内二案例分析（2篇）
1.内二案例分析 篇一
内二支部2014工作计划
2013年是我院三级医院创建后的关键之年，更是新华崇明分院提升内涵建设的重要一年。面对新起点，新目标，支部在医院党委的领导下，紧紧围绕医院中心工作，很好地完成上级布置的各项工作，同时做好支部的党员培养与发展工作。现就2014工作计划如下：
一、加强学习，不断提高党员的理论水平
强化理论学习和业务培训。坚持把学习作为提高党员素质的重要手段，支部委员带头学习，采取集中学习、个人自学、组织讨论等形式，认真组织学习党章、十八届中纪委二次会议精神，并有针对性地对党员学习情况进行了检查，使支部每一名党员能正确地领会精神实质，同时，加强专业知识的培训学习，并将理论与实践相结合，不断提高工作水平。
二、加强组织建设，充分发挥党员先锋模范作用
1、建立和落实支部党建工作责任制。支部委员结合支部实际，选定相关负责人，相关负责人具体抓，逐项抓，将支部党建工作开展的有声有色，支部为我院三级医院内涵建设努力工作，号召全体党员及先进分子为医院增收节支、节能减排尽自己最大的努力。
2、切实做到党建工作年初有计划、半年有检查、年终有总结，并做好了党建信息报送工作，全年按时向院党委报送党建信息稿件，调研文章，全面完成院党委下达的任务。
3、认真落实各项组织生活制度，定期组织学习，定期进行党性党纪教育，开展批评与自我批评，定期开展谈心活动，加强党员思想 1
互动，加强党员之间的沟通，增强了党支部的凝集力和战斗力，并积极培养发展新党员，为支部不断输送新鲜血液，同时配合党的中心工作，适应形势的变化和发展，不断结合自身工作特点，严格要求互相监督，提高全体党员的服务意识。
三、加强党员队伍建设，抓好创建“五好”党支部活动
把党员队伍的先进性体现好、保持好，是新时期推进党的建设的根本任务。支部着重把解决党员思想上入党和模范作用发挥为主要内容，坚持不懈地抓好党员队伍建设。
1、采取上党课和先进事迹教育、激励党员；切实增强接受监督意识，主动接受党组织和党员的监督，自觉的履行党内监督的职责，正确行使党内监督的各项权利。牢固树立共产主义理想，牢记党的宗旨，自觉经受住各种考验，保持党员本色。
2、提高党员的创造力、战斗力和凝聚力，认真制定了符合医院实际、内容具体、针对性强的“五好”党支部创建措施，党员集中培训工作。
3、把支部工作基础建设作为一项重点工作，强化支部工作落到实处，决不走过场。
四、加强党员廉政建设，开展党员自我承诺
发挥党员的先锋模范带头作用，提高服务质量，积极构建和谐的医患关系。充分发挥全体党员的积极性与主动性，在各自本职岗位上建功立业。严格用党员标准要求自己，自觉完成各项工作任务，切实发挥共产党员在医院各项工作中的先锋模范作用。
支部每一名党员进行了公开承诺。每名党员结合自己的实际工作，认真学习医疗机构从业行为规范，公开医疗服务承诺；并接受患者和广大群众的监督。通过开展党员承诺活动，使党员在患者面前亮身份、亮形象、亮作用，真正起到共产党员先锋模范带头作用。
五、围绕医院内涵建设，充分党支部堡垒作用
1、积极开展“激情科室”、“服务标兵”“感动人物”等四大评选活动，大力倡导爱岗敬业、无私奉献的精神，培育良好医院文化理念，促进医院和谐持续发展，增强职工的综合素质。
2、继续深入开展“创先争优”活动，提高党建工作的感染力和吸引力，进一步营造学先进、赶先进、做贡献、当表率的良好风气。
2013.10.28
2.内二案例分析 篇二
接头和药物三部分组成[3,4]。利用抗体对肿瘤细胞表面抗原的选择特异性, 对抗癌药物进行主动靶向设计研究, 可提高抗癌药物对肿瘤细胞的选择性, 降低其对正常器官的毒性[5,6], 抗体-药物偶联物能显著地提高抗体和药物的活性。
抗体分子含有很多可用来修饰交联的基团:氨基和羧基。氨基有赖氨酸ε氨基和N端α-氨基[7], 羧基有C-末端以及天门冬氨酸和谷氨酸残基。由于氨基和羧基在抗体和大部分蛋白中广泛存在, 偶联产物不均一, 且常常屏蔽抗原结合位点, 从而导致抗体药物偶联物活性的降低[8]。抗体分子独特的二硫键结构为抗体和药物的偶联提供了很好的选择。抗体内的链间二硫键只存在于特定的位置, 选择这些位置作为偶联位点, 可以很好的保留抗体的抗原结合位点。因此, 选用二硫键作为结合位点制备偶联药物的方法以及制备过程中的检测方法成为研究抗体药物偶联物的热点。
1 抗体的还原与检测
抗体二硫键的还原可以通过游离的或者固定的还原剂完成还原反应。根据还原二硫键位置及数量的不同, 抗体的还原形式有5种 (见图1a) 。其中1为抗体, 2, 3, 4, 5, 6为其5种形式。中间产物的形式也有5种, 见图1b。
游离的还原剂可以高效地还原蛋白中的二硫键, 甚至可以还原包裹在三级结构内部的二硫键。但是在还原反应结束之后, 必须通过脱盐柱Sephadex G-25去除这些还原剂[9]。游离的还原剂包括硫醇类和膦类。硫醇类如二硫苏糖醇、巯基乙醇等。这些还原试剂能有效地还原二硫键, 但不能在酸性条件下进行, 而且有时与肽段形成加合物, 使质谱图复杂。膦类如三正丁基膦 (TBP) 和三羧乙基膦TCEP) 。目前常用的试剂TCEP能在宽的pH范围下使用且反应温和、易溶、毒性小, 不与蛋白质中的其他功能基团反应。固定化的还原试剂有固定化TCEP二硫化物还原凝胶, 可以在更宽的pH值和温度范围以及在盐及去垢剂存在的条件下使用, 并且可以方便地从样品中去除。
药物偶联物研究领域的研究人员一致认为, 每个抗体分子上连接4个药物, 可以达到药效药代以及体内存活率最高[9]。由于ADC上的载药数量很大程度上取决于每个抗体还原后含有巯基的数目, 因此要有可靠的方法检测, 用以优化还原反应参数, 获得要达到所需巯基合适的还原反应条件。主要方法有Ellman试剂法[10], 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) [11], 毛细管电泳[12], 分子排阻色谱 (SEC) 分子排阻色谱-质谱联用 (SEC-MS) [13]。
1.1 Ellman试剂法
5, 5'二硫代双 (2-硝基苯甲酸) (DTNB) 为Ellman试剂。用于比色法测定生物样品中巯基。它易溶于水, 在巯基化合物的存在下, 无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。其中DTNB中可以添加1mol/L的EDTA, EDTA在反应混合物中的作用不只是保护疏基不致氧化, 而且也是为了防止某些金属离子影响颜色的进展。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412nm处具有最大吸收, 因此可以得到巯基数量。此种方法优点是能快速检测, 但是不能得到还原二硫键的位置以及还原过程的信息。
1.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
电泳是指溶液中带电离子在电场作用下发生迁移的电动现象, 也是一种在生化实验中经常使用的检测方法。在还原反应的不同时间段进行取样, 同时在取出的样品中加入0℃的pH偏酸的缓冲液进行终止反应。通过与未还原蛋白的对比, 可以判断抗体在还原剂还原的程度。通过与标准蛋白 (Marker) 的比对, 能够初步判断各个还原产物的量。通过用Tanon软件对洗脱后的凝胶进行扫描, 然后利用Tanon GIS分析软件分析凝胶图像。分析软件可以对各种还原反应产物进行光密度分析, 可以得到各个产物的百分含量, 然后根据每个产物上含有的巯基数量, 可以大致得到每个抗体上含有的平均巯基数量。这样还可以得到整个反应动力学过程, 对于优化实验条件提供了快捷简便的方法。
1.3 毛细管电泳
十二烷基硫酸钠毛细管电泳 (CE-SDS) 和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 相比, CE-SDS微量、快速、定量准确分离效率高, 操作方便和自动化, 并降低运营成本。另外, 对比经典的SDS-PAGE平板凝胶技术, CE-SDS不需要大量的有毒试剂[14,15]。检测采用Proteome Lab PA 800目标蛋白快速鉴定系统 (贝克曼-库尔特, 美国) 和未涂层熔融石英毛细管。进样时方法设置为:进样5kV, 20s;分离电压为15kV, 维持40min, 两端加压138KPa;电流25μA, 温度25℃;检测波长:220nm。待检测的抗体还原后产物在100μL缓冲液 (100mMTris-HCl, pH9.0, 1%SDS) 中, 浓度为1~2mg/mL。进样前, 在PA800电泳系统中加入2μL的10KDa标准蛋白。最后按照标准蛋白绘制相对分子质量-迁移率标准曲线, 根据曲线计算还原后各个产物的相对分子质量。CE-SDS可以检测在不同还原条件 (不同还原剂, 不同还原剂浓度, 反应时间和反应pH值以及温度) 下抗体还原后产物[16]。
1.4 分子排阻色谱-质谱联用 (SEC-MS)
分子排阻色谱 (SEC) 是以分子量和形状的差异为基础, 实现不同物质的分离。在尺寸排阻的分离介质中有大量不同孔径的网状孔道, 排阻极限以下的小分子物质可以进入颗粒内部的孔道, 排阻极限以上的大分子则不能进入孔道中。SEC已广泛用于检测抗体聚集体, 单体和片段。抗体的重链和轻链是由链间二硫键和很强的非共价键作用连接在一起的, 二硫键可以用还原剂还原断裂, 此时抗体并不是以重链, 轻链, 或者重链-轻链等游离在溶液中, 而是靠链间的非共价键维系的一个整体, 因此, 采用SEC检测时, 流动相中需要加入6mol/L盐酸胍或者6mol/L的脲对还原后的抗体变性使非共价键破裂[17]。但是高浓度的变性剂影响后面的质谱检测, 因此, 有研究表明采用含有乙腈, 三氟乙酸, 甲酸的流动相可以使通过SEC还原后的抗体轻链和重链分离, 并且允许耦合SEC到质谱仪获得直接的分子量测定。
分离色谱、质谱的联用技术结合了色谱高效的分离特性和质谱良好的检测性能, 一次分析可以得到大量的有用信息。Liu Hongcheng等[12]通过对TSKgel G3000SW, TSKgelG3000SWx, Shodex KW-804, Protein-Pak 300SW, BioSuite 250不同柱子的比较, 其中TSKgelG3000SW对轻链和重链的分辨率最高, 分离效果也很好。通过对流动相组成, 流速等的优化, 当流动相为超纯水中含20%乙腈, 0.1%TFA, 0.1%甲酸, 流速为0.2mL/min时, 检测效果达到最优。
2 抗体与药物偶联与纯化
抗体与药物的偶联反应很温和, 仅仅需要稍微过量的马来酰亚胺, 在pH7-8左右、0℃下反应1h。例如抗体被还原到平均每个抗体上有4个巯基, 通常可加入4~5倍的马来酰亚胺接头的药物, 反应30min。当药物的水溶性很好时, 药物加入到还原后的蛋白中然后混匀即可。当药物接头的水溶性很差, 需要适当的有机溶剂来溶解药物, 保证抗体和药物接头都是在溶液中, 整个反应都是在溶液中进行。通常采用二甲基甲酰胺 (DMF) 或者二甲基乙酰胺 (DMAC) 先将药物溶解, 然会与还原后的产物等体积反应。反应0.5h后, 通常是使用5倍的半胱氨酸或者N-乙酰半胱氨酸进行猝灭, 来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应。
药物接头的马来酰亚胺被猝灭后, 接下来就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂, EDTA等小分子。可以采用亲和层析, 凝胶过滤, 离子交换等色谱方法去除, 另一个方法是用离心超滤杯除去小分子并且将ADC置换到所需的缓冲液中, 但该种方法可能会使蛋白质吸附在膜上, 蛋白质的损失比较大。
3 药物载量测定
抗体与药物进行偶联后, 需要检测生成产物的均一性以及药物载量测定。方法主要有疏水层析 (HIC) 和反相高效液相色谱分析 (R-HPLC) 以及质谱分析[18,19,20]。下面主要介绍两种色谱分析法。
3.1 疏水层析
疏水层析是利用被分离样中不同生物分子表面的疏水性差别, 而将其分离纯化的一种层析技术。由于药物和药物接头通常比暴露在球状蛋白表面的残基 (包括抗体) 的疏水性强, 因此HIC对于分析连接有不同数量药物的ADC是非常有效的方法。抗体还原后的巯基是成对出现, 因此每个抗体上偶联的药物数量只能是0, 2, 4, 6, 8个, 分别记为D0, D2, D4, D6, D8。由于这种方法并没有变性, 因此, 即使是所有的链间二硫键完全被还原, D0, D2, D4, D6, D8仍然是完整的从柱子上依次洗脱下来, 这种方法不仅能够得到每个抗体偶联药物的平均数量, 还能够得到连接有不同数量药物的ADC分布, 整体的平均药物载量可以通过构成峰的积分面积和每个峰的药物载量作为加权因子来计算。
常用的色谱柱是用丁基-NPR 4.6×3.5mm, 粒径2.5μm的高性能生物大分子分离用疏水色谱分析柱, 方法是从100%A液 (1.5mol/L (NH4) 2SO4, 50mmol/L KHPO4, pH 7.0) 到100%B液 (25mmol/L KHPO4, pH 7.0+20%异丙醇) 12min。
3.2 反相高效液相色谱
反相色谱也是基于抗体载药量的不同来来分离的, 载药数量越高的ADC, 保留时间越长, 根本不同是反相色谱是在还原的条件下分离的, 此时抗体的重链轻链是分离的, 并没有共价结合为一体, 因此重链轻链是分别洗脱下来的。部分还原后偶联药物生成的药物偶联物是一个依靠链间的共价键结合在一起的复杂的混合物, 从该混合物中的物种衍生的反相色谱图很难解释, 所以这个方法的样品制备包括DTT处理的步骤, 以减少任何其它分子间的二硫化物。样品完全还原后, 所有的抗体以单独的链进行洗脱, 所有的重链轻链连有不同数量药物, 重链H, 轻链L, 重链连有1个药物H1, 依次类推, 产物有L0, L1, H0, H1, H2, H3分别计算出来, 这样, 结合每个抗体平均载药量以及抗体是由两条重链和两条轻链组成的基本知识, 每个载有不同药量的重链轻链可以分别被计算出来。
4 结论