细胞核

细胞核（精选8篇）

1.细胞核 篇一

第3节 细胞核——系统的控制中心 教案

《普通高中课程标准实验教科书 生物必修一《分子与细胞》第三章第三节的 [课标要求]：

1、阐明细胞核的结构与功能（Ⅱ）

2、尝试建立真核细胞的模型（Ⅰ）教学目标

1.阐明细胞核的结构和功能。

2.认同细胞核是细胞生命系统的控制中心。3.尝试制作真核细胞的三维结构模型。教学重点

（1）细胞核的结构和功能。

（2）制作真核细胞的三维结构模型。教学难点

理解细胞核是细胞生命系统的控制中心 教学过程：

【导入】同学们：今年最流行的国产动画片是什么? 今天，喜羊羊的家族里来了三个新成员，分别是黑羊羊、白羊羊和灰羊羊，黑羊羊、白羊羊非常受他们的欢迎，而灰羊羊常常被冷落。灰羊羊想改变后代的命运，可正常情况下，灰羊羊只能生灰色的羊”灰羊羊的梦想是生一只漂亮的小白羊，我们怎样才能帮她实现梦想呢？（配合2张幻灯片）

学生若答上：鼓励，然后指出这个方案的关键之处是取白羊羊的“细胞核”，从而引出课题。学生若答不上：我们要帮她实现梦想，必须研究细胞核的有关知识，带着这个问题，我们今天学习第三节 细胞核──系统的控制中心

一、细胞核有什么功能 分析资料探究细胞核的功能

资料一：（美西螈核移植实验）逐步放映实验步骤并提出问题：

问题：移植后长大的美西螈是什么体色？ 理由是什么？由此你认为生物性状的遗传主要由什么控制？据此能不能帮助灰羊羊设计一个方案，实现她生一只漂亮的小白羊的梦想 结论：生物的性状是由细胞核决定的 资料二：（蝾螈受精卵横缢实验）逐步放映实验步骤，边放映边提出问题：

问题：分隔后蝾螈受精卵的两半有什么不同？会出现什么不同的结果？此结果说明什么问题？怎样进一步设计实验证明这个问题？最后根据结果归纳总结该实验的结论。

整个实验最突出的试验设计思想是什么？怎么对照的？围绕什么而对照？（分隔后两部分的对照，自身前后的对照，都是围绕细胞核而对照的）

结论：没有细胞核，细胞就不能分裂 资料三：（变形虫去核及核移植实验）

问题1．若想利用变形虫探究细胞核的功能，你会如何设计实验？（小组讨论，代表回答）指出:生物学家的设计和你们的设计一样，然后边放幻灯片片介绍每一步的不同结果。2：根据实验结果能得出什么结论？3：人成熟的红细胞还能生长分裂吗？为什么？

结论：细胞核是细胞生命活动的控制中心，细胞核与细胞质关系紧密 资料四：（伞藻嫁接与核移植实验）

（1）老师先对照图片简介伞藻的结构。

（2）以图片的形式打出生物学家的操作流程图，让学生观察讨论试验步棸，然后表述实验步骤，并预测实验结果。

问题串1：伞藻嫁接实验：切去帽后长出来的新帽的形状是由柄决定的？还是由假根决定的？该实验能否说明伞帽的形状由细胞核控制？要证明“伞帽的形状由细胞核控制”需再怎样设计实验？

问题2：根据伞藻嫁接实验和伞藻核移植实验结果，得出什么结论？ 结论：生物体形态结构的建成主要与细胞核有关 板书： 细胞核功能---控制细胞代谢和遗传

细胞核为什么能成为细胞代谢和遗传的控制中心，这是由细胞核的结构决定的。引出对细胞结构的学习。

二、为什么具有此功能──细胞核的结构

1、核膜：双层生物膜，把核内物质与细胞质分开。就像细胞膜把细胞与外界环境分隔开一样，但又不是完全分隔开，因为核内要不断地与核外细胞质进行物质交换和信息交流，而核孔则主要是大分子进出的通道。

2、核孔：分布在核膜上，是内外两层生物膜连接在一起形成的（打手势比喻）。联系观察DNA和RNA在细胞中分布实验，及核糖体是合成蛋白质的场所，讲解RNA穿过核孔出来，蛋白质穿过核孔进去。进一步指出，代谢越旺盛的细胞需要交换的物质和信息越多，为适应这一功能，所以核孔的数目就越多。

3、核仁：主要是一部分染色质聚在一起形成的，这部分染色质里的DNA主要控制合成构成核糖体的RNA,所以说它与某种RNA及于核糖体的形成有关。通常蛋白质合成旺盛的细胞核仁较大。

4、染色质，染色体：主要有DNA和蛋白质组成，呈细长丝状，因易被碱性染料染成深色而得名。若细胞要分裂，染色质就螺旋化，缩短变粗，形成棒状或杆状的染色体。染色质：最早是由德国生物学家瓦尔德尔提出来的，主要是指细胞核内容易被碱性染料染成深色的物质，因此叫做染色质

三、谁在承担这个功能---DNA DNA：是遗传信息的载体，细胞的一切生命活动都是由DNA控制的，比如（指某个同学）你长得像你爸妈，是因为你细胞核内的DNA一半来自你爸爸一半来自你妈妈；同样的草，羊吃了长羊肉，牛吃了长牛肉，是因为牛羊细胞内的DNA不同。所以细胞的代谢和遗传都是DNA控制的。而DNA主要分布在细胞核内，因此细胞核又被称为──遗传性息库。所以细胞核才具有控制细胞代谢和遗传的功能

四、细胞是一个有机的统一整体

细胞只有保持完整性，才能正常地完成各种生命活动。（草履虫实验：证明核质关系）

细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生物体代谢和遗传的基本单位。课后作业：

试制作真核细胞的三维结构模型（下节课评选最佳作品。注意：科学性、准确性应放第一位，还应考虑艺术性、成本低廉等等）[教学反思] 补充：高等植物成熟的筛管细胞和哺乳动物成熟的红细胞等没有细胞核

2.细胞核 篇二

关键词：植物,细胞核,分离,纯化

植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组文库构建、DNA纤维制备、细胞核中DNA、RNA、蛋白质含量的分析及染色质结构分析等, 需要分离纯化出较多个体完整, 分散较好的细胞核。学者们曾尝试用不同方法进行植物细胞核的分离, 比如大豆、玉米、水稻、烟草、小麦、棉花、长春花、杉木等细胞核的分离或纯化近来又有过报道[1,2,3,4,5,6,7], 但由于不同植物材料由于结构和组分的不同, 所以适合一种植物的细胞核制备方法并不适合于其它植物。本文就一些分离纯化植物细胞核的方法进行探讨。

对动物细胞核的分离纯化已经有了比较好的方案可查, 然而对植物细胞却不尽然。主要是由于植物细胞在结构与内含物等方面显著不同于动物细胞, 植物细胞除了具有细胞壁外, 还含有胞间连丝和次生代谢物, 这就给细胞核的制备增加了难度。分离纯化细胞核需要在材料选择、预处理、提取液选择、细胞的破碎方法及纯化方法上做综合考虑。

1 材料选择

制备植物细胞核一般可以选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料, 其中选择后者居多。然而, 愈伤组织和悬浮培养细胞有着自身的优越性。愈伤组织和悬浮培养细胞取材方便, 本身就是无菌材料更便于做融合、杂交试验。离体培养的植物细胞更易于进行同步化处理, 且黑暗下培养的细胞基本不含叶绿体, 这些都便于核的纯化。

2 预处理

处于不同细胞周期的细胞核的大小是不同的, 体积可相差几倍之多, 为了便于纯化、提高收率, 可先将用于制备细胞核的植物材料进行同步化处理。通常可采用低温 (用冰水混合物) 培养12h-48h的物理方法;也可采用使用羟基脲、8-羟基喹啉 (0.001M-0.004M) 或秋水仙素 (0.01%-0.5%) 的化学方法, 处理时间在4h-24h。对于离体培养材料, 还可以尽量缩短继代的周期使得细胞经常处于对数增殖期的办法使细胞核尽可能均匀一致。对于悬浮培养细胞还应在破碎细胞之前去除漂浮的已自溶的细胞碎片等杂质。

3 细胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物细胞核, 在研磨过程中酚类等物质易氧化, 不可避免的对提取细胞核产生影响, 细胞核提取质量不高。研磨时间长短和力度大小难以掌握, 致使很多细胞核被破坏, 产率较低。刀切法, 一种是用剪刀将叶片快速剪碎, 另一种是用锋利刀片在放置于冰上的培养皿中于将叶片切碎至尽量细小的匀浆状。刀切法的操作手法也不容易保持一致, 不适用于愈伤组织、悬浮细胞和根茎尖等材料。酸解法一般采用1M-3M盐酸解离细胞。酸解法效果不稳定。酶解法是利用纤维素酶、果胶酶和/或半纤维素酶等处理细胞。酶浓度在0.5%-2%, 纤维素酶浓度高于果胶酶, 半纤维素酶有助于纯化过程, 不添加也可。使用蜗牛酶没有看到更好的结果。酶解时间为4h-24h。酶解法可以先得到原生质体, 再通过挤压低渗涨破质膜或添加表面活性剂溶膜而释放细胞核, 也可以不收集原生质体, 一步实现收获细胞核, 而且不必使用表面活性剂, 这时需要延长酶解时间 (12h左右) 并使材料处于震荡当中。利用酶解法制备植物细胞核收获量较大, 当然收获量的大小还与所用的提取液 (酶解液) 的其它成分密切相关。

4 提取液

可以使用缓冲盐或非缓冲盐。缓冲盐常被选用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和柠檬酸等, 浓度在0.015-0.2M, p H7.0-8.0居多, 也有使用p H2.0-3.0的。提取液中可选择添加的成分比较多, 比如Mg2+、K+、Na+、精胺、Triton X-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巯基乙醇、DTT、PMSF、抗坏血酸等。这些成份能够稳定核染色质 (体) 、提供一定的离子强度、维持渗透压、促进细胞核释放, 移走细胞质, 分散叶绿体, 减少核粘连、防止细胞核被氧化、减轻酚类等次生物质的干扰, 提高细胞核质量。这些成份用量在0.1m M-0.6M, 其中糖类物质用量大。

5 分离纯化方法

过滤、差速离心和密度梯度离心是最常用的方法。细胞破碎以后通常需要过滤。过滤常利用不锈钢、尼龙网 (120目-400目) 和过滤棉等。差速离心需多次反复沉淀和再悬浮, 容易使核破裂。沉淀核的离心速度很低即可, 如果离心时间过长和速度过高, 虽然会提高核的产量, 但也会增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。浓度高的蔗糖溶液是非常粘的, 而且这种溶液的粘度受蔗糖含量的增加影响大, 浓度高的蔗糖溶液浓度的小的改变对核的沉淀速度会产生很大的影响, 所以用蔗糖作梯度离心纯化细胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度没有蔗糖高, 但同密度情况下, 甘露醇溶液的渗透压要高于蔗糖溶液的, 这也是需要注意的, 以免核皱缩。Percoll是较好的介质, 只是价格偏高。低速离心 (500×g左右) , 细胞核集中30%、35%的蔗糖界面较多。

6 存在主要问题及解决措施

植物细胞核提取遇到的主要问题有杂质多、核与内质网等粘连成网、容易破裂。杂质主要来自细胞壁、膜碎片和细胞质成分。过滤可以去除一些杂质, 但严重降低核的收率, 一方面网筛的大小不好选择, 另一方面导致细胞核破裂, 特别是使用抽滤。图1告诉我们植物细胞核膜连着一些网状的细胞成分, 筛孔小了, 它过不去, 筛孔大了, 大的杂质就会多。如果将通过化学的方法将与膜连接的成分尽量去除, 发现核又非常容易破损, 即使是盖玻片轻轻的一压 (见图2) 。因此, 对于与核膜连接的成分, 既要去除, 又要不能伤及核膜。减轻核与其它细胞成分粘连方法, 可以考虑使用偏酸性的提取液、酶, 不建议使用表面活性剂。低速离心甚至静止片刻 (相当于1×g的离心) 是较好的初步去除杂质的方法, 精细去除杂质则需要进行梯度离心了。对于核容易破裂的问题, 可以考虑使用一些膜的保护试剂, 特别是在纯化的后期, 比如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖、蔗聚糖、2- (N-吗啉) -乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾等, 同时注意提取纯化过程中溶液酸碱度的稳定, 离心时尽量不使细胞核沉到离心管底部, 而用蔗糖等溶液托住更好。

总之, 植物细胞核的提取纯化目前还没有普遍适用的方法, 探索适用不同植物、不同材料的核提取纯化方法还是需要研究的工作。

A被盖玻片压破的细胞核 (箭头指处, 棒状影像是由盖玻片造成的) , B是未加盖玻片观察到的细胞核

参考文献

[1]刘育乐, 米景九, King.J.大豆细胞核的分离及其超显微结构的研究[J].遗传学报, 15 (1) :21-24, 1988.

[2]金亮, 张宪银, 薛庆中.分离缓冲液对水稻细胞核悬液DNA分辨率效应的比较[J].浙江农业学报, 19 (2) :93-96, 2007.

[3]费一楠, 张钊, 张飞雄.烟草悬浮细胞细胞核及核骨架中存在有肌动蛋白和肌球蛋白的证据[J].首都师范大学学报 (自然科学版) , 29 (1) :55-63, 2008.

[4]彭仁海, 刘方, 宋国立, 王春英, 黎绍惠, 张香娣, 王玉红, 王坤波.一种高效提取棉花细胞核的技术[J].安徽农业科学, 37 (18) :8755-8756, 2009.

[5]宁华.植物细胞核不同制备方法的比较研究[J].华中师范大学学报 (自然科学版) , 43 (2) :308-312, 2009.

[6]孙永星, 李素花, 魏小丽, 韩榕.适合流式细胞仪分析的小麦细胞核提取方法比较[J].生物学杂志, 29 (3) :88-91, 2012.

3.细胞核考点扫描与例析 篇三

B.造血干细胞C.效应B细胞（浆细胞）

D.口腔上皮细胞解析选D.细胞的代谢越旺盛，则核孔的数目越多.A、C中的细胞分别分泌胰岛素（或胰高血糖素）和抗体，代谢旺盛.B中细胞的分裂能力很强，代谢旺盛.只有D为高度分化的细胞，代谢较弱.故而D中的口腔上皮细胞的核孔数目最少. 例3（2014安徽联考）如图2为某种生物的细胞核及相关结构示意图，有关叙述正确的是（

）.图2A.核孔是大分子物质进出细胞核的通道，不具有选择性B.图示中有中心体，说明该生物为低等植物或动物 C.在衰老的细胞中，细胞核体积减小，染色质浓缩 D.rRNA（核糖体RNA）和蛋白质在核仁中合成并组装成核糖体解析选B.核孔也具有选择透过性，不允许核内DNA外出；中心体存在低等植物细胞或动物细胞中；在衰老的细胞中，由于代谢缓慢，细胞核代偿性增大，染色质浓缩；蛋白质合成的场所是核糖体.例4（2014南通调研改编）下列关于细胞核的叙述正确的是（

4.细胞核说课稿 篇四

各位评委老师：

大家好，今天我说课的题目是《细胞核——系统的控制中心》，我将从“教材，教法学法，过程，板书设计，教学评价”这几个方面来谈谈我对这节课的理解与设计。

一、说教材

本小节主要讲述细胞核的结构、细胞核的主要功能、原核细胞的基本结构三点内容。第一点，关于细胞核的结构，简要介绍核膜、核仁和染色体的知识。第二点，关于细胞核的主要功能，强调细胞核是遗传物质储存和复制的场所，是细胞遗传特性和代谢活动的控制中心。第三点，关于原核细胞的基本结构，简要的介绍原核细胞在大小、细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核这几个方面与真核细胞不同的特点。本节课程学习的知识为今后学习细胞增殖、细胞分裂、细胞全能性、生物遗传等章节相关知识作了奠定基础。

二、说学情

1.重点分析

(1)真核细胞的结构和功能。

(2)染色体、DNA的关系。

2.难点分析

(1)领悟细胞核是遗传信息库，细胞代谢和遗传的控制中心。

(2)染色体、DNA的关系。染色质与染色体的相互转变的动态过程。

3.学生分析

学生在初中曾学习过“细胞的基本结构”，但是较肤浅；前边刚刚学习过细胞膜和细胞器，对细胞的详细结构和整体结构有了较深入的认识。

三、说目标

1.知识目标：

(1)掌握真核细胞细胞核的结构和主要功能。

(2)掌握原核细胞基本结构和与真核细胞在结构上的区别。

2.能力目标：

(1)培养学生识别生物图的能力和对比、归纳的能力。

3.情感目标：

(1)培养学生树立生物体结构和功能相适应。

(2)局部和整体相统一的观点。

4.课标要求

基本要求:

（1）通过学生小组共同分析讨论 “资料分析”中的4个实验。

（2）总结出细胞核的功能。

（3）掌握细胞核的结构。

（4）理解掌握染色体、染色质的关系。

发展要求：

（1）分析课本资料,培养学生的分析能力；

（2）建构细胞模型,图文结合,培养学生识图、画图能力,形象思维能力；

（3）树立结构与功能相适应的观点；

（4）培养学生树立唯物主义的世界观。善待自己，善待生命。

四、教学资源

Flash动画，多媒体

五、教学方法

用启发式的教学方法为主，在过程中学生分组讨论为辅相结合。

六、教学过程

1.教学设计思路：

由于本节内容比较抽象，学生的感性认识较少。在教学过程中按照学生为主体，教师为主导的教学原则。通过趣味性问题作为本次课的导入。通过学生小组合作讨论，自学分析得出细胞核的功能。然后通过展示细胞亚显微结构图，来讲解细胞核的结构。在讲到染色质与染色体的动态互变过程时，通过flash给出其互变的.动态图，化抽象为具体，帮助学生易于理解这一过程。结构与功能是相适应的，并引用变形虫的去核试验和精子的结构，强调细胞核的功能，突出重点。在讲解原核生物的基本结构后，让学生分组并用表格的形式归纳总结真核与原核生物的区别，有利学生对本章知识形成结构化。

2.教学过程

（一）情境导入（5分钟）

1.“龙生龙，凤生凤，老鼠生儿会打洞”

2.克隆羊多莉长得像谁？

（二）活动探究（25分钟）

活动探究一：

分析教材52页四个试验资料，思考下列问题：

1.美蝾螈的肤色是由细胞核还是细胞质控制的？结合多利羊的产生过程，你认为生物性状的遗传主要是细胞核还是细胞质控制？为什么？

2.细胞核与细胞分裂、分化有什么关系？

3.细胞的生命活动由什么控制的?

4.生物体形态建成与什么有关系？

活动探究二：

通过Flash动画，展示细胞核对细胞生命活动的控制，再提出问题并引导学生思考并认真观察教材插图（课件）并阅读相关内容，主动获取知识。

活动探究三：

1.通过Flash动画展示染色体、染色质的行为变化。

2.指导学生制作简单染色体模型

3.通过提问的形式概述出染色体和染色质的关系

活动探究四：

1.回忆原核细胞和哺乳动物成熟的红细胞的结构，并比较原核细胞与真核细胞结构的异同。

2.对比人的红细胞和精子的结构与功能，进一步体会细胞结构与功能的关系。

（三）当堂达标（10分钟）

题目略

设计意图：由基础题到提升题、变式题，加深对知识的掌握。

（四）课堂小结（5分钟）

概念图的形式

设计意图:有利于学生养成及时总结的良好习惯，并将所学知识纳入已有的认知结构，同时也培养了学生数学交流和表达的能力。

七、板书设计：略

八、教学评价

1.创设情境，导入新课。 联系学生所熟知的实例，激发学生的学习热情。

2.通过探究学习、合作学习自主、探究、合作学习来主动发现结论，提高了积极的学习热情。需要加强引导。

3.本节有些内容抽象，难懂，多媒体的应用，大大提高了课堂的教学效率；细胞模型的制作，让学生能够参与其中，取得较好课堂效果。

4.多种师生互动模式：限时抢答；教师提问，学生回答；学生自学，习题反馈；学生观察描述；教师讲述；动画回顾等，变式题的讨论，促进学生积极思考，巩固加深的对概念理解，能力得到提升。

5.当堂达标对教学进行评价，及时反馈和矫正。

5.细胞核 篇五

真核细胞呢，它里面都有细胞核，因为这是真核与原核的一个区别。因此在真核细胞中找到没有核的细胞，这种情况是格外引人注目的。比如说我们哺乳动物成熟的红细胞。这是一种高度特化的细胞，它就丧失了细胞核。因为它要完成的使命就一个就是要结合携带氧气。而能够结合氧气的物质就是血红蛋白。于是为了给血红蛋白腾地，它连核也省掉了。——先说一段现象

整个红细胞中充满了血红蛋白，这是一种高度特化高度专业化的一个结构。——后给出评价

植物体内也有类似的现象。——最后引出同类的事物。

比如说，植物成熟的筛管分子。这个结构是负责运输有机物的。居然也发生了高度的特化，也把核省掉了。

当然多数的真核细胞都是有核的，那么细胞核何德何能能够担当领导的重任呢？——先把例外的说外，接着进入主题。

这节课就为大家介绍细胞核的结构和功能？

首先给大家一个简单的图，让大家感受一下。细胞核呢。通常位于细胞的中央。当然成熟的植物细胞中，间含有中央大液泡细胞就另当别论了。因为它会被推倒一边去。——说结构一定先要说整体的位置。

我们看到这个核大概有这几部分所组成。最外边呢？是有这个膜组成的，我们把它叫做核膜。然后内部充满液体，我们可以把它叫做核基质。此外，在内部悬浮着一种丝状结构。我们把它叫做染色质。最后，还有一个物质密度非常高的部位我们把它叫做核仁。这是一个大概得印象。为了详细给大家说明。我们将细胞核的结构加以拆分。——先整体概说，后挨个细说。

请看，看从外往里来说。最外侧核膜成了我们能够看出细胞核存在的一个边界。我们经常说原核细胞真核细胞的区别是什么啊？你要是简单地回答一个有核一个没核，这个没有意思。为什么有核，为什么你能看出有核，是因为它外面有核膜的包被。对不对？——从核膜联想到了在、原核细胞和真核细胞的区别。

仔细看这个核膜不是一层膜而是两层膜。这一点和线粒体、叶绿体很像。对不对？——有两层膜联想到了，具有两层膜的细胞器。

那么这两层膜呢，分别叫做内膜和外膜，它们不是都那么平坦。在某些位置外膜和内膜发生了融合。形成了一个一个的孔。——有核膜说到核孔，合情合理。

所以我们在核膜表面可以看到很多空隙。我们就把这些孔叫做核孔。那么核孔它的意义是什么呢？——有现象或者说是结构谈到了意义。一半谈意义的时候，用疑问句。我们说细胞选择性的吸收某些物质，一些小分子物质是可以透过膜的。但是大分子是绝对不能过膜的。如果大分子物质需要进出细胞需要进行内吞和外排，但问题是这个大分子要进出核该怎么办呢？你总不能也内吞外排吧。——运用类比的思想，把核膜与细胞膜进行类比。

因此，核孔的意义就是给这些大分子进出核提供了一个通道。主要的就是大分子。——最后总结核孔的意义。但是给人的感觉感觉不够直观，因此，后面就进行了举例说明。

我们可以举一些例子。比如说核内会发生转录过程，以DNA的一条链转绿形成mRNA,那么mRNA核酸就是一种大分子。它在细胞核中产生但是需要到核外的核糖体上工作。去指导合成蛋白质，所以它是需要出核的走的就是核孔。此外，像在细胞核内合成的核糖体的亚单位，也得通过核孔出去。这些都是大分子。

那说有没有进细胞核呢？也有啊，你想想细胞核里面DNA的复制，需要酶吧。RNA的转录需要酶吧。这些酶都是要同外面合成送入核内。——从进出两方面分别列举了例子。

那么这就有一个问题了，这些物质是通过核孔的时候是自由通过核孔的呢？还是有一定的选择性呢？——利用问题串，来引导所要学的内容。

对于这个问题，当我们有高分辨率的电子显微镜观察时便得到了答案。仔细看，电子显微镜观察核孔时，它绝对不是一个窟窿，事实上在核孔上镶嵌有很多的蛋白质分子。有这些蛋白质贴在核孔上边组成了一个核孔复合体，因此，核孔的全称其实就是核孔复合体。它的意义啊，就是要对进出核的物质啊，进行审查。因此，这些大分子进出核孔不是随意的，而是选择性的运输。

因为细胞核毕竟是一个细胞核的核心啊，相当于紫荆城啊，哪能随意的进出啊，必须得审查。

核膜也是我们生物膜的一个重要组成部分。——从核膜一方面讲了核孔的形成，另一方面也讲了核膜的属性，或者说形成过程。

因为核膜的外膜经常与内质网的膜相延续。这直接导致核膜内膜和外膜之间的核周腔，与内质网的内腔是通着的。甚至在某些时候在核的外膜上我们还能看到一些疙疙瘩瘩的核糖体。这体现了它们二者的联系，事实上从历史上来，不管是内质网还是核膜都是由细胞的质膜下陷下来形成的。并逐渐地构成了我们真核细胞发达的生物膜系统。

在核膜之内充满了大量的液体，这个液体当中溶解了大量的物质。它就是核基质。——由核膜自然过渡到核基质，从物质的结构上过渡的。

核基质就跟我们的细胞质基质是一样的，它也是细胞核中发生各种代谢的场所。——运用类比，引出核基质的作用。

当我们用光学显微镜观察的时候，似乎没有发现什么新奇的东西。好像一片汪洋大海什么都没有。——这就像是在讲故事。如果说：用显微镜观察不到核基质内的物质。而用电子显微镜则可以观察到。这是在叙述事实。

但是当我们用高分辨率电子显微镜观察细胞核内部的时候。就发现在核基质中悬浮着一种丝状物质。由于它能被碱性染料染色，因此我们称之为染色质。也即是说在细胞核内部悬浮着这些丝状结构啊，他们非常的纤细交织成为一个网。只有用高分辨率的电子显微镜才能看到。

当细胞分裂，也就是细胞进入分裂期的时候，我们惊异地发现在同样的位置出现了巨大的棒状结构。

这个巨大的棒状结构，真的非常巨大，用光学显微镜便可清晰看到。——用光学显微镜突出它的巨大。

所以给它取名叫做染色体。那么染色质和染色体到底是什么关系呢？——又是一个问题串

我们用一幅图来说明，染色质和染色体其实是一个东西。它只是同一种物质不同时期的表现形式而已。——先概括说明，后总结分析。

我们看，在间期的时候，染色质呈细丝状散布于细胞核内。所以你用光学显微镜是看不到的。到一旦细胞进入分裂期，这个染色质细丝将会不断地聚集，高度的螺旋化，缩短变粗最后形成了一个巨大的染色体。因此，我们可以这么讲染色体是由染色质细丝浓集而成。也就是浓缩聚集而成。——分析完过程之后，有分析了物质组成

它完全是同一种物质，内部的化学成分。是完全一样的。——先概括后分说

只有两种成分，一种是蛋白质、一种是DNA。当然染色体或者说是染色质当中的蛋白主要是组蛋白。组成的组，没有别的作用就是用来组成染色体的。而DNA分子是另外一种成分，它便缠绕在组蛋白上，最后不断地聚集浓缩形成了染色体结构。

所以我们要深刻理解染色质和染色体根本就是一个东西。——再次说明

而我们发现在染色体当中有细胞重要的遗传物质——DNA。因此，染色体就是DNA的载体，当然也是基因的载体。——最后说出染色体的意义。

好了，同样用电子显微镜观察细胞核的内部，我们会发现经染色，有着色较深的一个球形区域。如果你用的是电子显微镜，这里就是一个电子密度相对比较高的区域。我们把这个区域叫做核仁。

大家一定要注意核仁只是一个物质密度高的区域而已，它绝对没有膜结构。那我们发现凡是蛋白质合成比较旺盛的细胞啊，核仁比较大。甚至可以占到细胞核体积的25%。——先说明现象

这说明核仁这个结构与蛋白质的合成有关，——经过现象推测分析

可那会有什么关系呢？我们知道蛋白质是在核糖体上合成的，关核仁什么事呢？——引发认知冲突

经研究发现，在核仁这个区域内，正集中进行着rRNA的转录，以及核糖体亚单位的装配。——继续说明研究进展。

在这里需要说明一下的是，一个完整的核糖体啊，它通常是由两个亚单位所组成的。比如一个60s大亚基、一个40s小亚基就形成了80s的核糖体。S呢是沉降系数，也就是说一个大亚基，一个小亚基。它们平常是分散的。没活嘛！等有活了，mRNA出来了，当需要翻译的时候，啪嚓，它们就把mRNA夹中间了，于是开始启动翻译，沿着mRNA跑。

那么这个大亚基小亚基又是在哪个地方合成的呢？又是在哪组装的呢？唉，就是在核仁。在核仁这个区域，DNA负责转录rRNA的片段，都聚集在这，马上相应的蛋白质都在了，于是就和相应的蛋白质组装成核糖体的亚基，组装好了亚单位便可以通过核孔出去，等待接活，mRNA一出来，就夹上，就可以翻译了。

所以蛋白质合成的地方需要的核糖体比较多，核仁就必须抓紧时间组成核糖体的亚单位。原来就是这样的一个关系。——解释第一个现象，前后照应。

没想到在细胞核里面核仁的区域居然和外面蛋白质的合成有如此紧密的联系。细胞真的不愧是一个整体。

好了到这我们已经介绍完了细胞核的结构。那么结构一定与功能相适应。那么细胞核到底有什么功能呢？

说完了细胞核的结构，结构一定与功能相适应。那么细胞核有什么功能呢，首先通过实验来介绍。

先介绍一下实验材料，这是一种单细胞的绿藻，名叫伞澡。——讲实验先介绍实验材料。为什么叫这个名字呢，因为在它的顶端拥有一个伞状的结构。——在介绍材料名称的由来。但是大家要注意伞澡浑身上下只有一个细胞。但是一个细胞还成为三个不同的部分。下边是假根，中间叫伞柄，上面就是伞冒啦。这种现象叫做细胞内分化，很神奇诡异。——说明这个实验材料的特性。

我们来看一下，伞澡有两个品种。一个品种的伞冒是伞型的，一个品种的帽是菊花型的。——先让学生对实验材料有一个认识，在说明实验材料的不同点。

那么现在我们就进行一个实验，我们拿来一个伞形帽的伞澡的下方部分给它嫁接上菊花型伞澡的伞柄，然后不久就会在上面长上帽，你猜在上面会长成什么帽呢？结果长成的是伞型的帽，而不是菊花型的。——分组介绍实验。说明实验的过程和结果。

那么看下一组实验，下面试菊花型的，上面嫁接上伞型帽伞澡的伞柄，结果上面张出的帽呢，就是菊花型的帽。

好，通过这个实验你能得出什么结论呢？——通过实验现象得出实验结果。上面长出什么型的帽，取决于哪个部分？是假根部分，因为假根部分有核。而和伞柄无关，3 因为伞柄无核。——利用设问句而不是陈述句，给人的感觉不像是在灌输。

而长什么型的帽，这应该算是生物的一种形状。以核为转移说明，这个形状是由核来决定的。——分析实验结果，得出实验结论。

这件事情我们一定都不意外，因为核中有染色质，染色质上有DNA。而DNA又是遗传物质。——运用所学的生物知识去解释实验结论。

因此，这个实验揭示了细胞核的第一个功能。它是遗传的调控中心。控制着生物的遗传形状。那么细胞核是不是一个细胞进行生命活动所必须的呢？——利用总结实验结论去承上取下，引出下一个问题。

我们来看一个实验，变形虫切割实验。——说明实验名称。

我们用的材料是一种单细胞的原生动物，名叫大变形虫。——说明实验材料名称，性质。将这个大变形虫身体的某一个部分溢断，一部分有核，一部分无核。等上一段时间无核的部分死掉了，有核的部分还可以继续存活。——先总说，后分说。

我们再来做一个实验，拿来大变形虫，提出它的细胞核，当然这个细胞核是活不了啦，因为它自己没法活。

但是这个是剩下的无核部分。它肯定会重蹈覆辙啊，会死掉，对不对？——引起学生共鸣，比直接说：剩下的无核部分也会死掉。就会显得没有和学生进行交流，是“满堂灌”的教学方式。

然而我们将另外一个变形虫抽出核，植入这个无核的部分，这相当于核移植。——及时告知学生应该知道的新名词。

获得了新核的大变形虫继续正常生活。恢复了生命活动。

请大家思考一个问题，细胞核是不是一个细胞生命活动条件呢？——

失去核就将死掉。而有核就将继续生存。由此可见，核控制的不仅仅是形状那么简单。它还控制了整个细胞的代谢活动。——从现象得出结论。也就是说失去了这个领导核心的话，整个细胞的代谢将会陷入混乱。由于代谢紊乱导致细胞的生命活动发生异常，将无法存活下去。——从现象逐步分析得出结论。

由此可见，细胞核的另外一个功能就是代谢的调控中心。一个细胞不可能没有核，没有核的细胞等待它的只有是死亡。像我们前面介绍的红细胞。由于它高度特化失去了核，所以，它的寿命便只剩120天。这就导致我们体内每秒钟都有多达200万的红细胞在死去。怎么办呢？还要制造新的来补充。——有实验现象列举出我们以前学习的实例，来印证这个结论的正确性。

可见核是一个细胞进行生命活动，所必须的生命结构。由此可见细胞核的功能总结一句话，首先他是遗传物质储存的场所，它是细胞进行遗传和代谢的调控中心，对于一个细胞的生命活动至关重要。——对这两个实验得出结论的总结。总之学到这里大家应该能够明白一件事情，细胞能够进行生命活动有赖于它的完整性，无论是它的核还是其他的各种各样的细胞器，都应该是全面存在的。这样一个细胞才能正常生活，希望大家能够深刻理解。——站在整个细胞的角度去理解：细胞能够进行生命活动有赖于它的完整性。

6.细胞核 篇六

Chapter One Nuclear Transplantation of Mammalian cells

cartoonyang（中国生命科学论坛动物科学与动物医学 第1版主）

摘要：本文综述了近年来哺乳动物细胞核移植的相关进展。关键词：哺乳动物 细胞 核移植 进展 Introduction The merge of a sperm and an ovum(fertilization)recovers the diploid cell marking the beginning of the individual development.In the embryonic development, various types of cells are originated from the zygot such as muscle fibers, neurons and hemocytes etc.A question has been asked if the differentiated cells in the development could resume the initiation status or pluripotent stage under proper circumstances which could give rise to other tissues and even the body as a whole.Is the process irreversible? To answer the question, the famous German embryologist Spemman brought out the idea to transplant the nuclei of cells in the anaphase of development to denucleated ova restarting the process in 1938.The aim of the experiment is to testify the totipotency of partially or completely differentiated cells.In 1952, Briggs and King conducted the first nuclear transplantation in tadpoles.1n 1962, the nuclei transplant of gastrula endoblast bred fertile xenopus, which demonstrated the cells post gastrula stage do not undergo irreversible change.All these experiments show the inferior creatures like amphibian possess at least part of differentiated somatic cells could recover their totipotency to develop to adult stage with the effect of oocyte cytoplasma and this has laid the foundation for mammalian nuclear transplantation.引言

一个精子和一个卵子的结合（即受精），恢复二倍体，从而开始了一个个体的发育。在胚胎发育过程中，很多不同类型的细胞都是由受精卵发育开始的。它们有一些专门发育为肌肉细胞，有一些发育为神经细胞，还有发育为血细胞等。从这里就引出了一个问题：在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？为了回答这个问题，早在1938年，德国著名胚胎学家Spemann提出了将发育后期的胚胎核移到无核的卵子中使其重新发育的设想，实验的目的就是为了检验部分分化或完全分化细胞的全能性。他通过头发结扎将蝾螈的受精卵一分为二，有核部分可正常发育和卵裂，并发育到16细胞期，无核部分当移入另一个卵裂球的细胞核时，也能发育成为正常的幼虫，证实了蝾螈未分化的卵裂球具有发育的全能性。1952年，Briggs和King等将已发生了分化的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚，最后发育出了完整的蝌蚪。这是首次进行的细胞核移植尝试获得成功。Gurdon等（1962）利用原肠期内胚层细胞进行核移植，分别产下可育爪蟾。由此证明：自原肠胚以后的细胞仍然没有发生不可逆的改变，可以支持核移植胚发育到成体。这些实验结果证实，两栖类等低等动物至少有部分已分化的体细胞在卵母细胞质的作用下，可以恢复其全能性而重新发育到成体。这也为哺乳动物核移植奠定了基础。1哺乳类动物细胞核移植研究进展 1.1哺乳类动物胚胎细胞核移植研究进展

哺乳动物核移植研究始于1975年，研究远远晚于两栖类动物，其主要原因是由于哺乳动物的受精在体内发生，而且哺乳动物早期胚胎的体外培养（In Vitro Culture, IVC）技术和早期胚胎显微操作技术在当时没有建立起来。牛津大学Bromhall（1975）将兔子的胚胎细胞核移植到未受精的卵母细胞内，部分可发育到囊胚阶段，但成功率相当低。由于不能进行染色体和供体特异性标记分析，因而这些发育的胚胎来源是否是注入的细胞核，或者是胚胎自身的细胞核都不能作一清楚的解释。鉴于当时的哺乳动物核移植理论和技术都尚未完善，人们大多将研究的重点放在了卵裂球的分离和胚胎切割上。然而，由于胚胎分割和卵裂球分离技术本身的局限性，动物克隆的数量非常有限，未能达到人们所希望的预期效果，于是人们一直也在探索动物核移植的克隆方法。在1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）的细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功的报道，但是其实验未被其他的研究人员所重复，人们仍对核移植技术仍缺乏信心。直到1983年这种局面才被Mcgrath和Solter打破，他们首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高，人们对核移植技术的应用前景看到了希望。随着核移植技术程序的建立，哺乳动物细胞核移植的研究发展很快。1986年，Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体，用去核的第二次减数分裂中期（Second Meiotic Metaphase, MII）卵母细胞作受体，并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞融合，研究发现电融合方法比病毒融合法更有效，核移植胚胎的体外发育能力更强，重组胚移植后获得了核移植后代，这是首次在家畜上获得了成功。他们的实验阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观念：（1）作为核受体，卵母细胞比受精卵有更大的优越性；（2）绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性，并建立了以早期胚胎卵裂球为供体，MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。该技术极大推动了核移植技术的发展，并成功运用于其它动物，获得了胚胎克隆牛（Prather et al, 1987）、兔（Stice & robl, 1988）、猪（Prather et al, 1989），和猴（Meng et al, 1997）等。虽然胚胎细胞核移技术的发展总体相似，但是各动物胚胎细胞核移植的发展过程是有所不同的，下面将分别对各种哺乳动物的胚胎细胞核移植技术研究进展作一简单的概述。1.1.1小鼠

小鼠的胚胎细胞核移植的研究开展较早，也是最早获得了核移植后代。1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的ICM细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆小鼠。1983年，Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。除了这些取得突破的研究外，Hoppe和Illmensee（1981）的研究证明了孤雌生殖胚胎的ICM细胞含有发育个体所需的所有基因，这些细胞具有发育的全能性。在细胞周期的调整和核质互作上，Cheong等（1993）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率明显提高，并获得了核移植后代。1996年，Kwon和Kono等通过改进方法，获得了4个和6个遗传上完全相同的继代核移植后代。另外有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性（Tsunda & Kato, 1997;Sotomaru et al., 1999）。1.1.2 牛

实验动物中的胚胎细胞核移植研究为家畜的核移植研究奠定了扎实的技术基础。而在家畜中，牛的胚胎细胞核移植研究的历史较为久远，研究的投入是最大的，也取得了丰硕的成果。1987年，Robl等首次进行牛的核移植研究，他们将1-8细胞期胚胎的细胞核移到去核的合子内，结果1-细胞期胚胎的细胞核移植后构成的重组胚可以发育到出生，而处于其它细胞期的胚胎细胞核移植后均不能支持重组胚发育超过4-细胞期。同年，Prather等（1987）用Willadsen相同的核移植技术程序（Willadsen, 1986），将16-32细胞期胚胎的卵裂球移入去核的体内或体外成熟卵母细胞内，最后出生了1头核移植牛犊，其成功率为1%。Bondioli等（1990）用16-64细胞期胚胎作核移植供体，获得了7头来自同一核供体胚胎表现型的牛犊，移植的成功率达20%。Stice和Keefer（1993）获得了54枚来自同一供体胚胎的克隆胚胎，其第一、二、三代克隆胚胎移植后均产下了牛犊。Ector等（1995）克隆与再克隆囊胚发育率（12.9%与14.9%）和妊娠率（35.7%与33.3%）没有差异性。而Heyman等（1995）用体外受精（In Vitro Fertilization, IVF）胚胎作为核移植供体，核移植胚胎的囊胚发育率达到了22.6%，这与体内胚胎作为核移植供体核的囊胚发育率相似（30.2%）。而在国内这方面的研究也取得了进展，李雪峰等（1996）成功的获得了我国第一头胚胎克隆牛。1.1.3猪

1989年Prather等利用合子间的原核交换，并利用电脉冲使供体原核和去核合子融合，得到了7头仔猪，而利用2-8细胞期胚胎的核融合去核的MII期卵母细胞，体内移植后形成11%的桑椹胚，移植88枚核移植胚胎至受体母猪仅生下了1头仔猪，成功率不到1%。因此后来的研究也着重转向影响猪胚胎细胞核移植的因素。同牛一样，猪的核受体卵母细胞既可用体内成熟的也可用体外成熟的（Prather et al., 1991）。但由于当时卵母细胞的体外成熟培养系统还不够完善，使得体外成熟卵母细胞质量较差而不能完成胚胎的体外发育全过程（Nagashima et al., 1992）。Prather等（1990）在研究发现，猪核移植胚发生了发育程序的重排，出现供体核膨胀，并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。在猪卵母细胞激活上，研究表明：采用合适的场强1次电脉冲就足以激活猪卵母细胞，增加脉冲次数并不能提高激活率（Prather et al., 1989;Prochazka et al., 1992;Nagashima et al., 1992;赵浩斌等, 1999）。而在胚胎发育的早期阶段基因表达和蛋白质合成研究中，也有了初步的成果。Schoenbeck等（1992）研究表明猪胚胎基因组从4细胞期的16h开始控制发育，Prather 和 Rickords（1992）的研究发现RNA的合成与加工始于4细胞期的24h，并认为卵母细胞质对核的重排不受母体-合子转变（Maternal to zygota transition, MZT）的影响。Parry和Prather等（1995）将8-细胞期胚胎的卵裂球融合于去核MII期卵母细胞内，发现在核移植胚胎上发现有51KD的蛋白质带，并证明了蛋白质是由胚胎卵裂球带入的RNA所合成的。

我国窦忠英（1997）和赵浩斌等（1997）用与Prather等（1989）相同的方法得到了克隆猪。1.1.4 兔

兔子胚胎细胞核移植研究起始于1975年，Bromhall等首次将兔桑椹胚的卵裂球细胞注入到成熟后激活的卵母细胞内，得到了发育的囊胚。Stice和Robl（1988）用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内，获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。随后Collas和Robl（1990）改进电激活和电融合技术，以16-细胞期胚胎细胞核为供体核，230枚重组胚移植后有23只仔兔出生，这是到目前为止效率最高的报道。Collas和Robl在兔的细胞核移植上的贡献特别大。他们的研究为以后的体细胞核移植奠定了基础。他们在兔核移植胚胎细胞核质同步对核移植的影响以及供体核形态结构变化上进行了详细的研究，得出了如下的研究成果：随着供体胚胎的发育，胚胎卵裂球构建的重组胚发育力下降，囊胚期ICM细胞构建的重组胚仍可发育到囊胚，而滋养层细胞构建的重组胚发育阻滞于8-细胞前，供体细胞核的形态重塑对核移胚的发育有利（Collas & Robl, 1991）。G1期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内时，重组胚发生早熟性染色体凝集（Premature Chromosome Condensation, PCC），中期染色体和纺锤体形态正常，核移植胚的囊胚率发育率也高，而早S期和晚S期的卵裂球移入MII期去核卵母细胞时，中期染色体和纺锤体出现异常，核移植胚胎的发育率降低（Collas et al，1992a, b）。在Collas和Robl（1991）的研究理论指导下，Yang等(1992b)将采集的8-细胞期胚胎经体外培养20～24h发育到32-64细胞期后的卵裂球再用作核移植的供体细胞核，获得了8只仔兔，证明了体外培养到32-64细胞期的胚胎仍具有发育的全能性。黄少华等（1993）首次实验证明，兔冷冻-解冻胚胎也能进行核移植，其结果与新鲜胚胎的的核移植胚在激活率、融合率及分裂率上无显著差异。之后，我国科学家王斌等（1995），周琪等（1996, 1999）也获得了胚胎细胞核移植兔。在兔核移植研究中一般体内成熟的卵母细胞作为受体胞质，Park等（1998）尝试了用体外成熟14h的卵母细胞进行核移植，发现用兔体外成熟卵母细胞同样可以获得核移植后代。关于兔继代核移植报道较少。1995年，周琪等获得了第三代继代核移植兔胚。1998年，Rao等尝试用冷冻保存的兔核移植胚胎进行继代核移植，得到了继代核移植囊胚，但未得到后代。Piotrowska等（2000）用兔8细胞胚胎卵裂球进行继代核移植，发现重组胚的发育率无影响，将第三代继代核移植重组胚移入受体后获得了克隆个体。1.1.5羊

绵羊是继小鼠后第二个获得核移植后代的哺乳动物，也是最早获得核移植后代的家畜。早在1986年，Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体，首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体，并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合，获得了核移植后代。该方法成为以后核移植的常规方法，为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。随后Smith和Wilmut（1989）用绵羊16-细胞和ICM作为核移植供体，采用该方法进行核移植，都得到了活的后代，该研究首次证明了绵羊ICM细胞仍具有发育的全能性。Pugh等（1992）的研究表明，绵羊体外成熟卵母细胞可用于构建核移植胚胎。1997年，Liu等在研究供体细胞与卵母细胞周期的协调性对核移植胚胎体外发育的影响发现，M期卵裂球移入MII期卵母细胞可以提高核移植胚胎的发育率（Liu et al., 1997）。

在国内，山羊的胚胎细胞核移植在国际上一直处于领先地位。1991年，张涌等利用4-32细胞胚胎卵裂球作为核移植供体，去核的MII期卵母细胞作受体，构建的重组胚胎移植后出生了世界首批核移植山羊5只，这是我国在哺乳动物细胞核移植上的首次获得成功。1995年，邹贤刚等通过胚胎继代核移植的方法获得了山羊4只。1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展

Gurdon等（1962;1975）用爪蟾，Diberardino & Orr（1992）用蛙分化的细胞进行核移植都得到了蝌蚪，证实了在两栖动物上至少部分已分化的细胞具有发育的全能性，细胞分化后在基因组上没有发生不可逆的改变，基因组上存在重新启动发育所需的所有基因，这一理论为哺乳动物体细胞核移植研究奠定了理论基础。Czolouska等（1984）的研究表明已分化的小鼠胎儿胸腺细胞移植到激活的卵母细胞后可以发生形态重塑，形成原核样结构，推测体细胞能够支持胚胎的发育。后来，Kono等（1991）报道了用小鼠胸腺细胞核移植后得到了发育的囊胚，但移植后未获得分娩的核移植小鼠。由于当时普遍认为哺乳动物的细胞分化在遗传结构上发生了不可逆的改变，部分基因发生缺失，进而失去了发育的全能性，这些研究结果未引起人们的重视。直到1997年，Wilmut等得到了举世瞩目的第一只成年体细胞核移植绵羊—Dolly后，体细胞核移植才受到广泛的关注，人们才开始重新认识细胞分化的本质以及细胞分化的理论基础。当然，人们对―Dolly‖羊也提出了置疑，但DNA指纹分析证明了Dolly的确来自成年绵羊乳腺上皮细胞（Ashworth et al., 1998;Signer et al., 1998），后来众多的体细胞核移植的成功充分肯定了该研究的结果（Schnieke et al., 1997;Wakayama et al., 1998;Bulter et al., 1998;Shiga et al., 1999;Lanza et al., 2000b）。Dolly的出生，使哺乳动物核移植研究进入了一个崭新的阶段，Wilmut等建立的一整套绵羊体细胞核移植程序，如恢复体细胞核全能性的―血清饥饿法‖，体细胞传代阶段确定以及体细胞克隆后代与亲本核供体间的DNA微卫星分析技术成为全世界同行公认的哺乳动物体细胞核移植技术的基本程序。

在短短的几年里，核移植研究从胚胎细胞核移植转入了体细胞核移植研究阶段，世界各地的科学家对各种类型的体细胞核移植进行了有意义的尝试。用胎儿细胞和成年动物体细胞进行核移植的研究进展迅速，所使用的供体细胞也越来越来广泛，并取得了重大进展。迄今为止，已有下面9种供核类型的体细胞核移植后代产生。

（1）胎儿成纤维细胞：Cibelli 等（1998）采取34日龄牛胎儿成纤维细胞产下了后代。之后Vignon 等（1999）重复了此实验，也获得产仔的结果。后来相继得到了克隆山羊（Baguisi et al., 1999;Keefer et al., 2002），克隆猪（Onishi et al., 2000）和克隆兔（Chesne et al., 2002）。（2）成体乳腺细胞：Wilmut等（1997）从妊娠母羊乳腺中采取细胞，重复Campbell等（1996）的实验方法，成功获得了世界首例成年绵羊体细胞核移植后代—Dolly。之后，Zakhartchenko等（1999a）用1 头3岁的牛乳腺上皮细胞核移植得到了克隆牛。

（3）卵丘/颗粒细胞：Wakayama 等（1998）分离卵母细胞周围的卵丘细胞作为核供体细胞，不经培养直接作核移植，获得50多只克隆小鼠。这是继―多利‖后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。之后也相继研究成功克隆牛（Kato et al., 1999;Wells et al., 1999）、克隆山羊（Baguisi & Overstron, 2000）和克隆猪（Polejavea et al., 2000;Cabot et al., 2001）。

（4）卵管/子宫上皮细胞：Kato 等（1998）进行了输卵管上皮细胞核移植实验，核移植后共获得94枚融合胚，其中24枚发育到囊胚阶段，移植4枚胚胎，最后产下3头牛犊。

（5）肌肉组织的细胞：法国科学家Bulter等（1998）、Vignon 等（1998）报道了用胎儿肌肉细胞作供体得到了核移植牛。而Shiga 等（1999）采取2岁公牛肌肉细胞，传代培养至少4代，经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。

（6）成体耳部成纤维细胞: Kubota等（2000）用1头17岁老牛的耳缘皮肤成纤维培养传代至15代，用于核移植，得到了6头核移植牛犊。之后，Park等（2002）采用成体耳部成纤维细胞也获得了克隆猪。

（7）睾丸支持细胞：Ogura等（2000a）采用未成熟的小鼠睾丸支持细胞进行体细胞核移植而获得了克隆小鼠。

（8）小鼠尾尖细胞：Wakayama和Yanagimachi（1999）采用成年小鼠的尾尖细胞得到了核移植后代。接着Kato等（1999）和Ogura等（2000b）也分别得到了来自小鼠尾尖细胞的克隆小鼠。

（9）初乳的乳腺上皮细胞：Kishi等（2000）用从初乳中分离出的乳腺上皮细胞作核移植获得了2只克隆牛。

综上所述，自体细胞核移植绵羊成功后，体细胞核移植后代已在牛（Kato et al., 1998）、小鼠（Wakayama et al., 1998）、山羊（Bagsuisi et al., 1999）和猪（Polejaeva et al., 2000;Onishi et al., 2000）等动物上获得了成功，下面将对各动物种类的研究进展进行综述。1.2.1小鼠

小鼠体细胞核移植研究所采用的方法与其它动物有所不同，在其它动物中所采用的方法是电融合法，小鼠上常用的方法是细胞质内注射法，即通过显微操作将供体细胞直接注入去核卵母细胞内。1989年，Tsunoda等尝试将雄性小鼠的胎儿原始生殖嵴细胞移入去核的合子内，构建的重组胚大多未发育到囊胚。1995年，Kato和Tsunoda的研究证明了胎儿生殖细胞具有发育的全能性或多能性。接着Kimura和Yanagimachi（1995）和Sasagawa等（1998）的研究证明成熟个体的生殖细胞（初级、次级精母细胞）具有发育的全能性，其中Sasagawa等（1998）的移植胚胎经移植后出生了2只小鼠。

1998年，Wakayama等（1998）采用不经过培养的小鼠卵丘细胞作为核供体，直接注射给去核的卵母细胞，得到了10只可育的小鼠，这也是继―多莉‖后第二批哺乳动物体细胞核移植后代，它的成功有力地支持Wilmut等（1997）的试验结果。Wakayama等（1998）同时还进行了公鼠睾丸支持细胞和雌鼠神经细胞的核移植实验并获得了附植的结果，但均中途流产。但是Ogura等（2000a）用来源于未成熟的睾丸支持细胞作供核进行细胞质内注射，获得了后代。用小鼠尾尖细胞作供核，也获得了克隆小鼠（Wakayama & Yanagimachi, 1999;Kato et al., 1999;Ogura et al., 2000b）。其中值得一提的是，这次Ogura等（2000b）采用的是电融合方法获得克隆小鼠的。1.2.2牛 在哺乳动物的体细胞核移植研究中，牛的核移植研究是当今的热点，并取得了重大进展。早1995年，Delhaise等就用核移植方法证明来自牛雄性胎儿的原生殖嵴细胞在受体胞质内可以发生发育程序的重编，核移植胚可发育到囊胚。1997年，Lavior等以牛新鲜和冷冻的卵原细胞，早期卵裂球和颗粒细胞为供体构建重组胚，结果重组胚在融合后40h的卵裂率无明显差异，且由这些供体构建的重组胚有部分可以发育到囊胚期，当来自卵原细胞的桑椹胚和囊胚移植到受体后，重组胚可以发育为胎儿和胚外组织。这些都为体细胞克隆牛奠定了基础。Kato等（1998）和Cibelli等（1998）分别用成年牛的卵丘细胞、输卵管上皮细胞和转染的胎儿成纤维细胞作为供体得到了体细胞核移植牛犊。几乎同时，法国科学家也报道了用胎儿肌肉细胞经过培养传代后作供体得到了核移植牛（Bulter et al., 1998;Vignon et al., 1998）。而Shiga 等（1999）采取2岁公牛肌肉细胞，传代培养至少4代，经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。Hill等（2000a）用血清饥饿法处理牛胎儿成纤维细胞后在进行核移植，可显著提高重组胚的囊胚形成率，而血清饥饿法处理对成体成纤维细胞的核移植胚胎的发育没有影响。Wells等（1999）从活体牛卵巢内采集得到颗粒细胞作为核供体，获得了10头核移植牛，成功率达到10%。杨向中实验室于2000年3月公布了用17岁龄公牛的耳部成纤维细胞，成功得生下了6头克隆牛（Kubota et al., 2000）。Oikawa等（2000）从一头20岁的日本黑牛获得了颗粒细胞，经传代培养（5代）和血清饥饿培养后，核移植后获得了2头牛犊。由此可见，核移植技术可为濒危动物拯救开辟了一条新的途径。1.2.3猪

相对于其它动物而言，猪的体细胞克隆研究困难较大，进展很慢。在1995年，Liu等就将猪原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）移植到兔卵母细胞质内，核移植胚胎卵裂并发育到4-细胞期。Tao等（1999）和Prather等（1999a）在完善猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养技术后，用体外培养的卵母细胞和胎儿成纤维细胞获得了发育到囊胚期的核移植胚胎12枚，从这些结果也可以发现猪胎儿成纤维细胞在去核的卵母细胞内同样可以发生发育程序的重编，预示着猪体细胞核移植即将获得成功。接着Ott 等（2000）、Uhm 等（2000a）、Verma 等（2000）和Koo 等（2001）等利用胎儿成纤维细胞和卵丘细胞与体外培养卵母细胞构建重组胚都发育到了囊胚阶段。Kim 等（2000）的研究发现，用胎儿成纤维细胞进行核移植所构建的重组胚的转录和DNA合成发生在24h。2000年3月，PPL公司宣布通过体细胞核移植技术获得5头世界上的第一批体细胞克隆猪（Dave, 2000）。2000年8月，Onishi等将胎儿成纤维细胞直接注入体内成熟去核的卵母细胞内，得到了1头雌性仔猪。同年，Polejaeva等（2000）改进核移植方法，先将颗粒细胞与去核卵母细胞融合，当核移植胚胎发育到原核期后再进行核移植，将核移植胚的原核与体内受精的原核期受精卵的原核进行交换，胚胎移植后由185枚胚胎获得了5头白色的仔猪，核移植效率达到1.2%（Polejaeva et al., 2000）。Betthauser等（2000）也报道了体细胞核移植的4头健康的雄性仔猪。随着猪体细胞核移植技术的发展，人们在研究如何提高核移植胚胎体外发育率（Betthauser et al., 2001;Klocke et al., 2001;Kuhholzer et al., 2001a, b）和利用皮肤成纤维细胞进行核移植的同时（Roh et al., 2001），逐步将研究重点转向转基因克隆猪的研究（Park et al., 2001;Uhm et al., 2000b;Koo et al., 2001）。2001年 4月，PPL公司宣布他们在去年得到体细胞核移植猪后，又通过体细胞核移植的方法得到了5头带有人类基因的转基因猪，这些猪可望减小与人体器官的免疫排斥反应，为人类提供可移植的器官（网上新闻报道，见PPL公司主页）。正因为转基因猪具有如此巨大的商业价值，利用体细胞核移植技术生产转基因猪是未来猪体细胞核移植的主要方向。1.2.4兔

兔的体细胞核移植的研究进展相对较慢。Moens等（1996）将妊娠18-20天的兔胎儿生殖细胞与去核卵母细胞融合，来自雄性和雌性性腺细胞的重组胚卵裂率相同（均为37%），而用培养4天后雄性性腺细胞构建的重组胚囊胚发育率（16%）明显高于雌性的（4%），表明了雄性和雌性二倍体生殖细胞在去核卵母细胞的发育程序重编潜力不同。Yin等（2000）将卵丘细胞经传代培养3-5代后，与去核卵母细胞融合，用电脉冲和6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）结合激活重组胚，其卵裂率和囊胚率发育率分别为66%和23%，174枚重组胚移植到8只受体后，在其中3只受体上观察到3个植入位点，但未发现胎儿。Dinnyes等（2001a）以兔耳部成纤维细胞为供体构建重组胚，得到与Yin等（2000）相近的卵裂率和囊胚发育率。我国的李光鹏（2000）用肌纤维细胞为供体，重组胚囊胚发育率为37.1%。Chensne等（2001）发现卵丘细胞构建的重组胚的囊胚发育率（46.7%）明显高于胎儿成纤维细胞（3.6%），但后者则获得了产兔的结果（Chesne et.al., 2002）。1.2.5羊

Ledda等（1996a）将羊PGCs植到去核的卵母细胞内，重组胚在体外可以发育，但移植后未出生后代。1997年，Wilmut等用成年绵羊乳腺上皮细胞克隆出了世界上第一头首例体细胞核移植羊，这也是人们在长期进行体细胞核移植研究所获得的突破性成果。Wells等（1997）采用与Wilmut等（1997）相似的方法，从一枚8天的羊雄性囊胚的ICM获得了细胞，体外培养后建立细胞系，用低浓度血清诱导G0期，分别移植到去核体内、外成熟的卵母细胞内，最后获得了3只雄性羔羊。克隆羊克隆牛的技术程序相似，但克隆绵羊大多采用体内成熟的卵母细胞作受体胞质。克隆羊的效率也和所报道的克隆牛的效率相似（Colman, 2000）。转基因克隆羊的研究也取得了重大突破，已相继研究成功转基因克隆绵羊（Schnieke et al., 1997;McCreath et al., 2000）和克隆山羊（Keefer et al., 2001）。

我国克隆羊的研究进展很快，郭继彤等（2000）用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作为核移供体，将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，获得了两只遗传上相同的体细胞核移植山羊，这也是世界上首批成年体细胞克隆山羊。在转基因克隆羊的研究上，也取得了一定的成绩。安晓荣等（2001）报道用体细胞克隆出了绵羊转基因囊胚。成勇等（2002）以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。1.3胚胎干细胞核移植研究进展

胚胎干（Embryonic Stem, ES）细胞是早期胚胎细胞或囊胚ICM细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞，这种细胞具有正常的二倍体核型，它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化，又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织（Evans & Kaufman, 1981）。此外，将从胎儿的原生殖嵴分离出来的PGCs进行培养，也可以形成在功能和形态上与ES细胞相似的细胞系。ES细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。ES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似，亦需进行细胞周期的调控。

迄今为止，只有在小鼠和人已培养建立ES系，而牛、兔、羊、猪仅获得了拟干细胞，因此用真正的ES细胞进行核移植只有小鼠是获得了成功（Wakayama et al., 1999b）。

在研究早期，Tsunda和Kato等（1993）将小鼠的ES细胞移入去核卵母细胞内，核移植胚胎体外发育到桑椹胚和囊胚期，移植到受体后也发现有植入位点，但未获得核移植后代。Sims和First（1994）将培养的ICM注入到去核卵母细胞，获得4头牛犊。Campbell等（1995）将山羊第三代的ES样细胞进行核移植，获得了活的核移植羔羊。猪的ES样细胞，在核移植后可以指导胚胎发育到囊胚阶段，目前仍没有活的后代出生（Chen et al., 1999）。虽然牛ES样细胞经过核移植后，出生的后代在生后不久死亡，但也证明了牛ES样细胞可以参与胎儿的发育，具有发育的全能性（Iwasaki et al., 2000）。Wakayama等（1999b）在继小鼠的体细胞核移植成功后，又利用相同的技术对小鼠ES细胞进行核移植，得到了核移植小鼠31只。该研究证明了用ES细胞进行核移植产生后代的可能性。由于ES细胞在体外具有无限增殖而不发生分化的特性，故可以在体外更方便地对ES细胞进行基因改造，通过基因―敲除‖和―插入‖来研究基因的功能，Sato等（2000）用小鼠的ES细胞系TT2的细胞直接注射入去核的卵母细胞内，核移植胚胎可发育到妊娠14天，但未能出生小鼠。已报道利用小鼠ES细胞可以定向分化为造血细胞（Perkins, 1998），而利用人ES细胞可以在体外分化如分化为分泌胰岛素的胰岛素样细胞（Odorico et al., 2001）等多种细胞。最近，Wakayama等（2001）报道将个体细胞核移植后得到了sntES细胞（具有ES细胞的特性）移植到去核卵母细胞胞质内，获得了20只小鼠，其中11只小鼠发育正常并具繁殖能力。由此表明，sntES细胞器具有发育全能性，可以建立成年动物自身的干细胞系，这些干细胞可以分化产生各种细胞、组织和器官，用于进行自身疾病的细胞治疗。因此对人类体细胞核移植和干细胞的研究与应用有深远的影响。目前，利用ES细胞进行核移植的主要研究方向是利用这些细胞生产转基因动物，并利用核移植建立成年动物体细胞核移植ES细胞系。1.4转基因克隆动物研究进展

随着哺乳动体细胞核移植技术的发展，以及人和家畜基因组计划的完成，转基因技术的研究走出了20世纪90年代徘徊不前的局面，进入了新的发展时期，即转基因克隆动物时期。转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆技术的有机结合，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。PPL公司Schnieka等（1997）率先克隆出了转基因动物。他们是从35日龄胎儿分离的体细胞，经传代培养后和基因转移后，将转染了新霉素抗性（Neomycin）基因和人凝血因子（IX）基因的体细胞移植到受体卵母细胞内，出生了带有IX基因的转基因羊。Cibelli等（1998）用一个55日龄的雄性牛胎儿分离得到成纤维细胞，体外培养后转代两次，用标记ß-gal/neo对细胞进行转染，转染的细胞用新霉素筛选两周之后，得到5个抗性细胞克隆，经PCR分析，发现它们都是转基因细胞，而且表明了标记基因，选择其中一个细胞为核移植供体，通过核移植得到重组胚276个，其中33个（1%）发育到囊胚，经移植到11头同期化的受体母牛体内后，出生了4头小牛，经过分析检测，发现这4头小牛都在同一个染色体位点整合了外源基因，说明了它们来源于同一个体细胞克隆，而实验中的转基因效率达到了1.4%。1999年，Baguisi等克隆出来的5只转基因山羊中，其中的1只羊在奶中表达了高水平的抗凝血因子III。2000年，McCreath等用基因打靶后的绵羊体细胞生产了转基因绵羊。随后转基因山羊（Keefer et al., 2001）和转基因猪（Lai et al., 2002）也相继获得成功。

我国的转基因克隆技术也取得了一定的成绩。安晓荣等（2001）报道用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，用绵羊的转基因颗粒细胞进行核移植，得到了发育的绵羊转基因囊胚。成勇等（2002）以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。1.5种间细胞核移植研究进展

细胞核移植作为一种重要的科学研究方法，随着这项技术的不断成熟，它也成为挽救濒危动物的一个重要手段，由于濒危动物的卵母细胞来源较少，进行体细胞核移植的难度增大，人们就希望通过种间核移植技术来达到这个目的。但在这方面的研究进展是较为缓慢。

De Roeper 等（1977）将Hela移入非洲爪蟾卵内，结果发现Hela细胞在爪蟾内能够发生染色体扩散和DNA合成，表明爪蟾卵母细胞内有能够激活哺乳动物体细胞的因子，这种激活因子无特异性。McGrath和Solter（1986）利用他们在小鼠胚胎细胞核移植上的方法进行小鼠不同种间原核交换研究，结果获得的种间核移植胚仅出现有限次数的卵裂。梅琪等（1993）进行的鼠-兔种间核移植研究，结果重组胚胎有43.1%分裂率，5.4%发育到囊胚。谭世俭等（2001）作的水牛-黄牛种间胚胎细胞核移植研究，获得了发育的种间核移植囊胚。李光鹏（1998）将小鼠8-细胞胚的卵裂球移入猪去核卵后，重组胚可卵裂至8细胞期。Dominko等（1999）等以牛、猪、羊、大鼠和猴的皮肤成纤维细胞为核供体，牛卵母细胞为核受体，探索牛卵母细胞在已分化体细胞核指导下的有丝分裂能力及用牛卵母细胞作为受体胞质的可能性。结果表明，除了大鼠-牛杂种胚外，其余都发育到囊胚阶段，但是杂种胚移植到受体后没有出生后代。然而，就种间核移植胚发育到囊胚而言，牛卵母细胞维持发育的能力没有因供核动物的物种，染色体数目和年龄的不同而表现出差异，表明哺乳动物保留着调节早期胚胎发育的机制，牛卵母细胞的胞质能支持具有不同染色体种类和数目的异种核发育。Lanza等（1999a, b）把人的体细胞核移植到牛的去核卵母细胞，得到的一些类似核移植胚胎也都发育到较高级阶段。近年来，人们尝试了黄牛-水牛（Kitiyanant et al., 2000;Nguyen et al., 2000），小鼠-猪（Lee et al., 2001），小鼠-牛（Arat et al., 2001;Liu et al., 2001），以及猪-牛（Yoon et al., 2001）等动物种间体细胞核移植的研究，都分别得到了体外发育的胚胎。目前，Lanza等（2000b）的研究获得了令人振奋的结果。他们把一种野牛的皮肤成纤维细胞核移植到家牛的去核卵母细胞中，发育到了妊娠晚期并已分化成复杂的组织和器官的野牛胎儿。接着，Vogel（2001）报道将印度野牛的体细胞作供核移植到去核的家牛卵母细胞内，最后出生了1头发育正常的野牛，但出生后2天就死了，但这一结果无疑证明哺乳动物体细胞可以在异种卵母细胞内完成核发育程序重编，使已分化的体细胞发生去分化并完成整个发育过程。也预示着我国在体细胞克隆大熊猫、猕猴及比格犬上有可能成功。虽然我国科学家陈大元等（1999）把大熊猫的体细胞核移到兔卵母细胞中，重组胚能发育到囊胚阶段，但目前未能获得的后代。这一事实说明，种间核移植确有一定的难度，只有在诸如核发育程序重排程度和可靠性、供体细胞胞质和受体胞质（例如线粒体DNA）之间的相容性等问题弄清后，才有可能实现种间核移植。

2.1受核细胞的准备

2.1.1成熟卵母细胞的获得

成熟卵母细胞的获得的途径也有两种：体外成熟和体内成熟。体内成熟是用超排的方法获得，在牛上很少使用。体外成熟培养既方便又利于大量获得。

体外培养的卵母细胞又有几个来源：①直接由卵巢上有腔卵泡抽取或剥离；②由腔前卵泡培养获得，③冷冻保存的卵母细胞。目前广泛使用的是前者。而后两者则为卵母细胞提供了更为广阔的来源。

2.1.1.1卵巢的采集及卵母细胞得分离

目前卵巢主要来自大型屠宰场，用加双抗的生理盐水保存卵巢，温度在30-38℃之间，也有采用25~37℃的。卵巢的保存温度和时间在不同程度上影响IVF/IVC的囊胚发育率，卵巢在33~35℃保存8小时以内并不会减弱卵母细胞的体外成熟能力。

有认认为卵巢以20~25℃至少可以保存6小时而不影响IVM/IVF效果及随后的胚胎发育。试验证明卵巢以24~33℃保存4小时以内最为理想。卵丘卵母细胞复合物（COC）有剥离法和抽取法两种分离方法，有人认为剥离法对COC损伤较小，更有利于提高卵母细胞的成熟率，但是，此方法太过于复杂，不如抽取法快，故而后者应用较多。

采集卵巢前应先将无菌生理盐水加热到稍高于预定温度（如38~39℃），在出发前倒入预先灭菌的保温瓶中，加入一定浓度的双抗。采集卵巢时要尽量减少对卵巢的污染，动作要快，放入保温瓶前先用温生理盐水冲洗。带回实验室后，用灭菌温生理盐水或PBS冲洗，然后在无菌室内分离卵母细胞。

用抽取法时，选择12号灭菌针头，抽取前先吸一些卵母细胞洗涤液于注射器中，抽取液注入洁净无菌离心管中。在整个过程中要保温，尽量减小温度变化。卵巢的采集及卵母细胞得分离过程最容易受到污染，所以应尽量保证操作过程中的无菌性。2.1..1.2 卵母细胞的成熟培养

将抽取液倒入平皿中检卵，检出符合要求的卵丘卵母细胞复合物。

用培养液洗涤几次后，于CO2培养箱内，5%CO2浓度，38.5℃培养18-24小时，检查成熟率。影响卵母细胞成熟率的因素很多，但主要还是培养液成分。内刘泽隆等

认

为，TCM199+

体

积

分

数

10%~15%的FCS+1~2mg•L-117β–E2+10mg•L-1FSH+20~50mg•L-1LH是牛卵母细胞成熟培养的理想培养系统，且成熟率达90%以上。过高浓度庆大霉素会抑制卵母细胞中先粒体的有丝分裂增殖，但如果不能保证无菌操作，还是应该添加。雷安民等的研究中使用丙酮酸钠、庆大霉素和NCS(ECS),并证明单独添加发情牛血清即可满足成熟的要求，为防止污染而使用的庆大霉在40mg/L的添加剂量下对牛卵母细胞的成熟率没有显著影响。卵丘细胞发散呈放射状是卵母细胞成熟的一个标志，用吸管吹打去卵丘细胞，然后在显微镜下观察极体排出情况。2.1.2成熟卵母细胞去核

卵母细胞成熟后要去掉原有细胞核或使其丧失功能，分去核和灭能两种方法，实践中多采用显微去核。

成熟卵母细胞去核是核移植技术中的一个重要环节，要求去的干净，又尽可能的减少对细胞质的损伤。

目前使用的去核方法有以下几种：

1.挤压法，于近第一极体（PB1）处的透明带作一切口，用移核管挤压卵母细胞，使PB1和附近1/3的胞质挤出透明带。此法与细胞分裂相有关，必须在恰当的时间进行，否则不能将染色质去净。

2.改进的点击去核法，该法与前者相比对胞质损伤小，但技巧性较高。

3.负压吸取法，据报道在微分干涉差倒置显微镜的高分辨率视野下是卵母细胞轻微旋转，当纺锤体与焦平面垂直时核区与胞质的折光率略有差别，可准确吸出细胞核和少量细胞质，去核率可达100%。

4.半卵法，切开透明带，将一半细胞质吸出并移入另一个空透明带中，然后用荧光染料检查染色质在哪一半中。2.2供核细胞的准备

现在已经成功使用的供核细胞有胚胎细胞、胎儿成纤维细胞、成年和老年转基因成纤维细胞、乳腺上皮细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、尾部细胞及耳细胞等。

核移植前必须对这些细胞进行同期化处理，实践证明GO、期G1期是最佳时期。诱导分化细胞进入静止期是克隆成功的关键。

对供核细胞进行同期化处理常用方法是血清讥饿法，血清浓度和饥饿时间也有一定的要求。其他方法还有：秋水仙胺塞氨酯哒唑诱导M期同步化、用阿菲迪霉素诱导G1期同步化期、用环己酰胺诱导G2同步化。

也有通过选择细胞类型来获得的，原理是不同类型的细胞在细胞周期不同阶段上得数目相差很大，如刚排出的卵母细胞周围的卵丘细胞90%以上处于G0或G1期。2.3移核

移核有两种方式：把细胞核移入去核卵母细胞和把体细胞移入去核卵母细胞。在体细胞核移植中多用后者，移入后进行融合与激活。按移入位置也可分为两种：移入卵周间隙和直接移入细胞质内。移核时需要借助显微操作系统进行，用固定吸管固定去核卵母细胞，调节注射吸管，使之处于同一焦平面上，移动注射吸管慢慢沿去核时的切口将供核体注入卵周间隙。

2.4融合与激活

融合方法分化学法和电融合法。但通常使用的是电融合法，需要在专门的融合仪器上进行，往往通过增加电刺激数来提高激活率，另外还可以通过化学试剂（如乙醇、钙离子载体、锶等）处理以提高核移植的效率。关于电融合的研究很多，从融合时间到电压、频率都有较详细的论述。目前，一般采用交流电场排细胞的方向即交流定位，常用的频率为600~1000kHz，电压为5~6V，持续时间约5~10秒钟。常用的直流电融合条件为1.0~2.0KV/CM的场强M，30~60ì¾的持续时间。

2.5重构胚的培养

重构胚经激活处理后，需要培养一段时间，待发育至桑椹胚或囊胚期时再移植给受体母牛。重构胚的培养有体外和体内两种培养方式，实践中主要用前者。胚胎体外培养是影响克隆成功率的一个重要环节，也是克隆胚生产工厂化的一个前提。目前有关胚胎体外培养系统的研究很多，但最热的时共培养系统。

体外培养哺乳动物胚胎的主要障碍是发育阻滞，但不同的动物出现再不同的时期。研究表明，胚胎发育阻滞与基因组激活关系密切，多发生在胚胎卵源性基因调控向胚源性基因调控转化，即胚源性基因激活时期，因此推测发育阻滞可能与胚源性基因激活激活不全或激活失败有关。体细胞共培养系统能在一定程度上克服胚胎发育阻滞可能在于体细胞能：产生促有丝分裂因子；产生细胞外基质成分，促进胚胎细胞分化；可代谢或除去培养液中的胚胎毒性因子

不同类型的体细胞的共培养效果是不一样的，一般采用输卵管上皮细胞和颗粒细胞。桑润滋等在研究兔的核移植时认为，在基础培养液相同的条件下，与胎儿成纤维细胞饲养层共培养，尤其是与同源胎儿成纤维细胞饲养层共培养，有利于重构胚的发育，尤其是有利于提高桑椹胚和囊胚的发育率。培养液主要有TCM-199和CR1aa等，在基础液的基础上再加其他因子。2.6克隆胚移植

胚胎培养至桑椹胚或囊胚期时，需要移植到同期假孕母牛体内，使其继续发育。受体母牛可选自然发情的，也可进行人工同期化处理，但受体母牛必须有明显的黄体。为了维持妊娠，可移入多枚胚胎或施以外源激素。3.核移植技术已取得的成就

在供核细胞受核细胞的选择上，以大量的实践证明MⅡ期的成熟卵母细胞是最佳受核细胞 卵母细胞体培养技术与超数排卵技术已经相当成熟，培养系统不断完善，不但效率上有所提高，简化的培养系统也有报道

腔前卵母细胞的体外培养及卵巢、卵母细胞的冷冻保存为卵母细胞提供了更为广阔的来源。体细胞的体外培养技术也已经比较成熟，体细胞的冷冻保存与体外成功传代同样为大量克隆提供可能。

核移植技术已经在多种动物上获得成功，而且用多种类型的细胞获得克隆后代，以事实证明了克隆技术的可行性。

核移植技术在理论上也已取得了巨大成就。

4.现有技术的不足

哺乳动物核移植技术虽然在多种动物上获得成功，但技术仍然不成熟，仍没有走出实验室。①受核细胞的来源问题还没有真正解决，实践证明卵母细胞是目前的最佳选择，体外成熟培养技术也已经比较成熟，但是来源仍受到限制。从屠宰场采集的新鲜卵巢上抽取，一是容易受到污染，二是对试验造成了巨大的限制。现在卵巢及卵母细胞的冷冻保存以及腔前卵泡的体外培养已取得了一定的进展，但仍有大量的工作要做。

②供核细胞的来源也仍未解决，现在的研究还没有证明是否所有的体细胞都适合。某些类型的体细胞在化过程中基因可能发生了不可逆的转变，以至丧失再程序化的可能。③去核技术还不过关，目前使用的主要是显微操作去核，怎样既去的干净又尽量减少对细胞质的损伤仍是目前要解决的问题。④重构胚的融合与激活技术还有待于进一步研究，融合与激活是关系到重构胚能否发育的重要一步。

⑤重构胚的培养技术也还在研究中，有效的培养技术是提高重构胚发育率的必不可少的条件。⑥细胞核再程序化机制仍不清楚，如果能解决这一问题，将会给动物克隆带来具有划时代的意义的变化。⑦对动物克隆过程中出现的问题还没有找到确切的原因。如：Kruip等和Garry 等对利用核移植技术培养的克隆牛后代分析表明，克隆动物在妊娠时间及出生 重等方面远远超过对照组个体但没有找到确切的原因。

5.核移植技术的前景

5.1核移植技术在普通畜牧生产上的意义 哺乳动物克隆技术在畜牧生产上的应用将带来划时代的意义。首先，在迅速扩大优秀个体数量，提高畜产品数量和质量上有重要意义。在已优秀个体的生产性能之后，利用体细胞核移植技术，可以迅速复制出大量与其遗传基础完全相同的个体来，以便于迅速提高产品数量。如果采用传统的方式进行改良，则需要很长的时间才能满足需要，即便是用胚胎细胞克隆，也远不如体细胞核移植技术优越。

另外，随着核移植技术的不断完善，将真正实现胚胎的工厂化生，从而大大降低胚胎及畜牧生产成本，不需要进行生产目的的育种工作。其次，核移植技术还是动物育种的新途径。传统的育种方法不仅费时费力、效率低、耗资巨大，而且由于遗传漂变，往往很难达到预期目的；而核移植技术则不同，与胚胎移植相结合，则能迅速提高优良基因及其组合在群体中的频率，加速育种进程，提高育种效率。

最后，核移植技术还是动物保种的有效措施。现在，许多家畜品种濒临灭绝，而传统的保种方法则要建立保种群，代价既高，有难以防止近交衰退，很难起到保种效果；建立精子、卵子及胚胎库保种虽然已经比较有效，但仍某些缺陷，如果结合核移植技术则将更加完善。

5.2核移植技术再生产转基因动物上的意义

细胞核移植技术与转基因相结合是当今研究的一个热点，它有医学上和畜牧生产上的巨大的价值。生产转基因动物是提高畜产品质量和数量的现代手段。知道基因与功能的对应关系之后，我们就可以挑选出需要的基因，然后生产转基因动物，从而优化动物的性状以满足我们的物质需求。在医学上，我们一方面可以利用转基因动物生产移植器官，另一方面制作乳腺反应器生产药物。有些药物依靠传统的提取方法获得，成本是很高的，而且也很不安全，通过转基因从动物获得已成为必然。目前外源DNA导入方法有显微注射法、电穿孔法、胚胎干细胞法、精子载体法、逆转录病毒转染法，但自1985年显微注射技术问世以来，对受精卵细胞的原核进行DNA显微注射一直是获得转基因家畜的唯一实用手段。

但该方法基因整合率低，是其最大的缺点，只有0.5—3%的显微注射受精卵可以产生转基因后代，对大动物 则更低。转基因随机组合造成的―位置效应‖所引起的表达结果的不稳定性，除了采用基因座控制区、核基质结合区序列或将完整的基因座导入动物的基因组等方法消除位置效应外还需要从大量的转基因动物中筛选出高效表达的动物。

Capeddhi(1998)报道用显微注射法可得到很高的转染率，占接受外源DNA细胞的10—20%，但一次只能注射一个细胞；电穿孔法可以同时使许多细胞得到转染，Mansour（1988）研究发现电穿孔可使1%ES细胞稳定转染。但是，如果与核移植技术结合，就可以进行大量克隆。体细胞数量远比受精卵多，对体细胞进行基因打靶，筛选已经转染的细胞，然后进行核移植，这样不仅可降低成本还，能提高转基因效率。6.核移植技术的负面效应

核移植技术虽然回给人们带来巨大的方便和经济利益，但也有其副效应。克隆作为一种无性繁殖手段，没有双亲的基因组合，其性状上不会超过供体，更谈不上进化，这无疑是违背生物进化规律的，必将导致物种退化；

7.植物细胞核蛋白质组学研究进展 篇七

1 植物细胞核与核蛋白质的制备

目前的植物细胞核蛋白质组学研究,主要是从植物幼苗或悬浮培养细胞中提取细胞核。从幼苗中提取细胞核,首先在低温条件下将幼苗研磨成粉末,进而通过以Percoll为介质的密度梯度离心富集细胞核[1]。从悬浮培养细胞中提取细胞核,利用匀浆机破碎或细胞壁水解酶除去细胞壁,然后通过改变细胞内外渗透压破碎原生质体,并利用密度梯度离心富集细胞核[1]。获得细胞核以后,通常利用DAPI染色后的显微观察,或通过测定细胞核制备液中叶绿素含量等方法来评价细胞核的纯度。然后利用酚抽法或TCA丙酮沉淀法提取细胞核蛋白质。进而,以组蛋白或核仁纤维蛋白为细胞核标记蛋白质,通过免疫印迹实验来检测细胞核蛋白质的纯度,也可通过检测过氧化氢酶活性来评价细胞核蛋白质的纯度。

2 水稻细胞核蛋白质组学

水稻(O.sativa)是重要粮食作物,也是进行分子生物学研究的良好模式植物。Aki et al[2]利用蛋白质组学技术鉴定了563种水稻细胞核蛋白质,其中307种为DNA结合蛋白质。这些蛋白质中除了包括mRNA转录和剪切相关的因子外,还包括参与糖信号传递的己糖激酶,以及参与蛋白质相互作用的WD40类蛋白等。此外,Choudhary et al[3]鉴定了水稻响应干旱胁迫过程中的109种细胞核蛋白质,这些蛋白质主要参与胁迫防御、信号转导、染色质重塑、基因调控、转录调节、蛋白质合成与降解等过程。其中受干旱胁迫影响的蛋白质主要包括:参与胁迫早期应答的受体类蛋白激酶、33-kDa分泌蛋白、酪氨酸磷酸酶类蛋白质、无机焦磷酸酶,参与细胞代谢活动的氨基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、甲基转移酶、硫甲基转运酶,以及参与细胞防御的超氧化物歧化酶等[3]。

3 维柯萨细胞核蛋白质组学

维柯萨(X.viscosa)是典型的复苏植物,其叶片组织相对含水量可以降低到5%,在持续干旱80 h后复水,叶片仍可以完全恢复。Abdalla et al[4]鉴定了维科萨叶片细胞核中18种干旱应答蛋白质。其中参与基因表达(如反转录酶、锌指解旋酶和内含子成熟酶)、蛋白质合成(如核糖体蛋白L28和蛋白翻译延伸因子)、蛋白质折叠(如分子伴侣)、蛋白质降解(如蛋白水解酶),以及能量代谢(如ATP合成酶α链)等蛋白质表达受到干旱诱导。这表明维柯萨通过调节特定基因表达与蛋白质折叠等应对干旱胁迫[4]。

4 洋葱细胞核蛋白质组学

洋葱(A.cepa)根分生组织具有持续或周期性分裂能力,是研究细胞周期与细胞增殖的良好材料。GonzálezCamacho et al[5]比较分析了洋葱根分生组织和非分生组织细胞核蛋白质组的差异。他们利用双向电泳技术在根分生组织中检测到384个蛋白质点,在非分生组织中检测到209个蛋白质点。其中,一些人们熟知的细胞核蛋白质,如RNA聚合酶Ⅰ、B23和类核仁蛋白NopA100在细胞增殖过程中表达量明显上升。进而,他们通过双向电泳结合Western杂交实验在分生组织样品中检测到26个NopA100的蛋白质斑点,而在非分生组织中只检测到7个蛋白质斑点。这表明,NopA100被磷酸化的程度与细胞核的活性相关,在细胞周期过程中NopA100可能被高度磷酸化。

5 拟南芥细胞核蛋白质组学

拟南芥(A.thaliana)是基因组背景清楚的模式植物,适用于细胞核蛋白质组学研究。Jones et al[6]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞细胞核表达的345种蛋白质中的416条磷酸化多肽,极大地丰富了细胞核磷酸化蛋白质数据库。其中一些蛋白质(如转录因子、染色质重塑蛋白质、RNA沉默组分和剪切体等)磷酸化位点是新鉴定到的。这些信息为进一步研究蛋白质翻译后修饰在植物细胞中mRNA的转录、可变剪切与沉默过程中的作用提供了重要线索。Calikowski et al[7]成功分离了拟南芥悬浮培养细胞的细胞核基质,并利用双向电泳技术分离得到300个核基质蛋白质斑点。他们鉴定到了36种核基质蛋白质,主要包括核仁蛋白质IMP4、Nop56、Nop58、纤维蛋白和核仁素等,也包括核糖体蛋白质、组蛋白去乙酰化酶、翻译起始因子、热激蛋白和DnaJ等。这些为深入研究核仁甲基化作用和核仁定位等生物学功能提供了重要信息。此外,Pendle et al[8]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞核仁中的217种蛋白质。他们对其中72种蛋白质进行了GFP融合蛋白表达,结果表明87%的蛋白质表现为核仁或核仁相关定位。他们还意外地发现6种外显子联接复合体(exonjunction complex)的组分,为深入研究植物细胞mRNA向细胞核外运输和无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay)提供了线索。

6 鹰嘴豆细胞核蛋白质组学

鹰嘴豆(C.arietinum)是豆科草本植物,也是重要的粮食作物。Pandey et al[9]利用双向电泳技术分离得到了鹰嘴豆幼苗细胞核中表达的600多个蛋白质斑点,并利用液相色谱结合质谱技术鉴定了150种蛋白质。其中,多数蛋白质参与信号转导和基因表达(占36%),以及DNA修复与转录(占17%)。这也是对基因组未知植物物种细胞核蛋白质组的首次报道。他们进一步分析了鹰嘴豆幼苗147种干旱胁迫应答细胞核蛋白质组的变化。这些蛋白质包括重要的调控蛋白质和功能蛋白质,如:各种分子伴侣,以及参与基因转录与复制、细胞信号转导、染色质重塑的蛋白质[10]。

7 大豆细胞核蛋白质组学

大豆(G.max)是重要的粮食作物和油料作物,由真菌(Phakopsora pachyrhizi)引起的大豆锈病对大豆产量有很大影响。Cooper et al[11]利用高通量液相色谱结合质谱技术比较了易染病大豆品种Williams 82与含有Rpp1抗性基因的Williams 82近等基因系叶片细胞核蛋白质组的差异。他们鉴定到了4 975种细胞核蛋白质,并发现其中847种蛋白质被磷酸化修饰,其中大量蛋白质是核调控蛋白质与转录因子。这些结果表明,真菌侵染会诱导细胞核蛋白质的表达与翻译后修饰。

8 展望

近年来的植物细胞核蛋白质组学研究为深入分析植物基因表达与调控机制提供了重要信息。但是由于受到蛋白质分离技术和质谱检测灵敏度的限制,对一些低丰度表达核蛋白质的鉴定仍然是植物细胞核蛋白质组学研究的瓶颈。今后,随着更多植物种类全基因组序列测定的完成,以及蛋白质分级与鉴定技术的完善,对更多物种细胞核蛋白质组进行研究将成为可能。同时,深入分析细胞核蛋白质的翻译后修饰与相互作用将为解析植物发育与环境应答的调控机制提供更重要的信息。

参考文献

[1]CALIKOWSKI T T,MEIER I.Isolation of nuclear proteins[M]//SANCHEZ-SERRANO J J,SALINAS J.Arabidopsis protocols:Methods in molecularbiology.Totowa New Jersey:Humana Press,2006:393-402.

[2]AKI T,YANAGISAWA S.Application of rice nuclear proteome analysisto the identification of evolutionarily conserved and glucose-responsivenuclear proteins[J].J Proteome Res,2009,8(8):3912-3924.

[3]CHOUDHARY M K,BASU D,DATTA A,et al.Dehydration-responsivenuclear proteome of rice(Oryza sativa L.)illustrates protein network,novel regulators of cellular adaptation,and evolutionary perspective[J].Mol Cell Proteomics,2009,8(7):1579-1598.

[4]ABDALLA K O,BAKER B,RAFUDEEN M S.Proteomic analysis ofnuclear proteins during dehydration of the resurrection plant Xerophytaviscose[J].Plant Growth Regul,2010(62):279-292.

[5]GONZALEZ-CAMACHO F,MEDINA F J.Identification of specific plantnucleolar phosphoproteins in a functional proteomic analysis[J].Proteo-mics,2004,4(2):407-417.

[6]JONES A M,MACLEAN D,STUDHOLME D J,et al.Phosphoproteomic analysis of nuclei-enriched fractions from Arabidopsis thaliana[J].JProteomics,2009,72(3):439-451.

[7]CALIKOWSKI T T,MEULIA T,MEIER I.A proteomic study of the Arabidopsis nuclear matrix[J].J Cell Biochem,2003,90(2):361-378.

[8]PENDLE A F,CLARK G P,BOON R,et al.Proteomic analysis of theArabidopsis nucleolus suggests novel nucleolar functions[J].Mol BiolCell,2005,16(1):260-269.

[9]PANDEY A,CHOUDHARY M K,BHUSHAN D,et al.The nuclearproteome of chickpea(Cicer arietinum L.)reveals predicted and unexp-ected proteins[J].J Proteome Res,2006,5(12):3301-3311.

[10]PANDEY A,CHAKRABORTY S,DATTA A,et al.Proteomics approachto identify dehydration responsive nuclear proteins from chickpea(Cicer arietinum L.)[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(1):88-107.

8.细胞核 篇八

一、生物膜与生物膜系统

生物膜：指细胞中的所有膜结构，包括细胞膜、核膜、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器，它们都由膜构成。这些膜的化学组成相似，即由脂类、糖类及蛋白质分子组成，基本结构大致相同，即基本骨架是磷脂双分子层，其中覆盖、贯穿或嵌着许多蛋白质分子，所以统称为生物膜。

生物膜系统：指细胞中的膜在结构和功能上紧密联系形成的结构体系。这些膜结构即细胞膜、核膜、内质网、高尔基体、线粒体等由膜围绕而成的细胞器，在结构和功能上是紧密联系的统一整体。例如细胞中分泌蛋白的合成和分泌过程需内质网、高尔基体、具膜小泡、细胞膜、线粒体等结构共同协调来完成，体现出这些相关结构既可各自独立进行多种化学反应，而又不会相互干扰，保证了细胞的生命活动高效、有序地进行。

二、植物组织培养与动物细胞培养

植物组织培养与动物细胞培养的区别在于：

（1）培养基成分不同。由于植物细胞和动物细胞的代谢类型不同，导致培养基的成分有所不同，培养条件也存在着差异。植物组织培养的培养基中包含有植物生长和发育所需要的全部营养成分，包括矿质元素（分为大量元素和微量元素）、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物，且多为固体培养基；动物细胞培养所用的培养基为液体培养基，培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。

（2）培养起点不同。植物组织培养可以是离体的器官、组织或细胞；动物细胞培养的起点是单个细胞，离体的组织或器官需用胰蛋白酶处理成为单个细胞，配成细胞悬浮液，这或许是二者在命名上有差异的原因。

（3）培养的结果不同。植物组织培养一般得到完整的植株，可用于植株快速繁殖、培养无病毒植株等；动物细胞培养一般得到细胞群，可获得所需的细胞或细胞的产物等。

三、原代培养和传代培养

原代培养：从动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织中取出组织，用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，将该悬浮液放入培养瓶中置于培养箱中培养，这个过程叫原代培养。原代培养也就是指对直接从有机体获取的细胞进行培养的过程。一般把第一代的细胞培养与传至第十代的细胞培养统称为原代培养。

传代培养：细胞在培养瓶中贴壁生长需定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这个过程叫传代培养。也就是将培养的细胞分散后从一个容器中取出，以1∶2或1∶3以上的比率移转到另一个或几个容器中进行培养。

四、细胞株和细胞系

细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡，只有极少数存活细胞能够继续分裂传到40~50代，这样的传代细胞称为细胞株。

细胞系：细胞株细胞至50代以后就不能再传下去了，但是有部分细胞，它们的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。

五、植物体细胞杂交和动物细胞融合

（1）原理不同。植物体细胞杂交的原理是细胞膜流动性和细胞的全能性，动物细胞融合的原理是细胞膜流动性。

（2）细胞融合过程不同。植物体细胞杂交过程是先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁后，再诱导原生质体融合；动物细胞融合过程应先使细胞分散后再诱导细胞融合。

（3）诱导融合手段上有差异。植物体细胞杂交诱导可用物理方法如离心、电刺激、振动，和化学方法如使用聚乙二醇等试剂；动物细胞融合除上述物理方法和化学方法外，一般还能以灭活的病毒诱导。