方法学验证指南

方法学验证指南（精选11篇）

1.方法学验证指南 篇一

建设银行个人网上银行短信验证效劳客户使用指南

一、业务简介

〔一〕效劳定义

个人网上银行短信验证效劳是指我行个人网银客户在使用网银盾进行交易确认过程中，用

短信配合验证的一种交易确认效劳。

〔二〕适用对象

使用建行网银盾的个人网上银行高级客户。已绑定动态口令卡、动态令牌的网银盾用户取消动态口令卡、动态令牌的绑定后可以选用本效劳。

〔三〕适用范围

个人网上银行短信验证效劳涉及的交易类型为活期转账汇款、定活互转、向企业转账、跨行转账、批量转账、预约转账等，暂不含投资理财、代理缴费、网上支付等业务。

〔四〕支持账户类型

活期存折、龙卡通、理财卡、准贷记卡。

二、业务特色

〔一〕在线自助开通。

〔二〕在线自助撤销。

〔三〕在线自助设定限额。

〔四〕多渠道交叉身份认证，确保客户资金平安。

〔五〕

95533自动语音播报交易信息及短信验证码至用户，有效解决短信接收不及时问题。

三、客户操作流程

〔一〕在线自助开通

1、如果您已在我行办理个人网上银行业务签约并申领建行网银盾成为高级客户，那么请您：登录个人网上银行→进入平安中心-点选短信效劳〔安插网银盾〕，您可根据自己的需要，自助选择开通个人网上银行短信验证效劳

2、在阅读?中国建设银行自助开通

短信验证效劳须知?并点选同意后，请您确认在签约时预留的号码

3、在您点击“确认〞选钮后，系统将自动从95533短信平台给您确认的发送信息，内容为：尊敬的客户，您正在进行自助开通短信效劳的操作。短信验证码为：******。[建设银行]

。短信验证号码为6位数。

4、请您首先设置自己的短信验证起始额度，当您的转账类交易金额大于此额度时，将需要进行短信验证，以保障您的资金平安

5、然后请输入您的个人网上银行交易密码

6、然后请您在规定的时间内输入接收到的短信验证码，短信验证码有效期为10分钟，超过10分钟那么失效。

7、如您未收到短信验证码，我行将有两种方式为您重新效劳：重新获取和

接听

8、当您点选重新获取后，将接到短信号码为“95533〞的短信息，我行重新为您发送验证短信至您确实认

号码：

9、当您点选

接听后，将接到来电号码为“95533〞〔或028-95533〕的，我行自动语音系统将为您播报短信验证号码

10、在确认交易密码和短信附加码后，系统将启用建行网银盾校验证书，并请您输入密码确认

11、恭喜您开通短信验证效劳成功！这样您的资金平安又增加了一道无形的保护，也再次感谢您使用中国建设银行电子银行产品，愿我们的效劳与您一路同行！

〔二〕在线自助撤销

1、假设您不再使用个人网上银行短信验证效劳，可通过登录个人网上银行-平安中心-短信效劳，自助撤销该效劳

2、撤销短信验证效劳时，系统将向您原有的号码发送短信验证码

3、客户将收到的短信验证码输入网上银行系统

4、启用网银盾校验客户身份后，撤销短信验证效劳

5、短信验证效劳撤销成功

〔三〕在线自助修改起始金额

1、假设您想修改个人网上银行短信验证效劳的起始额度，可通过登录个人网上银行-平安中心-短信效劳，自助进行额度设置

2、输入您要更改的起始金额

3、输入交易密码和短信验证码

4、启用网银盾校验客户身份后，修改起始金额

5、短信验证效劳起始金额修改成功。

〔四〕短信验证效劳流程

1、您自助登录个人网上银行，办理转账汇款类业务：

2、我行将向您预留的号码发送付款交易信息〔付款账号尾号、收款账号尾号、收款人姓名、转账金额等〕及短信验证码：

3、您确认交易信息无误后，将收到的短信验证码输入网上银行系统，启用网银盾校验身份继续办理转账汇款业务。

4、您在因各种原因无法及时接收到

短信验证码的情况下，可点击网银页面中的“

接听〞按键，95533自动来电到客户预留的号码，客户可接听95533自动语音播报短信验证码。

5、转账成功！在无形的保护中，您就可以平安又方便地管理资金啦！

四、温馨提示

〔一〕限额设置

您可登录个人网上银行自助设置短信验证最低限额。如果交易金额大于客户设置的短信验证限额，那么需要进行短信验证；如果交易金额小于客户设置的短信验证限额，那么不需要进行短信验证。

〔二〕效劳费用

作为给您提供的一项平安增值效劳，我行暂定在业务推广期，不收取费用。

2.方法学验证指南 篇二

关键词：奥硝唑注射液,薄膜过滤法,无菌检查法,方法学验证

奥硝唑作用于厌氧菌、阿米巴虫、贾滴虫和毛滴虫细胞的DNA, 使其螺旋结构断裂或阻断其转录复制而至其死亡, 达到抗菌抗原生质的目的。当建立药品的无菌检查时应进行方法的验证, 以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。

1 材料与仪器

1.1 试验样品

奥硝唑注射液 (规格10ml:0.5g, 批号:110411, 数量:160支/批, 誉衡药业股份有限公司)

1.2 试验用菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26 003]、大肠埃希菌[CMCC (B) 44 102]、枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63 501]、生孢梭菌[CMCC (B) 64 941]、白色念珠菌[CMCC (F) 98001]、黑曲霉[CMCC (F) 98003], 以上均由中检所提供。

1.3 试验用培养基

营养琼脂培养基 (批号090703) 、玫瑰红钠琼脂培养基 (批号0911172) 、硫乙醇酸盐流体培养基 (批号091230) 、改良马丁培养基 (批号091014) 、0.1%蛋白胨水溶液 (批号:090316) , 以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供。

1.4 仪器

BSC-1100IIB2型生物安全柜 (北京东连哈尔仪器制造有限公司) 、SW-CJ-2FD型超净工作台 (苏州净化设备有限公司) 、HTY-2000B型智能集菌仪 (杭州泰林生物技术设备有限公司) 、一次性全封闭集菌培养器 (杭州泰林生物技术设备有限公司) 、LRH-250型生化培养箱 (上海一恒科技有限公司) 。

2 方法

2.1 菌液制备

取经30~35℃培养18~24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌液体培养物各1ml分别加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中, 依次10倍稀释, 金黄色葡萄球菌至10-6, 大肠埃希菌至10-7, 枯草芽孢杆菌至10-5, 生孢梭菌至10-7。

取经23~28℃培养24~48h的白色念珠菌液体培养物1ml, 加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中, 依次10倍稀释至10-5。

取经培养5~7天的黑曲霉斜面培养物, 加入3~5ml含0.05% (ml/ml) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱转至另一试管, 取1ml加至9ml含0.05% (ml/ml) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液中, 依次10倍稀释至10-4。

2.2 菌液计数

分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各1ml于培养皿中, 每种菌做2皿, 加营养琼脂培养基, 取白色念珠菌、黑曲霉菌各1ml于培养皿中, 每种菌做2皿, 加玫瑰红钠琼脂培养基, 按规定条件培养, 结果计数见表1。以上菌液均小于100cfu/ml, 备用[3]。

2.3 方法学验证试验

2.3.1 试验组:

取供试品120支, 每筒20支, 共制备6个滤筒。先用0.1%蛋白胨水溶液润湿滤膜, 再用其冲洗, 每筒总冲洗量500ml, 每次100ml, 在每筒中分别加入已制备好的上述各菌菌悬液各1ml。向金葡, 大肠, 枯草, 生孢筒内分别加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基30~35℃培养3~5天, 向白念, 黑曲霉筒内分别加入100ml改良马丁培养基23~28℃培养3~5天, 逐日观察。

2.3.2 对照组

另取6个筒, 分别加入1ml各试验菌, 再加入相应培养基按规定温度培养3~5天, 逐日观察。

2.3.3 供试品对照组。

取供试品40支, 每筒20支, 共制备2个滤筒。先用0.1%蛋白胨水溶液润湿滤膜, 再用其冲洗, 每筒总冲洗量500ml, 每次100ml, 再分别加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基和100ml改良马丁培养基, 按规定温度培养3~5天, 逐日观察。

2.3.4 阴性对照组。

取0.1%蛋白胨水溶液适量, 分别置2个滤筒内过滤, 再分别加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基和100ml改良马丁培养基, 按规定温度培养3~5天, 逐日观察。

3 结果

培养结束后试验组和对照组微生物均生长良好, 供试品对照组和阴性对照组均无微生物生长, 观察结果见表2。

4 结论

根据3批供试品验证试验结果, 试验组中试验菌均生长良好, 并与各对照组中相应的菌落生长情况相似, 供试品对照组和阴性对照组均无菌落生长。由此说明, 奥硝唑注射液可采用薄膜过滤法检查, 在此检验量和检验条件下无抑菌作用。因此可按照此检查条件和检查方法以0.1%蛋白胨水溶液每筒500ml做冲洗液, 进行奥硝唑注射液的无菌检查。

参考文献

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].2012年版二部.北京:化学工业出版社, 2010:附录103-107.

[2]费嘉, 杨峰, 贾阳等.复方利多卡因注射液无菌检查法验证[J].医药导报, 2010, 29 (6) :798-799.

3.紫丹活血片微生物检查方法学验证 篇三

关键词：紫丹活血片；微生物限度检查；常规法；薄膜过滤法；稀释法；冲洗量；方法学验证

中图分类号：R927.1文献标识码：A

文章编号：1007-2349(2007)12-0034-02

紫丹活血片具有活血化瘀，理气止痛之功能.临床用于气滞血瘀所致胸痹(冠心病心绞痛)、眩晕(脑动脉硬化)。当建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定及控制菌检查。按《中国药典》2005版的有关要求，通过接种代表性的阳性菌株，发现紫丹活血片具有抑菌活性，采用薄膜过滤法，可以消除紫丹活血片抑菌活性，确定了薄膜过滤法的最佳冲洗量和实验条件，建立了微生物限度检查方法。

1仪器与材料

1.1仪器HTY-Ⅲ型智能集菌仪，(杭州泰林医疗器械厂生产；开放式一次性薄膜过滤器，北京牛牛基因技术有限公司，批号：20051005)。

1.2样品紫丹活血片(云南天利药业有限公司生产，规格0.4g／粒，批号20060301)。

1.3培养基胆盐乳糖增培养基(批号，05222)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号，030710)，营养琼脂培养基(批号，050328)，改良马丁琼脂培养基(批号，010315)，营养肉汤培养基(批号，041010)，PH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液(批号，050217)

1.4菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(F)44102]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003](中国药品生物制品检定所提供)。

2方法验证

微生物限度检查的验证实验按中国药典2005版微生物限度检查法(附录ⅪJ)常规法和薄膜过滤法进行。

2.1菌液制备取上述经34℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml，加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-5～10^-7备用；取经24℃培养18～24h的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml.加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-5备用；取经培养一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9％氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊后，取1ml加入0.9％氯化钠溶液中10倍稀释至10^-4备用。

2.2菌液的检验取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌10^-5～10^-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48h，计数，应约为50～100cfu／ml；取上述白色念珠菌10^-5～10^-6稀释液及上述黑曲霉菌10^-4孢子悬液各1ml，用45℃琥红琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养，逐日观察计数，应约为50～100cfu／ml。结果见表1。

2.3供试液制备取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml，混匀，取适量3000转／分离心10min作为1:10的供试液。

2.4回收率的测定

2.4.1细菌数霉菌数常规法测定试验组：取1:10供试液1ml、50～100cfu试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果。菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)。供试品对照组：取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果，测定供试品本底菌数。

2.4.2细菌数薄膜过滤法测定取1:10的供试液1ml，注入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器)，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml共4次(总冲洗400m1).加1ml(50～100cfu)试验菌，抽干后，取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中，置规定温度培养48h，结果见表2。

2.5回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率：回收率＝(试验组一供试品对照组)÷菌液组×100％

2.6控制菌检查方法的验证

2.6.1常规法取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液1ml，置35℃培养24h；取稀释液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基，置35℃培养24h.作为阴性对照；取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中.同时加入上述大肠埃希菌液1ml.置35℃C培养24h；取稀释液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24h，作为阴性对照；取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。

2.6.2稀释法取1:10供试液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液1ml，置35℃培养24h；取稀释液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基，置35℃培养24h，作为阴性对照；取1:10供试液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。

3结果

从表2结果可以看出：该供试品接种5株阳性试验菌株，常规法对枯草杆菌、白色念珠菌回收率均低于70％，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均高于70％；薄膜过滤法对枯草杆菌、白色念珠菌回收率均高于70％。说明该样品具有抑菌活性，细菌数、霉菌数、酵母菌均需采用薄膜过滤法进行测定。见表3。

4结论

4.定量分析方法的方法学验证 篇四

定量分析方法验证的目的是证明采用的含量测定方法适合于相应分析要求，在进行定量分析方法学研究或起草药品质量标准时，分析方法需经验证。

验证内容有：线性、范围、准确度、精密度（包括重复性和重现性）、检测限、定量限和耐用性等。

一，线性

线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。

应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备五份供试样品；以测得的响应信号对被测物浓度作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。回归方程的相关系数(r)越接近于 1，表明线性关系越好。

用 UV 法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液，吸光度 A 一般在 0.3 ～ 0.7，浓度点 n ＝ 5，用浓度 C 对 A 作线性回归，得一直线方程，方程的截距应接近于零，相关系数 r 应大于 0.9999。

用 HPLC 法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液，浓度点 n ＝ 5 ～ 7，用浓度 C 对峰高 h 或峰面积 A 或被测物与内标物的响应值之比进行线性回归或非线性拟合（如 HPLC-ELSD），建立方程，方程的截距应趋于零，相关系数 r 应大于 0.999。

线性关系的数据包括相关系数、回归方程和线性图。

二，范围

范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。

三，精确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。

1.测定方法的准确度

可用已知纯度的对照品做加样回收率测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。

在加样回率收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

回收率 % = [(C-A)/B]*100%

式中，A 为供试品所含被测成分量； B 为加入对照品量； C 为实测值。

2.数据要求

在规定范围内，取同一浓度的供试品，用 6 个测定结果进行评价；或设计 3 个不同浓度，每个浓度各分别制备 3 份供试品溶液进行测定，用 9 个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在 l ∶ 1 左右，其他两个浓度分别约为供试品含量的 80% 和 120%。应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率(％)计算值，以及回收率(％)的相对标准偏差(RSD)或可信限。

四，精密度

精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。

1.精密度的表示方法

气相色谱法和高效液相色谱法是对同一供试液进行至少五次以上的测定；精密度一般用相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)表示： RSD= 标准偏差 /平均值 ′ 100 ％

精密度报告的数据应包括平均值、可信限及相对标准偏差。

一般在一天之内进行的精密度考察称为日内精密度(inter-day variability)；在三天之内进行的精密度考察称为日间精密度(intra-day variability)。

有时为了考察随机变动因素对精密度的影响，还需设计进行中间精密度试验，变动因素包括不同日期、不同分析人员和不同设备。

2.重复性（repeatability）

是指在同一条件下对同一批样品，从样品供试品液制备开始，制备至少六份以上供试品溶液(即 n>6), 或设计 3 个不同浓度，每个浓度各分别制备 3 份供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差(RSD)。RSD 一般应根据样品含量高低、含量测定方法和繁简进行制订，如含量很低一般不大于 5 ％；如含量较高，则应从严要求。

3.重现性（reproducibility）

是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果，协同检验及重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验样品本身的质量均匀性和储存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。

五，检测限

检测限是指试样中被测物质能被检测出的最低浓度或量。检测限是一种限度检验效能指标，即反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。根据所采用的分析方法来确定检测限。

当用 GC 和 HPLC 法时，可用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以 S / N ＝ 2 或 S / N ＝ 3 时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。检测限的报告数据应附图谱，说明测试过程和检测限结果。

六，定量限

定量限是指样品中被测物质能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。常用信噪比法测定定量限。一般以 S / N ＝ 10 时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。

七，耐用性

耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例或 pH 值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速及检测波长等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层展开时温度及相对湿度的变化等。

5.验证肾虚的方法介绍 篇五

判断肾虚第一招、心血管方面，会出现心悸气喘、胸闷、浮肿等

1、晨起或劳累后，足踝及小腿会肿胀，下眼皮肿胀、下垂。

2、在月经到来的前两三天，四肢会发胀、胸部会胀满、胸部会串痛。

判断肾虚第二招、全身方面，会全身倦怠、头脑不清醒、注意力不集中、记忆力减退等

1、工作效率明显下降，上司明显不满你的表现。

2、记忆力下降。昨天想好的事情，今天却记不起来。

3、上班无精打采，上班仅仅1个小时，就会胸闷气短，盼望早早回家休息，但上床后却睡不着。

判断肾虚第三招、神经肌肉方面，会经常失眠、头晕脑胀、腰酸背痛、下肢乏力等

1、常常感到困倦，却无法熟睡，多梦且易惊醒。

2、体重有明显的增加或下降趋势。早上起床，会发现腹部肌肉松弛无力，苍白无血色。

3、不提重物，走3层楼就两腿无力;坐在椅子上看电视，多余2个小时就感到腰酸。

判断肾虚第四招、胃肠道方面，会食欲不振、恶心、胃疼、腹痛腹泻、便秘等

1、在正常饮水情况下，夜尿超过3次。而且，小便无力，淋漓不尽，大便粘滞不畅。

2、如果吃生冷干硬食物，常常感到胃部不适、口中粘滞不爽。

3、一日三餐，进食很少。即使口味很适合自己，也感觉无味。

判断肾虚第五招、五官方面，会视疲劳、鼻塞、眩晕、耳鸣、咽喉不舒服等

1、容易感冒，感冒后就会鼻塞、流鼻涕、咽干、咽痛、喉咙有紧缩感等。

6.登录异常须发短信验证解决方法 篇六

出现帐号异常的原因大部分是由于帐号被盗，被 者使用后存在违规操作行为所导致，系统为了保护正常帐号不被 者继续操作会将帐号进行暂时冻结，验证解除后即可恢复正常使用，

 

登录异常须发短信验证解决方法

 

。

一般的违规操作有：

1. 在他人微博下方评论相同类似内容;

2. 频繁@他人进行转发;

3. 大批量关注陌生帐号等违规操作行为

(以上情况仅做举例，正常冻结异常会包括但不仅限于举例内容)，

为了保护您的帐号不被 者利用，以及防止此类帐号继续此类操作行为影响他人使用微博，故该帐号会被系统暂时冻结，您可以通过系统验证的方式进行解除，解除后即可恢复正常。

另外，广告微博帐号、营销帐号、虚假抽奖帐号以及僵尸粉等非正常帐号，也有可能会受到系统冻结。

解除办法：

1、在提示页面输入手机号码，点击下一步;

2、使用刚才输入的手机号码按照提示发送短信至1069 0090 10015，发送后点击“我已发送，立即验证”;    3、等待系统验证短信;    4、验证成功，进入微博，    温馨提示：

1、若您操作时提示您手机验证次数过多，有可能是此手机号短时间内存在验证操作，建议您换一个手机号码进行验证即可，手机短信验证方式仅作为判断帐号是否为非人工使用，并且防止同一用户解除大量垃圾帐号的异常，并不会产生任何绑定关系，请您放心验证。

2、若您操作时提示您操作频繁或者验证次数过多，则有可能是您短时间内出现过多次冻结并验证的情况，建议您可以尝试更换验证手机号码、更换网络环境或者明天再进行验证(不建议您再次验证时使用相同的网络环境或手机号码)。

7.基于类型的密码协议验证方法 篇七

密码协议安全性的证明问题一直是信息安全领域研究的热点和难点。协议的设计和分析的主要任务可简化为:一是用于获得特殊安全目标的原理;二是用于判断是否达到了这些目标的规则。本文主要探讨使用形式化的规则来获得密码协议安全属性的方法。这些规则基于传统的等级和信息流的思想, 通过将其扩展后用来处理密码协议中的并发进程。在安全协议的分析中, 该方法要求标记出所有的数据片和其相应的通信信道的安全等级:public或secret。secret级别的数据不应当在public的信道上发送, secret级别的信道不应当被所有人无差别地使用。本文的规则是基于Spi演算扩展语法的一种类型规则。通过这些规则可以向用户担保, 如果协议通过了类型检测, 则该协议没有泄漏任何秘密的信息。

1 Spi演算的扩展语法

本文所构造的类型系统中使用了在Spi演算的基础上提出的一种扩展语法。扩展的Spi演算具体语法形式如下:

在扩展Spi演算的限制、输入以及加密进程中, 变量x的受限制情况与Spi演算是相同的, 用于描述一个完整协议运行的扩展Spi演算的进程也一定是闭的。

类似于Spi演算, 在扩展Spi演算中也定义了两种进程间的关系。

简化关系f是一种公理化的形式, 描述了进程通过其本身的计算所达到的另一种状态, 类似于Spi演算中的反应关系。结构等价关系≡也是一种公理化的关系, 该关系用于转换进程, 使之可以进一步使用简化关系。简化关系f和结构等价关系≡都是定义在闭进程上的进程间关系, 可看作是扩展Spi演算的操作语义。

这两种进程间关系的具体形式定义如下:

结构等价关系

简化关系

$\overline{\text{a}}\langle \text{Μ}\rangle .\text{Q}|\text{a}(\text{x}).\text{Ρ}\text{f}\text{Q}|\text{Ρ}\{\text{Μ}/\text{x}\}\text{R}\text{e}\text{d}\text{Ι}/\text{Ο}$

case{M}k of {x}k in P else Q f P{M/x} Red Sdec1

$\frac{\text{L}\text{不}\text{是}\{\text{Μ}\}{}_{\text{k}}\text{形}\text{式}}{\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{L}\text{o}\text{f}\{\text{x}\}{}_{\text{k}}\text{i}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}\text{f}\text{Q}}$Red Sdec2

case {[M]}k of {[x]}k in P else Q f P{M/x} Red Pdec1

$\frac{\text{L}\text{不}\text{是}\{[\text{Μ}]\}{}_{\text{k}{}^{+}}\text{形}\text{式}}{\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{L}\text{o}\text{f}\{[\text{x}]\}{}_{\text{k}{}^{+}}\text{i}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}\text{f}\text{Q}}$Red Pdec2

case[{M}]k- of [{x}]k- in P else Q f P{M/x}

Red Checksign1

$\frac{\text{L}\text{不}\text{是}[\{\text{Μ}\}]{}_{\text{k}{}^{-}}\text{形}\text{式}}{\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{L}\text{o}\text{f}[\{\text{x}\}]{}_{\text{k}{}^{-}}\text{i}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}\text{f}\text{Q}}$Red Checksign2

if M=M then P else Q ϕ P Red Cond1

$\frac{\text{Μ}\ne \text{Ν}}{\text{i}\text{f}\text{Μ}=\text{Ν}\text{t}\text{h}\text{e}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}\text{ϕ}\text{Q}}$Red Cond2

$\frac{\text{Ρ}\text{ϕ}\text{Q}}{\text{Ρ}|\text{R}\text{ϕ}\text{Q}|\text{R}}$Red Par

$\frac{\text{Ρ}\text{ϕ}\text{Q}}{(\text{υ}\text{a})\text{Ρ}\text{ϕ}(\text{υ}\text{a})\text{Q}}$Red Res

$\frac{\text{Ρ}\text{'}\equiv \text{Ρ},\text{Ρ}\text{ϕ}\text{Q},\text{Q}\equiv \text{Q}\text{'}}{\text{Ρ}\text{'}\text{ϕ}\text{Q}\text{'}}\text{R}\text{e}\text{d}\equiv$

2 基于扩展Spi演算的类型系统

在关于密码协议安全性的分析方法中, 有一种著名的信息流控制方法。该方法依靠将客体和主体划分安全等级, 并且保证没有数据从高安全级别流向低安全级别。本文中, 安全级别被形式化为类型, 信息流的控制需要依靠类型规则来进行。

在扩展Spi演算基础上, 构建了一个基于扩展Spi演算的类型系统, 该类型系统包含基本类型定义、类型操作和类型规则三部分。基本类型定义了数据的安全级别, 类型操作是对类型规则具体应用的说明。通过类型规则该类型系统可以向用户担保, 如果一个描述协议的进程在一定的环境中是类型完善的, 则该协议不会泄漏任何秘密级别的消息。

2.1 基本类型定义

基于扩展Spi演算的语法, 可以构造构建一个类型系统, 其具体类型定义如下:

T ::= 类型

Public 公共数据

Secret 秘密数据

T1 ×. . . ×Tn 类型向量

C[T] 秘密类型的信道

KSecret[T] 秘密类型的对称密钥

EKSecret[T] 秘密类型的非对称加密密钥

DKSecret[T] EKSecret[T]对应的解密密钥

EKPublic[T] 公共类型的非对称加密密钥

DKPublic[T] EKPublic[T]对应的解密密钥

下面, 进一步定义该类型系统中子类型关系≤:

C[T]≤Secret KSecret≤Secret DKSecret[T]≤Secret

EKSecret[T] ≤Secret DKPublic[T] ≤Secret EKPublic[T] ≤Public

如果∀i∈{1, ..., n}, Ti=Public, 则T1×…×Tn≤Public。

如果∀i∈{1, ..., n}, Ti=Secret, 则T1×…×Tn≤Secret。

如果T1≤T′1, ..., Tn≤T′n, 则T1×…×Tn≤T′1×…×T′n。

在基本类型定义的基础上, 可将TPublic类型表示为:

TPublic={T|T≤Public}

={Public, EKPublic[T]}∪{T1×...×Tn|∀i∈{1, ..., n}, Ti∈TPublic}。

2.2 类型操作

该类型系统中定义的类型操作有:

(1) 如果T ≤ Public, 则conveys (T) =TPublic。

(2) conveys (C[T]) ={T′|T′ ≤ T}。

(3) Ontuple (T1, …, Tn) =T1×…×Tn。

(4) 如果T1 ≤ Public, T2 ≤ Public, 则Osenc (T1, T2) = Public。

(5) 如果T′ ≤ T, 则Osenc (T′, KSecret[T]) =Public。

(6) 如果T1≤Public, T2≤Public, 则Openc (T′, KSecret[T]) =Public。

(7) 如果T′ ≤ T, 则Openc (T′, EKL[T]) =Public。

(8) Oithn (T1×…×Tn) ={Ti}。

(9) 如果T ≤ Public, 则Osdec (Public, T) = TPublic。

(10) Osdec (Public, Ksecret[T]) ={T′|T′ ≤ T}。

(11) 如果T ≤ Public, 则Opdec (Public, T) = TPublic。

(12) Opdec (Public, DKSecret[T]) ={T′|T′ ≤ T}。

(13) Opdec (Public, DKPublic[T]) ={T′|T′ ≤ T}∪TPublic。

(14) 如果私钥k-的级别为DKL (T) , 则对应公钥k+的级别为EKL (T) 。

如果私钥k-的级别为Public, 则对应公钥k+的级别为Public。

(15) 如果T′ ≤ T, 那么OH (T) =Public。

(16) 若T既不是Public类型, 也不是C[T]类型, 则conceys (T) =Ø。

(17) 若Of (T1, …, Tn) 未定义, 则Og (T1, …, Tn) =Ø。

函数Of和Og给出了加密操作和解密操作的应用规则, 它们以类型作为参数, 返回的结果是加密操作f和解密操作g运行结果的类型。

2.3 类型规则

下面进一步给出基于扩展Spi演算类型系统的类型规则, 符号u表示名和变量, 符号T代表具体的类型。

· 关于环境的规则

$\overline{\varnothing |-\diamond }\text{E}\text{n}\text{v}\varnothing$

$\frac{\text{E}|-\diamond \text{u}\notin \text{d}\text{o}\text{m}(\text{E})}{\text{E},\text{u}:\text{Τ}|-\diamond }$Env atom

· 关于项的规则

$\frac{\text{E}|-\diamond (\text{u}:\text{Τ})\in \text{E}}{\text{E}|-\text{u}:\text{Τ}}\text{A}\text{t}\text{o}\text{m}$

$\frac{\text{E}|-\text{Μ}:\text{Τ}\text{Τ}\le \text{Τ}\text{'}}{\text{E}|-\text{Μ}:\text{Τ}\text{'}}\text{S}\text{u}\text{b}\text{s}\text{u}\text{m}\text{p}\text{t}\text{i}\text{o}\text{n}$

$\frac{\text{E}|-\diamond \text{E}|-\text{Μ}:\text{Τ}}{\text{E}|-\text{Η}(\text{Μ}):\text{Ο}{}_{\text{h}\text{a}\text{s}\text{h}}(\text{Τ})}\text{Η}\text{a}\text{s}\text{h}$

$\frac{\text{E}|-\diamond \text{E}|-\text{Μ}{}_1:\text{Τ}{}_1,\text{E}|-\text{Μ}{}_2:\text{Τ}{}_2}{\text{E}|-\{\text{Μ}{}_1\}{}_{\text{Μ}{}_2}:\text{Ο}{}_{\text{s}\text{e}\text{n}\text{c}}(\text{Τ}{}_1,\text{Τ}{}_2)}\text{S}\text{e}\text{n}\text{c}$

$\frac{\text{E}|-\diamond \text{E}|-\text{Μ}{}_1:\text{Τ}{}_1,\text{E}|-\text{Μ}{}_2:\text{Τ}{}_2}{\text{E}|-\{\text{Μ}{}_1\}{}_{\text{Μ}{}_2}:\text{Ο}{}_{\text{p}\text{e}\text{n}\text{c}}(\text{Τ}{}_1,\text{Τ}{}_2)}\text{Ρ}\text{e}\text{n}\text{c}$

$\frac{\text{E}|-\diamond \text{E}|-\text{Μ}{}_1:\text{Τ}{}_1,\text{E}|-\text{Μ}{}_2:\text{Τ}{}_2}{\text{E}|-\{\text{Μ}{}_1\}{}_{\text{Μ}{}_2}:\text{Ο}{}_{\text{s}\text{i}\text{g}\text{n}}(\text{Τ}{}_1,\text{Τ}{}_2)}\text{S}\text{i}\text{g}\text{n}$

· 关于进程的规则

$\frac{\text{E}|-\diamond }{\text{E}|-0}\text{Ν}\text{i}\text{l}$

$\frac{\text{E}|-\text{Ρ}\text{E}|-\text{Q}}{\text{E}|-\text{Ρ}|\text{Q}}\text{Ρ}\text{a}\text{r}\text{a}\text{l}\text{l}\text{e}\text{l}$

$\frac{\text{E}|-\text{Ρ}}{\text{E}|-!\text{Ρ}}\text{R}\text{e}\text{p}\text{l}\text{i}\text{c}\text{a}\text{t}\text{i}\text{o}\text{n}$

$\frac{\text{E},\text{a}:\text{Τ}|-\text{Ρ}}{\text{E}|-(\text{υ}\text{a})\text{Ρ}}\text{R}\text{e}\text{s}\text{t}\text{r}\text{i}\text{c}\text{t}\text{i}\text{o}\text{n}$

$\frac{\text{E}|-\text{Μ}:\text{Τ}\text{E}|-\text{Ν}:{\text{Τ}}^{\prime }{\text{Τ}}^{\prime }\in \text{c}\text{o}\text{n}\text{v}\text{e}\text{y}\text{s}(\text{Τ})\text{E}|-\text{Ρ}}{\text{E}|-\overline{\text{Μ}}\langle \text{Ν}\rangle .\text{Ρ}}\text{Ο}\text{u}\text{t}\text{p}\text{u}\text{t}$

$\frac{\text{E}|-\text{Μ}:\text{Τ}\forall {\text{Τ}}^{\prime }\in \text{c}\text{o}\text{n}\text{v}\text{e}\text{y}\text{s}(\text{Τ}),\text{E},\text{x}:{\text{Τ}}^{\prime }|-\text{Ρ}}{\text{E}|-\text{Μ}(\text{x}).\text{Ρ}}\text{Ι}\text{n}\text{p}\text{u}\text{t}$

$\frac{\text{E}|-\text{Μ}:\text{Τ}\text{E}|-\text{Ν}:{\text{Τ}}^{\prime }\text{i}\text{f}\text{Τ}={\text{Τ}}^{\prime }\text{t}\text{h}\text{e}\text{n}\text{E}|-\text{Ρ}\text{E}|-\text{Q}}{\text{E}|-\text{i}\text{f}\text{Μ}=\text{Ν}\text{t}\text{h}\text{e}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}}\text{C}\text{o}\text{n}\text{d}$

$\frac{\text{E}|-\text{L}:\text{Τ}{}_1,\text{E}|-\text{k}:\text{Τ}{}_2,\forall \text{Τ}\in \text{Ο}{}_{\text{s}\text{d}\text{e}\text{c}}(\text{Τ}{}_1,\text{Τ}{}_2),\text{E},\text{x}:\text{Τ}|-\text{Ρ},\text{E}|-\text{Q}}{\text{E}|-\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{L}\text{o}\text{f}\{\text{x}\}{}_{\text{k}}\text{i}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}}\text{S}\text{d}\text{e}\text{c}$

$\frac{\text{E}|-\text{L}:\text{Τ}{}_1,\text{E}|-\text{k}{}^{-}:\text{Τ}{}_2,\forall \text{Τ}\in \text{Ο}{}_{\text{p}\text{d}\text{e}\text{c}}(\text{Τ}{}_1,\text{Τ}{}_2),\text{E},\text{x}:\text{Τ}|-\text{Ρ}\text{E}|-\text{Q}}{\text{E}|-\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{L}\text{o}\text{f}\{[\text{x}]\}{}_{\text{k}{}^{+}}\text{i}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}}\text{Ρ}\text{d}\text{e}\text{c}$

$\frac{\text{E}|-\text{L}:\text{Τ}{}_1,\text{E}|-\text{k}{}^{+}:\text{Τ}{}_2,\forall \text{Τ}\in \text{Ο}{}_{\text{c}\text{h}\text{e}\text{c}\text{k}\text{s}\text{i}\text{g}\text{n}}(\text{Τ}{}_1,\text{Τ}{}_2),\text{E},\text{x}:\text{Τ}|-\text{Ρ}\text{E}|-\text{Q}}{\text{E}|-\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{L}\text{o}\text{f}[\{\text{x}\}]{}_{\text{k}{}^{-}}\text{i}\text{n}\text{Ρ}\text{e}\text{l}\text{s}\text{e}\text{Q}}\text{C}\text{h}\text{e}\text{c}\text{k}\text{S}\text{i}\text{g}\text{n}$

3 基于扩展Spi演算类型系统的安全属性

构建一个基于扩展Spi演算的类型系统的目的在于, 利用类型系统的特点分析密码协议的安全属性。本文主要是利用该类型系统证明协议的秘密性, 即如果一个描述完整协议的进程在该类型系统中是类型完善的, 那么该进程不会泄露任何秘密级别的数据。

在给出关于密码协议秘密性的定理之前首先需要证明几个引理:

引理1 如果存在E, E′|-M:T, E, x:T, E′|-M′:T′, 那么E, E′|-M′{M/x}:T。如果存在E, E′|-M:T, E, x:T, E′|-P, 那么E, E′|-P{M/x}。

证明 由函数Of (T1, …, Tn) 和Og (T1, …, Tn) 的定义。如果在环境E, E′中存在一个T类型的项, 那么使用该项替代具有相同类型的变量后对函数Of (T1, …, Tn) 和Og (T1, …, Tn) 的参数没有影响, 因此Of (T1, …, Tn) 和Og (T1, …, Tn) 返回值不变。所以, 对项M′而言, 替代后的项M′{M/x}仍保持与项M′有相同类型;对进程P而言, 如果P在环境中是类型完善的, 那么进程P{M/x}也是类型完善的。

引理1第一句话的含义是如果项M′中含有变量x, 在x具有确定类型的情况下, 使用环境中具有相同类型的项M代替x, 项M′{M/x}的类型不变。第二句话的含义是假设进程P在一个环境中是类型完善的, 那么如果P含有变量x, 在x具有确定类型的情况下, 使用环境中具有相同类型的项M代替x后所得进程P{M/x}在该环境中仍是类型完善的。

引理2 如果E|-P, P≡Q, 那么E|-Q。

证明 从P≡Q情况的归纳可证明该结论。

例如对结构一致性关系:

(υa1) (υa2) P≡ (υa2) (υa1) P a1≠a2

若E|- (υa1) (υa2) P, 由 (Restriction) 规则可知存在E, a1:T1, a2:T2|-P。

定义E′@E, a1:T1, a2:T2, E″@E, a2:T2, a1:T1。

显然E′与E″是一样的, 所以E|- (υa2) (υa1) P。

结论成立。

同样, 对所有结构一致性情况都可证明该定理是正确的, 引理2成立。

引理3 如果E|-P, P f Q, 那么E|-Q。

证明 该引理的证明需要对P f Q出现的情况进行归纳。

下面举出几种较复杂的情况, 证明如下:

· Red I/O情况下, $\overline{\text{a}}\langle \text{Μ}\rangle .\text{Q}|\text{a}(\text{x}).\text{Ρ}\text{f}\text{Q}|\text{Ρ}\{\text{Μ}/\text{x}\}$。

假设$\text{E}|-\overline{\text{a}}\langle \text{Μ}\rangle .\text{Q}|\text{a}(\text{x}).\text{Ρ}$, 由Parallel规则可知, 存在$\text{E}|-\overline{\text{a}}\langle \text{Μ}\rangle .\text{Q}$和E|-a (x) .P。由E|-a (x) .P和input规则可得:存在E|-a:T, ∀T′∈conveys (T) , E, x:T′|-P。由$\text{E}|-\overline{\text{a}}\langle \text{Μ}\rangle .\text{Q}$和output规则可得:存在E|-a:T, E|-M:T′, T′∈conveys (T) , E|-Q。由引理1可得, E|-P{M/x}。由Parallel规则可知E|-Q|P{M/x}。

· 对Red Cond1, if M=M then P else Q f P。

· 假设E|-if M=M then P else Q, 由cond规则, 存在 E|-M:T, E|-if T=T then P 和E|-Q, 因此满足E|-P。

· 对Red Sdec1, case {M}k of {x}k in P else Q f P{M/x}。

设E|-case {M}k of {x}k then P else Q, 由Sdec规则可知:E|-{M}k:T1, E|-k:T2。由解密函数的属性可知, ∃T∈Og (T1, T2) , 满足E|-x:T。

由函数Sdec () 的定义Sdec (N1, N2) =N可得, 存在替代σ满足{M}k=σN1, k=σ (N2) , M=σ (N) 。记N1和N2中所有变量为Xj, 则σxj为项{M}k和项k的子项, 设σxj的类型为Txj, 即E|-σxj:Txj。假设E′为所有Xj到类型Txj的环境, 则存在E′|-N1:T1和E′|-N2:T2。因为sdec (N1, N2) =N, 由解密函数的属性可知, ∃T∈Og (T1, T2) , 满足E′|-N:T。得E|-M:T。由于E, x:T|-P, 由引理1可得:E|-P{M/x}。结论成立。

Red Checksign1与Red Pdec1情况类似, 此处不再详细叙述。

通过上述分析可知, 引理3结论成立。

引理3说明如果一个进程是类型完善的, 那么该进程简化后的进程也是类型完善的。

引理4 对进程P, 如果fn (P) ⊆{a1, ..., an}, fv (P) ⊆{x1, ..., xm}, Ti≤Public, i∈{1...m}, Ti≤Public, i∈{1...m}, 则a1:Public, ..., an:Public, x1:T1, ..., xm:Tm|-P。

证明 首先证明对项M的情况, 即假设fn (M) ⊆{a1, ..., an}, fv (M) ⊆{x1, ..., xm}, Ti≤Public, i∈{1...m}, 那么a1:Public, ..., an:Public, x1:T1, ..., xm:Tm|-M:T。M的形式有以下几种:

· 若M为名和变量, 由atom规则, 结论显然成立。

· 若M={x}y, 则x:public, y:public。由加密函数属性可知x:public, y:public|-{x}y:T, T∈TPublic。

· 公钥加密, 数字签名, 以及哈希函数的证明类似于{x}y。

假设存在进程P, fn (P) ⊆{a1, ..., an}, fv (P) ⊆{x1, ..., xm}, i∈{1...m}, 满足:

E@a1:Public, ..., an:Public, x1:T1, ..., xm:Tm, E|-P

对所有可能进程形式的进行归纳:

· 空进程0是满足该条件的, 因为由Env Ø规则可知空环境是形式完善的。

· 对输出进程$\overline{\text{Μ}}\langle \text{Ν}\rangle .\text{Ρ}‚\text{Μ}$和N的类型为Public

由Output规则可得:

E, M:Public, N:Public$|-\overline{\text{Μ}}\langle \text{Ν}\rangle .\text{Ρ}$

因此进程$\overline{\text{Μ}}\langle \text{Ν}\rangle .\text{Ρ}$满足:

a1:Public, ..., an:Public, x1:T1, ..., xm:Tm, M:Public,

N:Public$|-\overline{\text{Μ}}\langle \text{Ν}\rangle .\text{Ρ}$

· 对输入进程M (x) .P, M的类型为Public, 变量x的类型为Tx, Tx≤Public。

由Input规则可得:E, M:Public, x:$\text{Τ}{}_{\text{Ρ}\text{u}\text{b}\text{l}\text{i}\text{c}}|-\overline{\text{Μ}}\langle \text{Ν}\rangle$

因此进程M (x) .P满足:

a1:Public, ..., an:Public, x1:T1, ..., xm:Tm, M:Public, x:TPublic|-M (x) .P

对其它进程结构的归纳同上, 证明情况类似, 本文不再详述, 因此引理4结论成立。

引理4说明对所有进程, 如果进程中出现的所有自由名和变量的类型为Public, 那么该进程是类型完善的, 也就是说所有描述攻击者的进程都是类型完善的。

在上面四个引理的基础上, 下面给出基于扩展Spi演算类型系统关于秘密性的定理。

定理 (秘密性) 闭进程P, 假设E|-P, E|-s:Secret, S={a|E|-a:T, T∈TPublic}, 那么进程P从S中保持了s的秘密性。

证明 反证法, 假设P没有保持s的秘密性,

由秘密性的定义可知, 一定存在进程Q使得P|Q在信道c上输出了s, c∈S。

假设Q=Q′{a′1/x1, ..., a′m/xm}, 其中fn (Q′) ={a1, ..., an}, fn (Q′) ⊆S, fv (Q′) ⊆{x1, ..., xm}, a′i∈S, i∈{1, ..., m}。

由进程输出的形式化定义可得, $\text{Ρ}|\text{Q}\text{f}{}^{*}\text{R}‚\text{R}\equiv \overline{\text{c}}\langle \text{s}\rangle |{\text{R}}^{\prime }$。

因为fn (Q′) ⊆S, 由S和TPublic的定义可知, E|-aj:Public, j∈{1, ..., n}。

同理, 设E|-a′i:T′i, i∈{1, ..., m}, 满足T′i≤Public。

由引理4可得, a1:Public, ..., an:Public, x1:T′1, ..., xm:T′m|-Q′。

由引理1可得, E|-Q′{a′1/x1, ..., a′l/xl}, 即E|-Q。

因为E|-P和E|-Q, 由parallel规则可得E|-P|Q。

因为P|Qf*R, 由引理3可知, $\text{E}|-\text{R}‚\text{E}|-\overline{\text{c}}\langle \text{s}\rangle |{\text{R}}^{\prime }$。

因为c∈S, 且$\text{E}|-\overline{\text{c}}\langle \text{s}\rangle$, 由Output规则可得E|-s:T, 且T∈TPublic, 与条件矛盾。

因此假设不成立, P从S中保持了s的秘密性。

定理成立。

定理表明了该基于扩展Spi演算的类型系统, 如果在一个环境E中闭进程P是类型完善的, 名s的类型不属于TPublic, S为具有TPublic中类型的所有名的集合, 那么在环境E中进程P保持s的类型。也就是说, 闭进程P保持了所有类型不属于TPublic的名的秘密性。定理是基于扩展Spi演算的类型系统对密码协议秘密性进行分析的基础。

集合S形式化的描述了攻击者的知识。本文中所有关于进程P保持了s的秘密性的结论, 均是指在一个确定S的条件下P保持了s的秘密性。

4 类型系统实例对安全属性的验证

下面通过一个具体密码协议的实例, 利用基于扩展Spi演算类型系统的类型规则, 结合扩展Spi演算对该协议的形式化描述来介绍类型系统对密码协议秘密性的分析方法。

该协议包含如下三条消息:

消息 1:A→B:{k, k${}_{\text{A}}^{+}$}k+B

消息 2:B→A:{k, kAB}k+A

消息 3:A→B:{s}KAB

该协议的主要目的是在用户A、B之间建立会话密钥KAB, 并使用该密钥传递秘密的消息s。

由于本文中类型系统主要是针对密码协议的秘密性进行分析, 因此在使用扩展Spi演算对该协议的描述中没有加入begin和end事件。协议的具体描述如下:

$\text{A}=(\text{υ}\text{k})\overline{\text{e}}\langle \{[\text{k},\text{k}{}_{\text{A}}^{+}]\}{}_{\text{k}{}_{\text{B}}^{+}}\rangle .\text{e}(\text{z}).\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{z}\text{o}\text{f}\{[\text{x},\text{y}]\}{}_{\text{k}{}_{\text{A}}^{+}}\text{i}\text{n}$

ifx=kthene〈{s}y〉

$\text{B}=\text{e}(\text{z}).\text{c}\text{a}\text{s}\text{e}\text{z}\text{o}\text{f}(\{[\text{x},\text{y}]\}{}_{\text{k}{}_{\text{B}}^{+}})\text{i}\text{n}(\text{υ}\text{k}{}_{\text{A}\text{B}})\overline{\text{e}}\langle \{[\text{x},\text{k}{}_{\text{A}\text{B}}]\}{}_{\text{y}}\rangle .$

e (z′) .case z′ of {u}kAB in 0

$\text{Ρ}=(\text{υ}\text{k}{}_{\text{A}}^{-})(\text{υ}\text{k}{}_{\text{B}}^{-})\overline{\text{e}}\langle \text{k}{}_{\text{A}}^{+}\rangle .\overline{\text{e}}\langle \text{k}{}_{\text{B}}^{+}\rangle .(\text{A}|\text{B})$

使用基于扩展Spi演算的类型系统可对上述协议的秘密性证明如下:

首先, 定义环境E为:E@s:Secret, e:Public。

由于KAB是用于加密Secret级别的对称密钥, 因此其类型为KSecret[Secret]。

同样由用户A和B的公钥k+A和k+B加密内容的类型可知其类型为:

TK+A@EKPublic[Secret×KSecret[Secret]]

TK+B@EKPublic[Secret×EKPublic[Secret×KSecret[Secret]]]由类型操作 (14) 可得其对应私钥的类型分别为:

TK-A@DKPublic[Secret×KSecret[Secret]]

TK-B@DKPublic[Secret×EKPublic[Secret×KSecret[Secret]]]在E的基础上, 引入环境E′的定义如下:

E′@E, sKA:DKPublic[Secret×KSecret[Secret]]

sKB:DKPublic[Secret×EKPublic[Secret×KSecret[Secret]]]

pKA:EKPublic[Secret×KSecret[Secret]]

pKB:EKPublic[Secret×EKPublic[Secret×KSecret[Secret]]]

因为TK+A和TK+B为Public类型的子类型, 因此TK+A∈conveys (Public) , TK+B∈conveys (Public) 。

由Restriction规则, 要证明P在环境E中是类型完善的, 需先证明 (A|B) 在环境E′中是类型完善的。

下面证明E′|-A:

由Penc规则可得:

E′, k:Secret|-{k, k${}_{\text{A}}^{+}$}k+B:Public

因此, 由output规则可知:$\overline{\text{e}}\langle \{\text{k},\text{k}{}_{\text{A}}^{+}\}{}_{\text{k}{}_{\text{B}}^{+}}\rangle$是类型完善的。

对输入进程e (z) , z可以是Public类型的任意子类型, 因此需要先证明case z of$\{\text{x},\text{y}\}\text{k}{}_{\text{A}}^{+}\text{t}\text{h}\text{e}\text{n}\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$在一个环境中是类型完善的。

即需要证明:

E′, k:Secret, x:Tx, y:Ty|-if x=k then$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$

而Tx和Ty存在如下两种可能:

Tx≤Secret, Ty≤KSecret[Secret]或Tx≤Public, Ty≤Public

对第一种情况, 因为x和k的类型都是Secret, 且$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$是类型完善的, 因此cond规则的条件满足, 即E′, k:Secret, x:Secret, y:Secret|-if x=k then$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$; 对第二种情况, 因为x和k不是相同类型, 所以if x=k then$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle \text{f}0$, 而空进程0是类型完善的, 因此E′, k:Secret, x:Tx, y:Ty|-if x=k then$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$也是成立的。

所以E′, k:Secret, x:Tx, y:Ty|-if x=k then$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$是成立的。

由Pdec规则, E′|-case z of {[x, y]}k+A in if x=k then$\overline{\text{e}}\langle \{\text{s}\}{}_{\text{y}}\rangle$。

由上分析可知, 进程A在环境E′中是类型完善的。

同样可证进程B在环境E′中也是类型完善的。

由Parallel规则, 进程 (A|B) 在E′中是类型完善的。

因此由Restriction规则可知, 进程P在环境E中是类型完善的。

由定理1可知, 进程P在环境{e}中保持了s的秘密性。

5 总 结

本文通过对Spi演算语法和语义进行扩充和改进, 获得了扩展Spi演算语法。并利用该扩展Spi演算构造了一种类型系统, 定义了该类型系统中的基本类型, 类型规则以及类型操作。通过该类型系统, 研究了类型检测对密码协议保密性的分析方法, 并以一个典型的三步协议为例, 利用该类型系统证明了其保密性。该类型系统也可以用于对一些较复杂安全协议的保密性验证。

摘要：探讨使用一组形式化的规则来验证密码协议安全属性的方法。这些规则基于传统的等级和信息流的思想, 通过将其扩展后用来处理密码协议中的并发进程。通过这些规则可以向用户提供一种检测方法, 该方法用于判断:如果协议通过了检测, 则可以认为该协议没有泄漏任何秘密的消息。

关键词：信息安全,密码协议,安全属性,秘密性

参考文献

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8.方法学验证指南 篇八

【关键词】 微生物检查；方法验证；影响因素

所谓的药品是能够对人类疾病起到预防、诊断以及治疗功能的物质，其能够对人类的生理功能进行调节，以使人类恢复正常的生理机能，但是药品都具有一定的适应症和相关功能以及用料、用法。药品具有对人类各种疾病的治疗效能，是患者解除病痛和康复的重要保证，因此药品的安全性一直是社会关注的焦点，而作为药品检查中的重要项目微生物检查自然占有不可忽视的地位。微生物对药品造成的污染，主要是指微生物体以及微生物的代谢产物便可能会对患者的机体带来感染、过敏甚至中毒等病症，给患者生命带来威胁。微生物检查是保证药品质量的重要指标，现对微生物检查方法验证以及影响因素分析的内容概括如下：

1 微生物检查方法验证的难题

1.1 微生物的不稳定状态 微生物一种只有在适宜环境条件下才进行生长繁殖等生命活动，而当环境不适宜则会进行一定程度的休眠，因此，不同环境和时间下的检测极可能会显示不同的检查结果^[1]。尤其对一些混于抑菌药品中的微生物，仅在一定程度上受到抑菌药品的抑制而未被杀死，当随药品进入人体后，条件若适宜就可重新生长繁殖，从未对患者造成一定的危害。而有些抑菌药物还会对待检测菌种的检查带来一定的影响，使实验条件下漏检的实例发生，最终进入患者体内，危害患者的生命健康。

1.2 微生物的不确定性 微生物对药品的污染是一种不确定事件，造成污染的程序多种多样，包括制药环境、设备、运输、包装等多个环节，无法预测药品的污染路径和来源，同时由于药品的数量基数大，而多采取抽样式检查，对于微生物污染这个随机变量而言增加了检测难度。

1.3 微生物的不均匀性 微生物作为一种具有簇团性的生物，其所形成的簇团的大小以及紧密程度都是具有较大差异和可遗传性的特征，从而使得对其检查的手段的有效性具有一定的差异性，进而导致不均匀性。

1.4 微生物检查复杂性 微生物检查的方法验证具有较长的时间周期，繁冗的检测程序，大量的干扰因素，使得其检查负责度大幅增加。

2 微生物检查方法验证的方法

2.1 各种菌种计数验证 计数验证是方法微生物检查方法验证的准确性考察的重要指标^[2]。要求在验证时，按照各种菌种的标准制备方法以及供试品的制备过程，在检验试验中加入一定数量代表性的阳性菌，并统计检测过程的该菌回收率。这是一个需要对每一种菌种分别进行的定量性试验，一旦出现菌种回收率不符合要求，便预示方法具有一定的不恰当性，需在实验基础上进行改进，并重新验证，直到阳性菌回收率均符合要求。

2.2 控制菌检查方法验证 依据不同的控制菌检查项目确定相应验证菌，例如大肠菌检验的验证菌可选用大肠埃希菌，而对于梭菌的检查则可选用生孢梭菌作为验证菌。验证过程中为保證方法的特异性需设立阴性菌对照组，要求其检查中不得出现阴性对照菌。

3 微生物检查验证方法的影响因素及解决方案

3.1 药品本身的特性 很多药品本身具有一定抑菌以及杀菌作用，对于该类药品的微生物检查结果是否具有参考价值，决定于其检查条件下该药品是否发挥了抑菌作用^[3]。因此检查过程中，必须采取一定的措施以排除药品自身的抑菌效果造成的结果准确性影响。具体的实施方案一般都是按照不同的稀释浓度进行微生物的检查，最终在最低稀释浓度下对微生物进行回收菌测定，在保证结果准确性的前提下，可适当的调整供试品的实验浓度。

3.2 标准菌的保存 微生物检查验证中包含多种菌种，其生存的环境复杂多样，因此为减少试验中的误差，实验中所用的菌种需要是能够具有典型性、稳定性，排除耐药性变异性、菌落变异性以及形态变异性等特征。同时，对于标准菌要根据正规的方法进行保存，且保证应用的菌株传代次数在5代以内。

3.3 培养基的选择 培养基是能够保证检测培养物正常生长的必要基质。因此，培养基的质量很大程度能够影响到菌种生长的状态。多项研究已经证明，避免电炉直火加热、禁止剩余培养基使用是保证培养基中糖类、氨基酸等营养物质不受破坏有效手段。同时，需要严格控制培养基的PH值、温度以及培养皿中培养基的厚度，保证菌落的生长。

3.4 人为因素影响 微生物检查验证过程是一个严格的实验过程，任何的疏忽和人为因素都会对结果造成重大的影响^[4]。因此，验证过程中要求实验操作者具有熟练的操作技术，严谨的实验过程。同时，由于细菌本身具有生长密集，体积小的特点给计数工作带来一定的困难，可适当的选用不同倍数的显微镜进行观察计数，保证准确度。

4 小 结

综上所述，微生物验证过程是保证药品质量的重要过程，但由于其本身受到多种因素的影响，给准确度的保证上带来了阻碍。在整个方法验证过程中需要综合多方因素，严格操作过程，提高操作者的熟练程度，规范外部环境因素，以期获得准确的结果，减少误差。

参考文献

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[3] 陈健梅.微生物检查方法验证及其影响因素分析[J].药品检验，2008，5（12）：66-68.

9.方法学验证指南 篇九

纯粹测试玩的，发现手机还没有验证，就填写手机验证，等了N久没有收到信息，心里邪恶了

看代码，找JS问题，终于被我发现了一处问题，模拟发送验证码，验证抓包，哈哈，竟然验证码可以看到

看图

输入验证码，成功!

很郁闷，手机到现在还没有收到验证码，不晓得是什么问题!

第二个;

貌似没有什么影响，不过忘记密码是需要输入邮箱地址的……

不知道如何利用

进入会员中心，点击更改邮箱，随便输入邮箱地址，更改成功，没有通过原邮箱验证……

10.方法学验证指南 篇十

（CDE网站2006年2月8号发表的电子刊物）

摘要：本文介绍了在对有关物质检查所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

关键词：有关物质检查 分析方法验证 可接收标准

药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。由于这些有关物质的存在会影响到药品的纯度，进而可能会产生毒副作用，所以有关物质的控制是药品研发的一个重要方面，也是我们在药品审评中一直重点关注的要点之一。而要对有关物质进行严格的控制，就离不开专属性强、灵敏度高的分析方法，这就涉及到分析方法的筛选与验证。从现有的申报资料看，药品研发单位已基本上意识到分析方法验证的重要性，但是对验证时各具体指标是否可行尚没有一个明确的可接受标准，从而难以对验证结果进行评判。为解决这一问题，本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

1．准确度

该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。

该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

2．线性

线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：

在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。

3．精密度

1）重复性

配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。

2）中间精密度

配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。

4．专属性

可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。

5．检测限

杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

6．定量限

杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。

7．耐用性

分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。

8、系统适应性

配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。

9．溶液稳定性

按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。

11.方法学验证指南 篇十一

【关键词】益母草颗粒；微生物限度检查；方法验证

【中图分类号】R917 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0168-01

药品微生物限度检查是控制药品微生物污染的重要手段，包括细菌，霉菌及酵母菌计数及控制菌检查，是药品安全性的重要指标之一。随着药品剂型的日益发展和药品标准的不断提高，及时有效地进行药品微生物限度检查是摆在药检工作人员面前的重大课题。药品微生物限度检查方法为《中国药典》1995年版首次收载，并在《中国药典》2005年版增订了方法验证实验，为药品微生物限度检查结果的可靠性提供了保障。

在做微生物限度检查时，经常发现有抑菌作用，那么对有抑菌作用的药物按常规法做微生物限度经常药品，以确认所 采用的方法适合该样品的微生物限度检查。本文结合执行《这个药典》2005年版及《美国药典》28版，《英国药典》2002版有关微生物限度检查法，按照中国药品检验标准操作规范及有关文献，以益母草颗粒为例。益母草颗粒为治疗月经量少，产后腹痛的药物，具有活血调经的功效。药品中含有益母草一味中药材成分，固益母草没有抑菌作用，可采用常规法进行实验研究，最终确定采用常规法进行细菌数，霉菌数及酵母菌数的测定，采用常规法进行控制菌的检查，经对所采用的方法进行验证，符合2005年版《这个药典》二部附录ⅪJ有管微生物限度检查法有关规定，方法可行。

益母草为唇形科植物益母草的干燥全草，又名茺蔚，益母蒿，坤草，月母草，地母草等，原生于山野荒地，田埂，河滩，草地，路旁，溪边等处，全国各地均有分布，部分地区有栽培，是常用的中药材品种。

益母草的化学成分主要有：①生物碱，近几年在生物碱的提取方法方面有了很大的改进，郭孝武等采用不同频率的超声波技术，该法工艺简单，提取率高，有较高的开发价值。王坤等用外循环灌装式提取工艺，提取率高并且节省能源，缩短生产周期，适用工业化生产。葛发欢等常用超临界二氧化碳萃取技术比常规法提高10倍；②二萜，从益母草中分离出34个二萜类成分，其中Labdane型二萜类成分prehispanone是一种血小板活化因子的拮抗剂，能竞争性抑制血小板上的血小板凝聚因子（PDF）受体，从而达到抗凝血目的。近期张娴等又从益母草中分离出2个化合物益母草酮A，β—谷甾醇，其中化合物益母草酮A为一种新的Labdane型化合物；③阿魏酸，罗毅等自益母草中提取分离出阿魏酸，并对其进行色谱鉴定，初步确定益母草种含有阿魏酸。研究者采用薄层色谱法和HPLC法鉴别不同提取溶媒制备的样品，各样品均从益母草中检出阿魏酸以百分之五的碳酸钠超声提取最好；④挥发油，王金辉等和丛悦等近期又从益母草的干燥地上部分的水提取物中经过大孔树脂，硅胶柱色谱，制备色谱和HPLC分离得到2个化合物，首次从该种植物中分离得到2，6-二甲基-2E，7-辛二稀-1，6-二醇和ajugoside。⑤其他，多糖：刘晓河等采用水杨酸法测定还原性单糖的含量和水解后的总糖含量，从而间接测出益母草中的多糖含量，该方法简便，快速，准确，消除了样品中还原性单糖对多糖含量测定的影响。微量元素：任晓伟等从细花益母草中测定到微量元素的存在，并且叶和花中的微量元素多与茎中的微量元素，与调经活血的机制是一致的；其他的还有黄酮，苷类如环烯醚萜苷类，苯丙醇苷类，强心甾苷类等。

益母草的药理活性主要有抗血栓形成，利尿，改善淋巴系统，兴奋子宫，抗诱变作用，减少心肌损害。

1.樣品名称及来源

名称：益母草颗粒

批号：1508014

生产厂家：广西灵峰药业有限公司

处方组成：益母草，蔗糖，糊精

2.试验材料及仪器

仪器：35℃恒温培养箱：303A-6型 北京北德工贸有限公司

33℃恒温培养箱：303A-6型 北京北德工贸有限公司

25℃恒温培养箱：303A-6型 北京北德工贸有限公司

高压蒸汽灭菌器：LDZX-40Ⅱ型 上海申安医疗器械厂

调速多用振荡器：HY-2 国华电器有限公司

电子天平：SL102N 上海民桥精密仪器厂

试验菌株：

大肠埃希菌 Escherichia Coli [CMCC（B）44102]

金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC9（B）26003]

枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis [CMCC（B）63501]

白色念珠菌 Candida albicans [CMCC（F）98001]

黑曲霉菌 Aspergillus niger [CMCC（F）98003]

对菌株的要求：验证试验所用的大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉菌的传代次数均不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻买那个干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学活性。

稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（北京奥博星生物技术有限公司），0.9%无菌氯化钠（本所配制）

培养基（由北京奥博星生物技术有限公司，北京三药科技开发公司提供）

营养琼脂培养基（批号 060412），改良马丁培养基（批号060412），改良马丁琼脂培养基（批号060105），营养肉汤培养基（批号060412），胆盐乳糖培养基（批号060412），胆盐乳糖发酵培养基（批号 060207），玫瑰红钠琼脂培养基（060412）

消毒液：0.1%苯扎溴銨溶液（供洗手，擦试操作台面用），75%乙醇溶液

3.试验部分

3.1菌液制备

接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基，35-37℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含50—100cfu的菌悬液。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23-28℃培养24—48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含50—100cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23-28℃培养5—7天，使大量的孢子产生，加入3—5ml的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热灭菌）过滤，除去菌丝，取此菌原液0.1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含50—100cfu的孢子悬液备用。

3.2菌落计数（每种菌接种两个平皿）

上述大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌三种菌液在试验的同时分别取1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15—20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基，迅速混匀，凝固，35℃倒置培养。取黑曲霉，白色念珠菌菌液各1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15—20ml温度不超过45℃的溶化的改良马丁琼脂培养基，迅速混匀，凝固，25℃倒置培养。

取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，制成1：10的供试液备用。

3.4菌落计数方法验证（常规法）

㈠ 细菌，霉菌及酵母菌检查法验证

当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌，霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌，霉菌及酵母菌数的测定，若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

①试验组：取1：10供试液1ml，分别注入两个无菌平皿，每个平皿加试验菌1ml，立即注入45℃的溶化的相应培养基15—20ml，摇匀，凝固后，将平皿倒置，于规定的温度培养至规定时间，做菌落计数。

②菌液组：取稀释好的各菌液1ml，分别加入无菌平皿中，加入相应培养基，置规定条件培养，测定所加的试验菌数，每株试验菌制备二个平皿。

③供试品对照组：测定供试品本底菌数，方法同试验组（不加菌液）。

④稀释剂对照组：分别取稀释剂1ml，加入含50—100cfuml的试验菌测定其菌数。

回收率的计算公式：

稀释剂对照组的平均菌落数

稀释剂对照组菌回收率=───────────────×100%

菌液组的平均菌落数

试验组的平均菌落数—供试品对照组的平均菌落数

试验组菌回收率=──────────────────────×100%

菌液组的平均菌落数

81㈡控制菌检查法的验证（常规法）

当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查，若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

验证时，依个各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。

①试验组：取1：10供试液1ml，加胆盐乳糖培养基100ml，再加1ml阳性菌（即大肠埃希菌数，霉菌数及酵母菌数验证）摇匀；取胆盐乳糖发酵培养基1支，加1：10供试液1ml，再加1ml大肠埃希菌，摇匀，置30--35℃培养18—48小时。

②阴性对照组：方法同试验组，分别加入1ml阴性菌（即金黄色葡萄球菌，浓度同细菌数，霉菌数及酵母菌计数验证）。

4.结论

①计数法验证：在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%，故可照该供试品制备方法和计数法，测定益母草颗粒的细菌，霉菌及酵母菌数。

②控制菌检查法验证：阴性对照菌未检出阳性对照菌，试验组检出阳性菌，故可照此供试液制备法和控制菌检查法进行益母草颗粒的控制菌检查。

4.讨论

操作环节对回收率有影响，在注入1ml供试液后，随即加入50—100cfu的菌悬液，此时未注入培养基，菌悬液暂时与高浓度供试液混合或不完全混合，若此供试品有较强的抑菌作用，则较高浓度的供试液无疑会对菌悬液中的活菌数带来影响，因此，要尽快注入培养基，并且立即将培养基摇匀，以免菌落数过于集中不便于最后计数。

为减少实验误差，建议在操作过程中应遵循以下原则：为了防止二次污染和微生物繁殖或死亡，实验前应用紫外灯照射样品的外包装，检验时，应从两个以上最小包装单位中抽取供试品；实验室环境应符合2005年版《中国药典》提出的要求，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染；实验用的标准菌株的保存及菌液的制备应符合药典要求。

参考文献

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