大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验

大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验

1.大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验 篇一

1 材料和方法

1.1 主要材料

SD大鼠由第四军医大学动物中心提供。胎牛血清,α- MEM培养液,CD29、CD90、CD34、CD45抗体,β- 磷酸甘油钠,维生素C,地塞米松,均购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs分离培养

2周龄雄性SD大鼠1 只,体重120 g,断颈处死,分离出四肢,用含有10%胎牛血清的α- MEM培养液冲洗骨髓腔收集骨髓细胞,在37 ℃、 5% CO2孵箱内培养,3 d后首次换液,7 d后细胞贴满培养瓶底部,倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.2 骨髓间充质干细胞鉴定

传代后,取第2 代生长良好的细胞,制备细胞悬液后,分别加入CD34、CD45、CD90、CD29大鼠抗体,FITC、PE标记,用流式细胞仪检测标记抗体阳性的细胞百分比。

1.2.3 成骨诱导分化及鉴定

将第2 代BMSCs接种于6 孔板,密度为2×104/孔。细胞贴壁后加入成骨诱导液(地塞米松10-8 mol/L + β-甘油磷酸钠10 mmol/L+抗坏血酸50 mg/L),在37 ℃、5% CO2孵箱内培养,每3 天换液1 次,于第21 天弃培养基,用茜素红进行矿化结节染色。

1.2.4 成脂诱导分化及鉴定

将第2 代BMSCs接种于6 孔板,密度为2×104/孔。待细胞贴壁后,加入成脂诱导液(1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L胰岛素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L 3- 异丁基- 1- 甲基黄嘌呤)继续培养,每2 d换液1 次,培养至14 d,弃培养液,在倒置相差显微镜下观察细胞质中脂滴状态并用油红O染色,检测细胞成脂情况。

1.2.5 MTT法细胞增殖活性的测定

将第2 代BMSCs接种于96 孔培养板,密度1×104/孔,每孔α- MEM培养基0.2 ml。于培养后第1、 3、 5、 7、 9 天,弃去上清液后,每孔加入200 μl浓度为0.2 mg/ml的MTT溶液(用α- MEM培养基配制),震荡混匀后继续培养4 h。再弃去上清液,每孔加入200 μl DMSO溶液,酶标仪上振荡10 min,用仅加培养基的空白孔调零,以560 nm为检测波长,检测每个孔的吸光度值(A)。

2 结 果

2.1 BMSC形态观察

刚分离出的原代细胞较小,呈圆形,不能与血细胞区分,3 d后首次换液,观察此时细胞明显变大并已贴壁生长。1 周后细胞已长满,呈梭形。经传代后细胞状态逐渐稳定(图 1)。

2.2 细胞增殖活性检测

MTT检测结果显示,所培养BMSCs在培养第3天起显示出很强的增殖活性,在培养1、3、5、7、9 d时的OD值分别为0.29±0.024、0.27±0.043、0.495±0.057、0.945±0.144、1.092±0.278。细胞倍增时间为36 h。

2.3 CD34、CD45、CD90、CD29表达检测

流式细胞仪检测P2代BMSCs CD90细胞计数阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34细胞计数阴性率为2.8%,CD45细胞计数阴性率为2.7%(图 2)。

a: CD90细胞计数阳性率为88.2%; b:CD29阳性率为98%; c: CD34细胞计数阴性率为2.8%; d: CD45细胞计数阴性率为2.7%

a: Expression of CD90(88.2%); b: Expression of CD29 (98%); c: Expression of CD34(2.8%); d: Expression of CD45(2.7%)

2.4 成骨诱导分化鉴定

P2代BMSCs成骨诱导21 d后,茜素红染色,显微镜下可明显观察到矿化结节形成(图 3a、b)。

2.5 成脂诱导分化鉴定

取P2代BMSCs加成脂诱导液诱导后,14 d弃培养液,油红O染色,显微镜下可见红色脂滴形成(图 3c)。

a、b: BMSCs成骨诱导21 d后矿化结节染色; c: BMSCs成脂诱导14 d油红O染色

a, b:Osteogenic induction for 21 d (Alizarin red staining); c:Adipogenic induction for 14 d (Oil red O staining)

3 讨 论

近年来,因牙周病引起的牙槽骨丧失在临床中越来越常见,修复阶段性骨缺损已成为临床中的难点,骨组织工程为这一难题的解决带来了新的希望。种子细胞、生长因子和生物支架是影响骨组织工程质量的三要素。在众多的种子细胞中,BMSCs以取材方便、免疫排斥反应低[3]、扩增能力强[4]、成骨潜能高等特点而成为研究的热点。Morishita[5]曾将骨髓基质干细胞接种于羟基磷灰石支架上,植入骨肿瘤切除后的缺损区,6 个月后使之得以修复。但需要注意的是:组织中的干细胞只有在特定的培养环境中才能转化为成骨细胞,且不同体外诱导条件、不同年龄来源的骨髓基质细胞在其成骨分化方面也存在差异[6]。本实验对大鼠BMSCs进行了体外培养及表面标志物与多向分化潜能的鉴定,为其进一步用于成骨实验研究乃至以后在动物体内的研究打下基础。

参考文献

[1]Jayadev S,Nochlin D,Poorkaj P,et al.Familial prion disease with alzheimer disease-like tau pathology and clinical phenotype[J].Ann Neurol,2011,69(4):712-720.

[2]Wirz S,Dietrich M,Flanagan TC,et al.Influence of PDGF-AB on tissue development in autologous platelet-rich plasma gels[J].Tissue Eng Part A,2011,17(13-14):1891-1899.

[3]Barry FP,Boynton BE,Haynesworth S,et al.The mono-clonal antibody SH-2,raised against human mesenchymal stem cells,recognizes an epitope on endoglin(CD105)[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,265(1):134-139.

[4]王荣,刘华松,孙正.BMSC-HA/TCP修复羟基磷灰石种植体周围骨缺损的实验研究[J].口腔医学研究,2007,23(6):620-623.

[5]Morishita Honoki K,Ohgushi H,et al.Tissue engineering approach to the treatment of bone tumors:Three cases of cul-tured bone g rafts derived from patients'mesenchymal stem cells[J].Artif Organs,2006,30(21):115-118.