术不了解，而形成的错误认识。
3、公众对食品安全和检测技术的认知不足。
由于食品技术具有相当的专业性，普通公众对食品相关知识如食品添加剂的作用和用量、食品的成分与功用以及相关项目的检测方法等并不是很了解，一遇到外观或味道有些异常的食品，甚至仅仅是因为媒体的报道，就有可能产生恐慌情绪，向工商部门求助，但又不能明确地表达他们的诉求，只是笼统地要求工商部门确定该食品是否存在食品安全问题。另外，他们也不了解工商部门到底可以检测哪些项目，常常会提出一些超出工商所检测能力的要求。如近期某工商所接到消费者投诉，称其怀疑所购买的鸡蛋有质量问题，要求检测并告知结果。使得工商所既不能拒绝受理，又无从下手，进造成了消费者认为工商部门是不作为的误解。
4、各监管职能部门间未形成有效的分工合作。
《食品安全法》虽然要求卫生行政、农业行政、质量监督、工商行政管理、食品药品监督管理部门在地方政府的统一领导、指挥下，加强沟通、密切配合，按照各自职责分工，依法行使职权，承担责任，共同维护食品安全，但迄今为止，不得不遗憾地指出，各部门间尚未形成机制化的分工协作模式，仍处于各自为政、相互缺乏沟通协调的状态。在食品检测上，诸如不同种类的食品以及食品的不同项目应由哪些部门为主进行检测，各部门进行的检测结果在多大范围内应相互承认可不予重复检测，经检测的食品的名称、批次，检测的结果等信息如何在各相互关联的监管部门间及时传递等问题都未能予以明确。各部门间亟待细化分段监管基础上的合作方式，形成一个分工合理、信息畅通、协调一致、有效覆盖的监管体制，实现监管资源的合理使用，监测信息的及时披露，监督管理的无缝衔接，有效解决当前食品监管当中的人人负责，又人人负不了责，出了问题通通被问责的被动局面。
三、完善食品快速检测工作的建议
1、提高食品快速检测队伍的专业水平。
如何改进当前食品快速检测工作中存在的问题，提升执法效能，议者见仁见智，提出了许多的建设。有观点认为应当推动修法，赋予快速检测结果可以作为执法依据的地位，以及时查处问题食品；也有观点认为应当加强实验室建设，建立工商部门自己的权威检测机构。前一种观点不能成立的原因前文已有论述，此处不再赘言，那么后一种观点是否是加强食品监管的一剂良药呢？按照我国现行法律规定，食品检验机构要按照国家有关认证认可的规定取得资质认定后，方可从事食品检验活动，而要取得资质需要在实验室条件、实验设备、检验人员、检验能力、实验室管理等一系列条件上达到标准方可，投资巨大且难以一蹴而就；此外，我国目前按照国际通行做法，推行由第三方机构进行检验，以保证检测结果的客观公允，行政管理机关不再自设实验室，原来附属于质监局、食药监局等行政机关的实验室也纷纷剥离开来，成为独立的市场主体。因此，工商部门自建实验室的主张也是行不通的。
改进检测水平，提升监管能力，从当前实际出发可以从以下两个方面着手：一是引进具有食品相关专业背景的专门人才，充实监管队伍。食品快速检测虽然是简化的实验操作，但仍需遵循实验的操作守则，工作人员仍需具备相应的专业素养，才能最大限度地保证检测结果的准确性；此外，应该看到，食品快速检测是食品安全监管工作这个大局的一环，人员的配备也应从有利于建立和完善科学的食品安全监管制度这一前提出发。在食品安全的风险防控领域中，国内外早已
有许多行之有效的管理方法可资借鉴，如HACCP（Hazard Analysis and Critical Control Point危害分析和关键控制点）体系，在鉴别、评价和控制对食品安全至关重要的危害方面享有盛誉，将之成功地移植到工商部门的监管体系中，专业人才的作用是不可或缺的。二是实行食品监管岗位的专职化。在引进专门人才的基础上，可以食品科为核心，以这些具备食品专业知识背景的人员为基础，组成专职负责食品安全监管的工作力量，承担起从许可受理、场地查看、经营者日常行为规范、食品抽检和不合格食品的调查、处臵等与食品专业知识密切相关的环节的监管工作，实行工作岗位的专职化、专业化，逐步完善食品监管的各项工作制度。北京市工商局已经设立了专门的食品监测管理机构，取得了良好的成效，在这方面做出了有益的尝试。
2、引导公众理性参与食品安全监管工作。
公众理性、有序地参与食品安全社会管理，增加工商部门与消费者的互动，将会大大有助于提高工商部门食品检测的针对性，改善食品消费环境，提升消费者信心。工商部门可以：一是积极发挥红盾维权联络点的作用。红盾维权联络点做为工商部门在群众中的延伸和触角，凭借其扎根社区直接联系群众的优点，无疑可以最快地汇积食品消费中发现的各种问题，为工商部门提供许多有价值的信息，大大弥补工商部门在人力资源上的不足，帮助我们将消费者最关心的食品确定食品检测的重点。我们应当借开展红盾维权“五进”活动的契机，切实加强建设、激活功用，助推食品安全监管。二是与消费者坦诚交流。政府有限的监管能力与群众无限的安全需求是一对永恒的矛盾。初涉食品监管领域的工商部门应当如何摆脱无力回应消费者鉴定食品是否安全请求的窘境呢？公开透明是一剂良方。可以通过向公众明示工商部门可以检测的食品种类和具体的理化指标，制作相应的表格，引导消费者在提出诉求时在这些指标种类上做出明确的选择。这样即可以使消费者有明确的心理预期，工商部门可以在能力范围内及时做出回应，避免消费者的误解。三是积极进行各类食品安全知识的科普宣传。如实用类的各种小常识具有形象生动、贴近生活、易于掌握的优点，最为群众所喜闻乐见，在食品安全宣传活动中，讲解各类食品安全小常识的读物，往往被一抢而空。工商部门应当大力开展各种形式的宣传活动，逐步减少群众在食品知识上的盲区。
3、完善食品分段管理体系，形成监管合力。
现在分段管理的大框架已经形成，应当逐步完善其中的各项具体制度。在食
品检测方面，为了减少重复检测，使各部门能够有效衔接配合，可以在食品种类上根据食品的安全隐患产生时间、特点等因素，合理划分不同部门应主要负责检测的食品种类，由一个部门进行检测并承担检测责任，其他部门在该检测结果从实验角度讲仍然能够反映所检测食品的质量状况时，只要认真查验检验证明并对查验行为负责即可；在制度建设上，明确各监管职能部门在各类食品监管上的职责，构建相互之间检测信息的告知和采信的各项程序规范，实现各部门间协作的制度化、规范化；在技术保障上，建立以地方政府为中心的信息网络，统一数据规范，实现各部门的检测数据实时传输、资源整合。如生猪产品在屠宰阶段由动检部门检验合格后，在流通领域，工商部门从信息网络中获取相关检验报数据后，只要查验相关检验检疫合证明，做到单货相符、产品不超出保质期销售即可。以此实现责任归属明确，部门衔接顺畅，监管快捷高效。
15.布鲁菌PCR检测方法的建立 篇十五
1材料
1. 1 菌株
标准菌株:猪种布鲁菌、牛种布鲁菌、羊种布鲁菌,均购自中国兽医药品监察所。对照菌株:大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌,均由中国动物卫生与流行病学中心提供;疑似布鲁菌病的血液样品,由吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心协助采集。
1.2主要试剂
RNase A、DL - 2 000 Marker、Mg Cl2( 25 mmol/L) 、蛋白激酶K、Taq DNA聚合酶( 5 U/m L) 、2. 5 mmol/L d NTP混合液、6 × Loading Buffer、CTAB / Na Cl,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 溶菌酶、DNA提取试剂盒,均购自北京天为时代科技有限公司; Tris碱、无水乙醇、Na2EDTA、琼脂糖、HCl、Tris饱和酚、异戊醇、Triton X - 100、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠( SDS ) 、2 - 巯基乙醇、氯仿,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
2 方法
2. 1 引物设计与合成
从NCBI基因库网站的Gen Bank数据库中查找布鲁菌的基因组序列( 登录号为JF918757) ,选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31 基因的特异性保守区段,大小为1 817 bp,设计PCR引物,引物由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。引物序列: 上游引物P1 ( 20 bp)5' - GCCATCTCAGTTCGGATTGC - 3'; 下游引物P2( 19 bp) 5' - CAGCGCCTTCGGGTAAAAC - 3'。
2. 2 模板DNA的提取
将试验用各菌株分别接种于TS液体培养基中,37 ℃ 培养36 ~ 48 h; 振荡、摇匀后吸取1. 5 m L菌液置2 m L离心管中,10 000 r/min离心1 min; 弃上清液,按DNA提取试剂盒说明书操作,提取细菌DNA于- 20 ℃冰箱中保存,备用。
2. 3 PCR反应体系的建立
采用50 μL反应体系: 上、下游引物( 20 μmol/L) 各1 μL、200 μmol / L d NTP 4 μL、10 × Buffer 5 μL、1. 5 μmol / L Mg2 +3 μL、Taq DNA聚合酶0. 25 μL、3 nmol / L DNA模板1 μL、无菌三蒸水34. 75 μL,最后用已灭菌的超纯水补至终体积为50 μL。同时以水代替模板DNA作为空白对照。
2. 4 PCR反应程序的确定
经优化,PCR反应程序为: 94 ℃ 预变性2 min;94 ℃ 变性45 s,55 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,共35 个循环; 最后72 ℃ 再延伸10 min,4 ℃ 保存。取5 μL的PCR产物,用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。
2.5 PCR特异性的测定
分别取牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌、大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌制备相应的模板DNA,按照建立的布鲁菌PCR检测方法分别进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。
2. 6 PCR敏感性的测定
对牛种布鲁菌模板DNA进行10 倍系列稀释,使各稀释度1 μL模板DNA的含量分别为150 pg、15 pg、1. 5 pg、150 fg、15 fg。按照建立的布鲁菌PCR检测方法,对各稀释度的模板DNA进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。
2. 7 PCR重复性和稳定性的测定
分别以相同批次培养的牛种布鲁菌、羊种布鲁菌和猪种布鲁菌提取的DNA为模板,进行6 次PCR扩增,检测所建立的布鲁菌PCR方法的重复性。分别以不同批次培养的牛种布鲁菌、羊种布鲁菌和猪种布鲁菌提取的DNA为模板,进行6 次PCR扩增,检测所建立的布鲁菌PCR方法的稳定性。
3 结果与分析
3. 1 DNA提取结果
本试验分别对各菌株的DNA进行提取,并用分光光度计分别检测其OD值,结果OD260/ OD280值均在1. 60 ~ 1. 75 之间。PCR扩增产物经0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测( 100 V恒压1. 5 h) ,结果见图1。
M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌;2.羊种布鲁菌;3.猪种布鲁菌;4.大肠杆菌;5.马流产沙门杆菌;6.克雷伯杆菌。
由图1 可知,6 种细菌的DNA条带均清晰可见,无拖尾现象,亮度达到了预期效果,说明本试验提取的DNA含量较高,没有受到RNA和蛋白质污染。
3. 2 PCR扩增结果
本试验对牛种布鲁菌的DNA进行PCR扩增,同时以水作为空白对照,PCR扩增产物经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90 V恒压1 h) ,结果见图2。
由图2 可知,目的条带出现在250 ~ 500 bp之间,且偏向500 bp处,目的条带大小为384 bp,这与预期结果一致,而空白对照泳道未出现扩增条带。
M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌PCR扩增结果;2.空白对照。
3. 3 PCR特异性试验结果
大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌与布鲁菌的交叉反应较多,因此本试验分别提取牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌、大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌的DNA进行PCR扩增试验,其产物经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90V恒压1 h) ,结果见图3。
M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌;2.羊种布鲁菌;3.猪种布鲁菌;4.大肠杆菌;5.马流产沙门杆菌;6.克雷伯杆菌。
由图3 可见,牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌的扩增条带出现在250 ~ 500 bp之间,且靠近500 bp处,即384 bp,而大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌均未出现相应DNA的PCR扩增产物,即均呈阴性。
3. 4 PCR敏感性试验结果
对牛种布鲁菌模板DNA进行10 倍系列稀释,共稀释5 个浓度,按照建立的布鲁菌PCR检测方法,对这5 个稀释度的模板DNA分别进行PCR扩增,并用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90 V恒压1 h) ,结果见图4。
由图4 可见,牛种布鲁菌的DNA稀释100 倍时仍有清晰的扩增条带出现,而高于此稀释倍数未出现扩增条带。
3. 5 PCR重复性和稳定性试验结果
本试验首先对相同批次的布鲁菌培养物进行PCR扩增,重复6 次,试验结果均相同; 然后,再对不同批次的布鲁菌培养物进行PCR扩增,重复6 次,试验结果也均相同。说明本试验建立的布鲁菌PCR检测方法的重复性和稳定性较理想。
M.DL-2 000 Marker;1.150 pg;2.15 pg;3.1.5 pg;4.150 fg;5.15 fg。
4 讨论
布鲁菌是人畜共患病的病原菌,给人类健康及畜牧业发展造成了极大危害,受污染的乳制品和肉制品等已成为布鲁菌病重要的传染源,如何快速检测布鲁菌,对于布鲁菌病防治具有重要意义。
随着分子生物学技术的发展和完善,A. Feketi等[1]最早进行了布鲁菌PCR检测方法的探索,首先对布鲁菌编码43 ku外膜蛋白( OMP) 基因进行PCR扩增,然后又对布鲁菌BCSP31、16SrRNA、OMP2b等基因展开了PCR扩增方法的研究,之后成功地用于布鲁菌病的特异性诊断和临床实践应用中。1995年,唐浏英等人设计了多组引物对布鲁菌36 ku的OMP31 基因进行扩增,结果表明,不同引物的敏感性存在差异( 10 fg ~ 100 pg) 。邱昌庆等[2]对牛奶中的布鲁菌进行PCR扩增检测,结果表明,灵敏度为50 cfu / m L。G. G. Baily等[3]选取牛种布鲁菌的31 ku外膜蛋白基因的核苷酸保守序列设计5 个引物B1 ~B5,并以5 个引物的不同组合进行PCR扩增试验,结果表明,B4 和B5 为最佳配对引物。李玉兰等[4]用此对引物对6 个种的布鲁菌DNA进行扩增,结果表明,此对引物特异性良好,可检出的布鲁菌DNA最低敏感值为0. 95 pg。
在本试验中,根据编码牛种布鲁菌膜外蛋白BSCP31 基因核苷酸序列设计1 对PCR引物,经PCR反应条件的优化和反应程序的确定,成功扩增出了预期的384 bp目的基因片段,PCR敏感性试验结果显示最低可检测到1. 5 pg。本试验结果与G. G. Baily等[3]、李玉兰等[4]的研究结果相近,说明本试验设计的引物所扩增出的384 bp核苷酸保守序列具有较高的同源性。可见,本试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有特异性强,敏感性高,操作简单、方便、快速的特点,对布鲁菌的快速检测具有重要的实用意义。
摘要：为了研究快速检测布鲁菌的通用PCR体系,试验从GenBank数据库中查到布鲁菌的基因组序列(登录号为JF918757),并选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31基因的特异性保守区段,设计了1对PCR引物,对PCR扩增条件进行优化。结果表明:能够扩增出牛种、羊种、猪种布鲁菌模板DNA的384 bp目的基因片段,而对大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌均呈阴性,最低检出浓度为1.5 pg/μL,对同批和不同批的菌株进行6次PCR扩增,重复性和稳定性较好。说明试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性。