大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究（共7篇）

1.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇一

【发布单位】国家食品药品监督管理局 【发布文号】国食药监注[2005]202号 【发布日期】2005-05-20 【生效日期】2005-07-01 【失效日期】 【所属类别】政策参考

【文件来源】国家食品药品监督管理局

应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）

(国食药监注[2005]202号)

根据《保健食品注册管理办法（试行）》，为规范、统一营养素补充剂等申报与审评行为，我局制定了《营养素补充剂申报与审评规定（试行）》、《真菌类保健食品申报与审评规定（试行）》、《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》、《核酸类保健食品申报与审评规定（试行）》、《野生动植物类保健食品申报与审评规定（试行）》、《氨基酸螯合物等保健食品申报与审评规定（试行）》、《应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）》、《保健食品申报与审评补充规定（试行）》8个与保健食品申报与审批相关的规定。上述规定于2005年7月1日起正式实施，现予以通告。

国家食品药品监督管理局

二○○五年五月二十日

应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）

第一条第一条 为规范应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品审评工作，确保保健食品的食用安全，根据《 中华人民共和国食品卫生法》和《 保健食品注册管理办法（试行）》，制定本规定。

第二条第二条 应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品是指产品生产过程中及原料生产过程中应用了大孔吸附树脂分离纯化工艺的保健食品。

第三条第三条 申请应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品除按照保健食品注册管理的有关规定提交资料外，还应提供以下资料：

（一）大孔吸附树脂的相关资料

1、大孔吸附树脂规格标准。标准内容应包括大孔吸附树脂名称、牌（型）号、结构、合成原料（主要原料、交联剂、致孔剂、分散剂等名称和规格）、外观、极性和粒径范围、含水量、湿密度、干密度、比表面积、孔径、孔隙率、孔容等，并提供大孔吸附树脂标准级别等。

2、大孔吸附树脂使用说明书。使用说明书的内容应包括：

（1）大孔吸附树脂性能简介、适用范围、主要原料和添加剂种类与名称；

（2）残留物（包括未聚单体、交联剂、主要添加剂）及其残留量检测方法和限量标准及依据；

（3）使用方法和注意事项，包括新大孔吸附树脂的预处理方法、再生处理方法和操作注意事项、贮存条件等，以及可能出现异常情况的处理方法。

3、生产批号、生产时间、产品检验报告书。

4、相关证明文件。大孔吸附树脂生产企业的企业名称、地址、电话、营业执照及相关生产许可证件的复印件等。

（二）应用大孔吸附树脂进行分离纯化的制备工艺研究资料

1、制备工艺中应用大孔吸附树脂进行分离纯化的目的与依据。详细说明应用大孔吸附树脂进行分离、纯化的目的和必要性，并提供相关研究或文献资料。

2、大孔吸附树脂的预处理方法和合格标准。预处理方法包括考察预处理溶剂的种类、用量、浸泡时间、流速、温度、pH值等工艺参数和操作规程。

3、生产工艺的研究资料。大孔吸附树脂型号的选择、比上柱量、比吸附量、比洗脱量、树脂柱的径-高比、提取液的适宜上柱温度、pH及流速、解吸附溶剂及其条件的选择、解吸附终点判定方法等研究资料，并将上述资料作为该产品的生产工艺的一部分。

4、大孔吸附树脂再生方法的确定。大孔吸附树脂经使用后，吸附能力下降，应进行再生处理。根据功效成分和大孔吸附树脂的理化性质，制订大孔吸附树脂再生处理方法及其合格标准，申请人应制定相应的标准、操作规程并列入企业标准的附录。

（三）使用以大孔吸附树脂分离纯化工艺制造的原料生产的保健食品，申请时还应提供原料生产企业的详细资料，原料的制备工艺和详细的质量标准，包括原料中大孔吸附树脂残留物的标准和检测报告。申请人应提供由国家食品药品监督管理局确定的检验机构出具的该原料大孔吸附树脂残留物的检验报告。

（四）大孔吸附树脂及其纯化工艺等安全性评价资料

第四条应用苯乙烯骨架型树脂分离纯化工艺的保健食品应符合以下要求：

（一）大孔吸附树脂应用前应进行预处理，预处理以后的大孔吸附树脂中的有机残留物应控制在安全范围内，对苯乙烯骨架型树脂要求苯的残留量小于2mg/kg、二乙烯苯小于20 mg/kg。对其它类型的大孔吸附树脂，根据具体情况确定限量标准。

（二）一般情况下,不得使用再生后的比吸附量仍下降达30%以上时的大孔吸附树脂。

（三）应用以大孔吸附树脂分离纯化工艺生产保健食品原料的生产企业，应当对原料的大孔吸附树脂残留物进行检验或复核。对用苯乙烯骨架型树脂制备的原料中二乙烯苯含量要求为小于50μg/kg，并将此列入企业标准。如果原料质量达到上述标准的，可以免测该保健食品终产品的大孔吸附树脂残留物的含量。

（四）建立树脂残留物的检测方法和标准，并列入企业标准。

（五）对保健食品生产过程中应用苯乙烯骨架型树脂分离纯化工艺的保健食品，其产品中二乙烯苯含量要求为小于50 μg/kg。

第五条第五条 其它类型的大孔吸附树脂参照苯乙烯骨架型并结合具体品种制定相应的残留物及残留标准等内容。

第六条第六条 原则上不得以多个动植物原料混合后再应用大孔吸附树脂纯化工艺生产保健食品。

第七条第七条 必要时，国家食品药品监督管理局可对大孔吸附树脂生产企业和应用大孔吸附树脂生产保健食品所用原料的企业进行现场核查。

第八条第八条 本规定由国家食品药品监督管理局负责解释。

第九条第九条 本规定自二○○五年七月一日起实施。以往发布有关规定与本规定不一致的，以本规定为准。

本内容来源于政府官方网站，如需引用，请以正式文件为准。

2.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇二

大孔吸附树脂是一种多孔性的高分子材料, 具有多孔性和较大的比表面积, 因此具有良好的吸附性能, 尤其在纯化中药化学成分或天然产物活性成分方面具有极大优势[8], 不同型号的树脂由于本身性质的差异而影响纯化的效果。该研究首先通过考察7种不同型号大孔吸附树脂对千斤拔总黄酮的静态吸附与解析性能, 筛选出适合分离千斤拔总黄酮的大孔树脂, 然后探索了该大孔吸附树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺条件, 拟为千斤拔总黄酮在医药工业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

千斤拔购于安徽省亳州市华申药业有限公司, 经吉林大学药学院王广树教授鉴定为豆科植物蔓性千斤拔的根, 大孔脂D101、AB-8、LSA-21、XDA-6、XDA-8、LSA-7、LSA-19购于西安蓝晓科技有限公司, 芦丁对照品 (批号:MUST-12122003) 纯度≥98%, 购于成都曼斯特生物科技有限公司, 甲醇为色谱纯, 购于天津大茂化学试剂厂, 其它试剂均为分析纯。

TU-1810PC型紫外分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任有限公司) 、R-52AA型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂) 、SHA-B型水浴恒温振荡器 (常州国华电器有限公司) 、SHZ-D型循环水真空泵 (河南巩义市英峪仪器厂) 、DHZ-9075型电热鼓风干燥箱 (上海一恒科学仪器有限公司) 、AUY220型电子天平 (日本岛津) 、BS50-1A型恒流泵 (保定思诺流体科技有限公司) 、PHS-2C型酸度计 (上海精密科学仪器厂) 和CBS-B型自动部分收集器 (上海沪西分析仪器厂) 。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备

称取适量千斤拔药材, 粉碎, 过40目筛, 依次加入15倍量70%乙醇回流提取, 提取3次, 每次2h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压回收乙醇至无醇味, 浓缩液加水稀释, 静置, 滤去不溶性物质, 将滤液以蒸馏水定容, 即得千斤拔供试品溶液。

1.2.2 标准曲线的建立

精密称取芦丁对照品 (105℃干燥至恒重) 5.0 mg于50 mL容量瓶中, 以65%乙醇超声溶解, 稀释至刻度, 摇匀得对照品溶液 (0.1mg·mL-1) 。精密吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mL, 分别置于25mL容量瓶中, 分别加5%亚硝酸钠0.3mL, 摇匀, 放置6min, 加入10%硝酸铝溶液0.3mL, 摇匀, 放置10 min, 加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液1.0mL, 用65%乙醇定容, 摇匀, 静置20min后, 以相应溶剂为空白对照液, 采用分光光度法在510nm处测吸光度A[9], 以吸光度A为纵坐标, 质量浓度C为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程:A=11.87C-0.015 6, R=0.999 6, 表明吸光度与浓度在0.008~0.048 mg·mL-1范围内线性关系良好。

1.2.3 总黄酮纯度的测定

定量取上样液或洗脱液, 按1.2.2方法测定吸光度, 计算总黄酮质量浓度, 将该样品液真空干燥后得固体干膏[10]。按公式 (1) 计算总黄酮纯度P。

其中:P为固体干膏中总黄酮的纯度;CS为样品溶液中总黄酮的浓度 (mg·mL-1) ;VS为样品溶液体积 (mL) ;MS为固体干膏的质量 (mg) 。

1.2.4 树脂的预处理

分别取试验用7种型号的树脂, 用95%乙醇浸泡过夜, 倾去漂浮物后湿法装柱, 用95%乙醇以1BV流速通过树脂层, 洗至流出液按1∶2体积比加蒸馏水不变浑浊为止, 用蒸馏水以同样流速洗至树脂无醇味为止, 树脂以蒸馏水浸泡备用。

1.2.5 树脂的筛选

分别以比吸附量和解析率为考察指标, 进行树脂型号的筛选。称取预处理好的树脂D101、AB-8、LSA-21、XDA-6、XDA-8、LSA-7、LSA-19各2.0g, 加入到100mL具塞三角瓶中, 加入总黄酮质量浓度为1.57mg·mL-1的千斤拔总黄酮提取液40mL, 25℃恒温水浴振荡24 h, 过滤, 分别吸取各树脂吸附后的溶液1.0mL置于50mL容量瓶中, 65%乙醇定容, 按1.2.2方法测定吸光度, 按公式 (2) 计算各树脂的吸附量[11];将过滤后各型号树脂表面用滤纸吸干, 以100mL 95%乙醇进行解析, 25℃恒温水浴振荡24h, 过滤, 分别吸取各树脂解析后的溶液2.0mL置于50mL容量瓶中, 以65%乙醇定容, 按1.2.2方法测定吸光度, 按公式 (3) 计算各树脂的解析率。7种树脂在相同条件下, 经过24h的静态吸附及解析, 求得静态比吸附量和解析率。

其中:A为比吸附量 (mg·g-1) ;C0为千斤拔总黄酮样品液中总黄酮的质量浓度 (mg·mL-1) ;C1为吸附24h后千斤拔总黄酮样品液中总黄酮的质量浓度 (mg·mL-1) ;V0为千斤拔总黄酮样品液体积 (mL) ;V1=V0;W为称取树脂质量 (g) 。

1.2.6 吸附条件的选择

一般认为影响吸附效率的主要因素有上柱液浓度、pH、流速及吸附温度等, 该试验主要考察上样液浓度、pH、流速对吸附的影响, 并绘制动态吸附曲线 (泄漏曲线) , 最终确定最佳吸附条件。

1) 上样液质量浓度对吸附的影响。取不同质量浓度的千斤拔总黄酮上样液 (3.207 2、1.603 6、0.801 8、0.534 5、0.320 7mg·mL-1) 以1.5 mL·min-1的流速分别连续通过装柱体积为30mL的AB-8树脂柱 (20mm×300mm) 进行动态吸附, 利用自动部分收集器收集流出液, 用紫外分光光度法检测。

2) 上样液pH对吸附的影响。取质量浓度为1.603 6mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液6份, 每份100mL, 分别调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0, 以1.5 mL·min-1的流速分别通过装柱体积为30 mL的AB-8树脂柱 (20 mm×300mm) , 进行动态吸附, 利用自动部分收集器收集流出液, 用紫外分光光度法检测。

3) 上样液流速对吸附的影响。取pH 5.0, 质量浓度为1.603 6mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液100 mL, 分别以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL·min-1的流速分别通过装柱体积为30mL的AB-8树脂柱 (20mm×300mm) , 进行动态吸附, 利用自动部分收集器收集流出液, 采用紫外分光光度法检测。

4) 动态吸附曲线的确定。按所确定的吸附条件, pH5.0, 质量浓度为1.603 6mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液, 以2.0mL·min-1的流速通过装柱体积为30 mL的AB-8树脂柱 (20 mm×300mm) , 利用自动部分收集器收集流出液, 采用紫外分光光度法对流出液进行检测[12]。

1.2.7 解析条件的选择

分别对影响解析的洗脱剂浓度和洗脱剂流速进行考察, 绘制洗脱曲线, 最终确定最佳解析条件。

1) 洗脱剂浓度的选择。取千斤拔总黄酮质量浓度为1.603 6mg·mL-1的上样液100 mL, 以2.0mL·min-1流速通过装柱体积为30 mL的AB-8大孔吸附树脂柱 (20 mm×300 mm) , 进行动态吸附, 吸附完全后, 依次用蒸馏水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇各210mL以1.5mL·min-1流速进行梯度洗脱, 利用自动部分收集器收集各部分洗脱液, 紫外分光光度法测定吸光度, 计算洗脱率[13]。

2) 洗脱流速的确定。取已处理好的AB-8型大孔树脂5份, 湿法装柱 (20mm×300mm) , 控制柱体积为30mL, 各加入pH为5.0, 质量浓度为1.603 6 mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液100mL, 以2.0mL·min-1的流速通过树脂柱, 进行动态吸附, 吸附饱和后, 先用蒸馏水洗至流出液无色, 再用210 mL 30%乙醇洗至无色, 最后用210mL 70%乙醇溶液分别以1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL·min-1的流速进行洗脱, 利用自动部分收集器收集洗脱液, 用紫外分光光度法进行检测, 计算各洗脱流速下的洗脱率。

3) 洗脱曲线的确定。按所确定的吸附和解析条件, 取千斤拔总黄酮上样液 (总黄酮质量浓度为1.603 6mg·mL-1) 240mL, 调节溶液pH至5.0, 以2.0mL·min-1流速通过装有柱体积约为30mL的AB-8大孔吸附树脂柱 (20mm×300mm) , 进行动态吸附, 吸附饱和后, 先用蒸馏水洗至无色, 再用30%乙醇洗至无色, 后用70%乙醇以1.5mL·min-1流速进行充分洗脱, 利用自动部分收集器收集洗脱液, 测定其中总黄酮含量, 绘制洗脱曲线图。

1.2.8 验证试验

取上样液质量浓度相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1的上样液240mL, 调节pH5.0, 以2.0mL·min-1流速连续通过装柱体积为30 mL的AB-8大孔吸附树脂柱 (20mm×300mm) , 吸附平衡后, 先用蒸馏水洗至无色, 再用30%乙醇洗至无色, 后用210mL的70%乙醇以1.5mL·min-1流速进行充分洗脱, 收集洗脱液, 减压浓缩回收溶剂, 水浴蒸干, 真空干燥得干浸膏, 称重, 按1.2.2方法测定吸光度, 计算浸膏中总黄酮纯度。结果表明上样液制成的膏状物中千斤拔总黄酮含量为31.26%, 而经大孔树脂分离纯化后的洗脱液制成的膏状物中千斤拔总黄酮含量为65.78%。

2 结果与分析

2.1 树脂的筛选

从表1可知, 7种不同型号树脂对千斤拔总黄酮的吸附能力差异很大, 其中对千斤拔总黄酮比吸附量最高的树脂是LSA-21, 其次为AB-8型树脂, XDA-6型树脂的比吸附量最低;而由解析率测定结果可以看出, LSA-21型大孔树脂的解析率只有62.39%, 小于AB-8型大孔树脂的93.65%, 综合考虑选择AB-8型大孔树脂进行千斤拔总黄酮的分离纯化。

2.2 吸附条件的选择

2.2.1 上样液质量浓度对吸附量的影响

从图1可以看出, 树脂的吸附量随上样浓度增大呈现先增大后减小的趋势, 当上样液浓度为1.603 6mg·mL-1时, 树脂的吸附量达到最大, 上样液浓度继续增大, 树脂的吸附量反而降低, 可能是由于上样液浓度过大导致树脂泄漏加快, 因此最佳上样液浓度选择1.603 6 mg·mL-1, 相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1。

2.2.2 上样液pH对吸附量的影响

由图2可知, 当上样液pH为5.0时, 树脂的吸附量最大;pH>5时, 吸附量随pH增大而逐渐减小, 可能是由于黄酮类化合物分子上的酚羟基逐渐与溶液中的OH-反应形成离子, 从而不容易被树脂吸附;pH<5时, 吸附量随pH减小而降低, 可能是由于溶液酸性太强, 黄酮类化合物容易转化成佯盐而不易被树脂吸附, 因此适当的酸性环境有利于千斤拔总黄酮化合物的吸附, 故选定上样液pH为5.0。

2.2.3 上样液流速对吸附率的影响

由图3可知, 随着上样液流速的增大, 总黄酮的吸附率降低, 主要原因是树脂的泄漏随上样液流速增大而加快;但如果流速过慢, 工作效率大大降低。因此, 在保证目标成分被充分吸附的同时兼顾工作效率, 确定2.0mL·min-1为最佳上样液流速。

2.2.4 动态吸附曲线的确定

从图4可以看出, 30mL AB-8树脂可处理3BV柱体积, 即90mL的千斤拔总黄酮上样液而不发生泄漏。此时树脂床共吸附千斤拔总黄酮144.3mg, 湿态AB-8大孔吸附树脂对千斤拔总黄酮的吸附量为4.81mg·mL-1。树脂床达到吸附饱和时可处理8BV, 即240mL的千斤拔总黄酮上样液, 湿态饱和吸附量为12.83mg·mL-1。

2.3 洗脱条件的选择

2.3.1 洗脱剂浓度的选择

从图5可知, 水洗的洗脱率为3.7%, 各浓度乙醇洗的洗脱率分别为0.5%、2.38%、25.7%、64.69%和0.83%。因此, 蒸馏水和低浓度的乙醇只能将少量千斤拔总黄酮洗脱下来, 而浓度为50%和70%的乙醇洗脱完后, 总洗脱率可以达到90%以上, 故选用70%乙醇作为最佳洗脱剂。

2.3.2 洗脱流速的确定

由图6可知, 洗脱率随洗脱流速增大呈现逐渐减小的趋势, 可能是因为洗脱流速太大, 洗脱剂分子来不及与被吸附物质分子相互作用就已流出色谱柱;但流速太慢, 工作效率低, 综合考虑, 最佳洗脱流速选择1.5mL·min-1。

2.3.3 洗脱曲线的确定

从图7可以看出, 当洗脱液体积达到7BV柱体积, 即210mL时, 基本能把树脂吸附的千斤拔总黄酮洗脱完全。

2.4 工艺验证试验结果

为了验证上述工艺的稳定性, 进行3次验证性。试验结果表明, 采用AB-8大孔树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺条件为:上样液质量浓度相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1, 最大上样量为12.83mg·mL-1, 上样液pH5.0, 上样流速为2.0mL·min-1, 洗脱液乙醇体积分数为70%, 洗脱剂用量为7BV, 洗脱流速为1.5mL·min-1。

3 结论

3.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇三

关键词：苦皮藤种素C；HP20大孔树脂；纯化；HPLC

中图分类号： O657.7+2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0246-02

苦皮藤（Celastrus angulatus）为卫矛科南蛇藤属植物，别称苦树皮、马断肠等，广泛分布于陕西省、河南省、湖北省等地[1]。苦皮藤的根、茎、叶、果实、种子是天然的杀虫剂，同时也是重要的中药资源，民间用其根皮、茎皮、树叶防治蔬菜及各种作物虫害已有相当长的历史[2]。研究表明，苦皮藤种子中所含的主要杀虫活性成分为4-H-β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物，其中苦皮藤种素C（angulateoid C）是杀虫活性成分之一[3-4]，其结构如图1所示。

[FK（W9][TPWMJ1.tif]

苦皮藤种油对黄守瓜、菜粉蝶等多种害虫具有拒食作用，对赤拟谷盗等储粮害虫有较强的忌避作用，对玉米象有明显的致死、杀卵作用。大孔吸附树脂的比表面积较大，吸附性能良好，经不同极性的洗脱剂洗脱可以达到分离纯化化合物的目的，具有设备简单、操作方便、易于再生、产品纯度高等优点，特别适合天然产物的分离纯化[5-8]。本研究采用大孔树脂法分离纯化苦皮藤种素C，旨在为开发利用苦皮藤资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，0.5 μm）；CP214型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；SHA-C型水浴恒温振荡器（常州冠军仪器制造有限公司）；HP20型大孔树脂、SP825型大孔树脂均购自日本三菱化学公司；AB-8型大孔树脂、D101型大孔树脂均购自天津市光复精细化工研究所；甲醇，色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；乙醇，医用纯（新乡市三伟消毒制剂有限公司）。

苦皮藤种素C标准品（笔者所在实验室自制）；苦皮藤种子采自湖北省恩施土家族苗族自治州，经河南农业大学朱长山教授鉴定。

1.2 方法

1.2.1 HPLC色谱条件

采用高效液相色谱法检测苦皮藤种素C含量，色谱流动相：甲醇-水（80 ∶20）；检测波长：232 nm；柱温：25 ℃；流速：2.0 mL/min；进样量：10 μL。

1.2.2 标准品溶液的制备

精密称取苦皮藤种素C标准品10.0 mg，用甲醇定容至50 mL，摇匀后得苦皮藤种素C标准品溶液。

1.2.3 标准曲线绘制

精密量取上述标准品溶液0.05、0.50、1.00、2.50、5.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别取以上溶液及标准品溶液10 μL注入液相色谱仪中，在波长232 nm处测定峰面积。以溶液浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程：y=12 377x-5 305.5，r=0.999 9，线性范围为1～200 μg/mL，检出限为05 μg/mL（S/N=3），平均加样回收率为105.8%，RSD为1.31%。

1.2.4 上样液制备 称取苦皮藤种子2 500 g，粉碎，于 80 ℃ 水浴中以石油醚为溶剂回流提取3次，3次所加石油醚的体积分别是种子质量的3、2、2倍，抽滤、合并滤液，60 ℃ 下减压浓缩，除去溶剂得苦皮藤种油834.5 g。

2 结果与分析

以苦皮藤种素C的含量、浸膏得率为指标，对大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的工艺条件进行优化。考察上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等因素对HP20大孔吸附树脂分离纯化苦皮藤种素C效果的影响。

2.1 大孔树脂型号的选择

取6.0 g上样液，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C的浓度。取预处理过的HP20、AB-8、SP825、D101树脂各5.0 g置于锥形瓶中，各加入6.0 g上样液，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，吸附平衡后，过滤、减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度。在达到吸附平衡的树脂中加入50 mL 95%乙醇，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，进行解吸。达到解吸平衡后，过滤，用30 mL 95%乙醇洗涤，合并洗涤液、滤液，减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度，结果见表1。吸附率（q）及解吸率（E）计算公式如下：

结果表明，HP20型大孔吸附树脂对苦皮藤种素C具有较好的吸附作用且容易被洗脱，故选用HP20型大孔树脂进行研究。

2.2 最佳上样量

取4份预处理好的HP20型大孔树脂各50.0 g装柱，分别按树脂与药材质量比为1 ∶1.8、1 ∶3.0、1 ∶4.2、1 ∶5.4比例上样。在洗脱速度相同的条件下，先用40倍柱体积40%乙醇洗脱，除去部分杂质，再用90倍柱体积 60%乙醇洗脱，并将60%乙醇洗脱液减压蒸干，HPLC分析苦皮藤种素C含量。以苦皮藤种素C含量、浸膏得率为考察指标，确定最佳上样量，结果见表2。

3 结论与讨论

本研究表明，HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的最佳工艺为：按树脂与药材质量比为1 ∶3.0上样，先用40倍柱体积40%的乙醇洗脱，再用90倍柱体积60%的乙醇洗脱。苦皮藤种素C为苦皮藤种子的主要活性成分，因此分离纯化苦皮藤种子中的苦皮藤种素C具有重要意义。采用HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C方法简单可行，能较好地纯化苦皮藤种素C，可作为工业上富集纯化苦皮藤种素C的一种方法。

参考文献：

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志：第45卷第3分册[M]. 北京：科学出版社，1999：102.

[2]柯治国，南玉生，卢令娴. 植源昆虫拒食剂苦皮藤的研究进展[J]. 武汉植物学研究，1993，11（3）：265-271.

[3]Cheng C Q，Wu D G，Liu J K . Angulatueoids A-D，four sesquiterpenes from the seeds of celastrus angulatus[J]. Phytochemistry，1992，31（8）：2777-2780.

[4]王国亮，南 蓬，龚复俊，等. 新倍半萜酯——苦皮藤酯1的结构鉴定[J]. 科学通报，1990（15）：1156-1158.

[5]徐 耀.不同型號大孔吸附树脂对草珊瑚黄酮的富集作用[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：262-265.

[6]张 旭，王锦玉，仝 燕，等. 大孔树脂技术在中药提取纯化中的应用及展望[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：286-290.

[7]孙 健，岳瑞雪，钮福祥，等. 紫甘薯花青素的大孔树脂动态吸附工艺优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：227-229.

[8]李 华，赵振贵，李 丹，等. 大孔树脂对大豆异黄酮的吸附性能研究[J]. 郑州大学学报：工学版，2011，32（2）：19-22.

4.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇四

关键词：银杏外种皮,黄酮类化合物,大孔吸附树脂,分离,纯化

银杏是我国特有树种[1],也是世界上珍贵的药用植物资源。其果实俗称白果,为常用中药之一。银杏外种皮是银杏果仁的皮层,即种子硬壳外面的肉质皮层,俗称白果衣胞[2]。银杏外种皮化学成分主要有黄酮类化合物,银杏内酯类等。其中黄酮类化合物可用于治疗脑及周身动脉的血动力学障碍,可以活化动脉、静脉及微血管[3]。目前分离纯化银杏黄酮的方法主要是萃取法、硅胶柱层析法、大孔吸附树脂法。萃取法得率低,故很少使用。硅胶柱层析法由于硅胶不能重复使用,主要用来分离纯品。大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,广泛应用于中草药化学成分的分离与富集。根据树脂的孔径、比表面积、结构、极性的差异,大孔吸附树脂分为许多类型[4]。本文采用价格较低,可以再生,选择吸附性较好的大孔吸附树脂对银杏外种皮黄酮类化合物进行分离纯化研究。

1 资料

银杏外种皮,采自贵州省贵阳市乌当区杨昌镇;芦丁对照品,中国药检所;大孔吸附树脂(NKA、NKA-2、NKA-9、X-5、AB-8、H103、D3520、D4020),天津南开大学化工厂;大孔吸附树脂(DM-130),山东鲁抗医药集团股份有限公司;UNICO UV-2000型紫外-可见分光光度计,上海丽度电子科技发展有限公司;RE-25型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;MET-TLER-AE240型电子天平,瑞士梅特勒公司;康氏电动振动仪,北京通县医疗器械厂;LABCONCO冷冻真空干燥器,上海泽权仪器设备有限公司。

2 方法

2.1 银杏外种皮黄酮类化合物浸出液的制备

银杏外种皮晒干、粉碎,在70℃,7倍体积的60%乙醇(W/V)条件下,回流提取4次,1 h/次;合并提取液,用旋转蒸发仪在50℃减压浓缩,备用。

2.2 柱层析

层析柱尺寸:φ55×800 mm,将处理好的树脂湿法装柱,装柱高度600 mm。把浸出液配制成黄酮浓度为2.5 mg/ml左右的70%的乙醇溶液,过滤,上样。先用水洗至流出液无色,换用90%乙醇洗脱,用量为4~5倍树脂体积,收集洗脱液,浓缩至无乙醇味后,冷冻干燥得产品。

2.3 银杏外种皮黄酮类化合物测定方法

采用分光光度法,以芦丁为标准品,准确配制0.13 mg/ml的芦丁70%乙醇标准液,分别精确量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 ml标准液置10 ml具塞试管中,蒸馏水为空白,加30%乙醇(V/V)至5ml,先加5%NaNO20.3 ml(W/V),摇匀,放置6 min,再加10%Al(NO3)30.3 ml(W/V),摇匀,再放置6 min,加4%NaOH 4 ml(W/V),各试管用蒸馏水稀释至10 ml,室温放置15~20 min,在波长510 nm处测定吸光度[5]。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的绘制

芦丁浓度Y(mg/ml)与吸光度A,用最小二乘法作线性回归,得线性方程:Y=0.09896A+0.00182,r=0.9997。

3.2 树脂吸附量的测定

称取处理好的树脂9份,每份5g,于100 ml具塞磨口三角瓶中,加入银杏外种皮黄酮提取液各30 ml,(70%乙醇配制,浓度为2.47 mg/ml)置电动振荡仪上振荡,振荡频率为243次/min。振荡20 h,充分吸附后,滤过,测定滤液中剩余黄酮浓度,按下式计算各树脂室温下的吸附量(mg/g),结果见表1。

式中Q为吸附量,C0为起始浓度,CR剩余浓度,V为溶液体积,W为树脂重量。

从表1可见,大孔吸附树脂X-5,AB-8,DM-130在所给的实验条件下对黄酮类化合物有较大的吸附量。

3.3 静态解吸率的测定

吸附树脂在分离纯化方面的应用是利用吸附的可逆性(即解吸),由于树脂极性不同,吸附作用力强弱不同,解吸难易亦不同。因此,吸附量及解吸率的测定是树脂筛选的重要环节。

根据3.2的实验结果,选择对黄酮类化合物吸附量较大的树脂,每种树脂称3份,5 g/份,按照3.2方法充分吸附后,滤出树脂,风干,分别在滤出的树脂中加入30%乙醇,50%乙醇,70%乙醇,90%乙醇各30 ml,浸泡振摇10 h,过滤,测定滤液黄酮浓度,再根据吸附量,计算解吸率(%)

结果表明:90%乙醇较易将吸附于树脂上的黄酮解吸下来,其中树脂DM-130的解吸率超过90%。

3.4 不同浓度乙醇的洗脱结果

称取处理好的DM-130树脂9份,30 g/份装入层析柱中,量取银杏果外种皮提取液20ml,(黄酮浓度2.63 mg/ml),上柱,分别用10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇进行洗脱,洗脱液流速为2 ml/min,至流出液无色,收集洗脱液,浓缩,定容至50 ml,分光光度法测定其中黄酮类化合物的含量。

由上图可以看出:90%乙醇洗脱率最高。

上述实验结果表明:DM-130大孔吸附树脂对银杏外种皮黄酮类化合物的吸附量和解吸率在所考察树脂中都是最好的,吸附量为6.59 mg/g,静态及动态解吸率均为90%以上。由此确定DM-130树脂为银杏外种皮黄酮类化合物分离纯化树脂,并对影响分离纯化的相关因素作进一步研究。

3.5 影响树脂吸附-解吸的因素

3.5.1 温度对吸附的影响

称取处理好的DM-130树脂5份,5 g/份,于100 ml具塞磨口三角瓶中,加入银杏外种皮黄酮提取液各30 ml(浓度为2.47 mg/ml),分别在30℃,40℃,50℃,60℃,70℃的水浴中回流加热2 h,每隔10 min振摇30s。加热后,过滤,用70%乙醇定容至50 ml,测定滤液黄酮浓度。

结果表明:随着温度的增高,树脂的吸附量随之增加。

3.5.2 p H对吸附的影响

称取处理好的DM-130树脂5份,5 g/份,于100 ml具塞磨口三角瓶中,加入银杏果外种皮黄酮提取液各30 ml(浓度为2.47 mg/ml),用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl将各个三角瓶中的提取液分别调至相应的p H值,置电动振荡仪上振荡,振荡20 h,充分吸附后,滤过,测定滤液中剩余黄酮浓度,计算各树脂在不同pH下的吸附量(mg/g)。

结果表明:碱性环境下,树脂对银杏外种皮黄酮的吸附量优于酸性环境。

3.5.3 洗脱剂用量对解吸的影响

称取处理好的DM-130大孔吸附树脂30 g,装柱,银杏外种皮黄酮类化合物提取液20 ml(浓度2.63 mg/ml),洗脱剂流速为2 ml/min,收集洗脱液,浓缩,检测其中黄酮类化合物的含量。

结果表明:当洗脱剂用量为4倍树脂体积时,解吸率已达到90.25%,增加洗脱剂的用量,洗脱率没有显著增加。因此在洗脱过程中,洗脱剂用量应为4~5倍树脂体积。

3.5.4 洗脱速度对解吸的影响

称取处理好的DM-130大孔吸附树脂5份,30 g/份,装柱,银杏果外种皮黄酮类化合物提取液20 ml(2.63 mg/ml),分别以1 ml/min、2 ml/min、3ml/min、4 ml/min、5 ml/min的速度进行洗脱,洗脱完毕后,收集洗脱液,浓缩,检测其中黄酮类化合物的含量。

结果表明:当洗脱速度为2 ml/min时,洗脱率最高。

3.5.5 分离纯化后的产品

将浓度为2.46 mg/ml的黄酮类化合物样品液100 ml,上样,用DM-130树脂纯化,先用水洗,再用90%乙醇洗脱,浓缩90%乙醇洗脱液,至无乙醇味,冷冻真空干燥器中充分干燥后,得产品,结果见表2。

4 结论

我国是银杏大国,目前研究主要集中在银杏叶上,银杏外种皮的开发研究刚刚起步,深度和广度还远远不够。本实验考察了用大孔吸附树脂分离、纯化银杏外种皮黄酮类化合物的可行性及其相关影响因素,为银杏外种皮黄酮类化合物分离纯化的工业化生产提供参考路线。实验结果表明:采用DM-130作为纯化树脂,先用水洗,再用90%乙醇洗脱,用量为4~5倍树脂体积,洗脱液浓缩干燥后的产品中黄酮类化合物的含量为25.87%,产品收率为2.68%。

参考文献

[1]吴梅林,周春山,钟世安,等.大孔吸附树脂纯化银杏活性化合物的工艺研究.中南药学,2005,3(2):75-77.

[2]唐于平,楼凤昌,王欢,等.银杏果外种皮的化学成分和药理作用.药学进展,2000,24(3):152-155.

[3]卢元芳,宫霞.银杏叶黄酮类化合物的提取和药理作用.曲阜师范大学学报,1999,25(3):95-96.

[4]李月,陈莹.大孔吸附树脂分离纯化银杏叶总黄酮的研究.化学与生物工程,2009,26(7):55-57.

5.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇五

1 仪器与试剂 (原料、药材)

1.1 仪器:

HH-4数显恒温水浴锅;RE-52A型旋转蒸发器;UV-3010型紫外可见分光光度计 (日本东芝公司) ;CP225D型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)

1.2 试药:

乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等, 均为分析纯。

1.3 药材:

菊花:购于安徽亳州药材市场, 经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为正品。

1.4 对照品:

芦丁对照品中国药品生物制品检定所供含量测定用批号:2010-0821

2 方法与结果

2.1 树脂静态吸附考察:

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品适量, 置100mL容量瓶中, 加60%乙醇溶解, 定容, 即得0.23mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的确定

精密吸取芦丁对照品溶液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、15mL, 分别置25mL容量瓶中, 加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀, 放置6min, 加入10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀, 放置6min, 加入4%氢氧化钠溶液4mL摇匀, 放置15min, 用60%乙醇稀释至刻度。以1号作为空白, 510nm处测吸收度, 绘制标准曲线, 计算回归方程为Y=0.2066X+0.0048, r=0.9996.可知芦丁含量在0.23mg-3.45mg范围内, 与吸光度之间呈现良好的线性关系[1,2,3,4]。

2.1.3 药物的提取

称取菊花300g, 以60%乙醇为溶剂, 提取3次, 每次2小时, 合并提取液, 回收乙醇, 定容至600mL。

2.1.5 最大吸附率的测定

称取经预处理的各型号树脂, 各约4g (抽滤至干) , 分别加入50mL药液, 密闭放置。分别于0、1、2、3、6、12、24、36、48小时吸取2mL药液, 置25mL容量瓶中, 按2.1.2方法显色, 在510nm处测定吸光度值, 计算最大吸附率。结果见表1

结果可见, 大孔吸附树脂D101、AB-8的吸附率较高。

2.2 树脂解吸率测定

将完成静态吸附的树脂与药液分离, 用水淋洗一次, 置具塞三角瓶中, 各加入60%乙醇50mL, 静置, 分别在0、1、2、3、6、12、24、36、48小时取样2mL液, 置25mL容量瓶中, 按2.1.2方法显色, 在510nm处测定吸收度, 计算各树脂的解吸率, 结果见表2。

通过实验结果分析可见, 在相同条件下, 大孔吸附树脂D101对菊花总黄酮的解吸率较高。

2.3 树脂的选择

通过实验所得数据, 选用吸附率、解吸率均较高的D101作为对菊花总黄酮进行纯化分离的树脂。

3 讨论与结论

3.1 讨论

静态吸附并不能完全确定生产过程中的具体参数, 还需要通过动态吸附试验来进行参数的确定, 通过静态试验, 完成的是树脂种类的选择, 具体参数的确定还需要在今后实验中通过动态吸附考察来完成。

3.2 结论

通过实验结果显示, D101大孔吸附树脂用于对菊花提取物中总黄酮的纯化, 其静态吸附率和静态解吸率均高于其它树脂, 应用于菊花中总黄酮的纯化分离, 可以减少黄酮的损失。

摘要：目的 本实验主要对菊花中总黄酮的大孔树脂纯化工艺进行研究, 从5种不同的大孔树脂中筛选分离纯化菊花总黄酮的最佳树脂。方法 以菊花中总黄酮的静态吸附参数为指标, 确定最优的大孔吸附树脂。结果 经过各种指标研究, 发现D-101型树脂对菊花总黄酮的吸附率、解吸率均好于其他树脂。结论 D-101型大孔吸附树脂法能有效地分离纯化菊花中的总黄酮。

关键词：菊花,总黄酮,大孔吸附树脂

参考文献

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[3]程文明, 汪燕燕.大孔吸附树脂法纯化野菊花总黄酮[J].安徽医科大学学报, 2006, 41 (4) :406-409.

6.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇六

1.1 仪器

Agilent高效液相色谱仪:包括化学工作站, VWD检测器, ZORBAX SB-C18 (5μm, 4.6×250mm) 色谱柱;梅特勒电子天平。

1.2 试剂

甲醇为色谱纯 (美国天地公司) , 其余为分析醇。

1.3 对照品

阿魏酸对照品由中国药品制品检定所提供。

1.4 药材

当归购于甘肃岷县, 为道地药材, 经鉴定为当归Angelica sinensis (Dliv.) Diels的干燥根。

1.5 大孔吸附树脂

购于天津南开大学化工厂。

2 色谱条件

Z O R B A X S B-C 1 8 (5μm, 4.6×250mm) 色谱柱;柱温:30℃;流动相:甲醇∶0.05%冰醋酸 (40∶60) ;检测波长:320nm;流速:0.6ml/min。

3 实验方法

3.1 树脂的前处理

取市售大孔吸附树脂, 用乙醇加热回流提取洗脱, 洗至洗脱液蒸干后无残留。经乙醇洗净的树脂保存备用。以乙醇湿法装柱。继续用乙醇在柱上流动清洗, 不时检查流出的乙醇, 至与水混合不呈白色混浊为止 (取1ml乙醇液加2ml蒸馏水) 。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇, 洗至流出液Molish反应呈阴性, 备用。少量乙醇的残留将会大大降低树脂的吸附能力。

3.2 不同树脂比吸附量 (absorbtion ratio) 的测定

精密量取当归提取液75ml (每ml含生药1g) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0.5ml/min, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 再用95%的乙醇洗脱, 洗脱至流出液无色为止。结果见表1, AB-8型大孔吸附树脂具有较大比吸附量, 性能优于其他几种树脂。故选择弱极性树脂AB-8作为当归总酚酸吸附纯化的树脂。

3.3 A B-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸吸附, 分离相关参数的研究

3.3.1 比上柱量 (saturation ratio) 的测定

精密量取当归提取液50ml (1g生药/ml) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0.5ml/min, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 测定其比上柱量。比上柱量是所用树脂达吸附终点时, 单位质量干树脂吸附夹带成分的总和, 即S= (M上-M残) /M。经测定, AB-8型大孔

吸附树脂对当归总酚酸 (以阿魏酸计) 的比上柱量为5.60, RSD=3.40%。

3.3.2 比吸附量 (absorbtion ratio) 的测定

上述树脂用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 测定其比吸附量。比吸附量是单位质量干树脂吸附成分的总和。即A= (M上-M残-M水) /M。经测定, AB-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸 (以阿魏酸计) 的比吸附量为3.88, RSD=3.99%。

3.3.3 洗脱溶媒的选择

取AB-8型大孔吸附树脂7克, 湿法上柱, 平行制备7份, 分别经过前处理, 根据吸附容量, 精密吸取当归提取液 (1g生药/ml, 含阿魏酸0.8439mg/ml) 上柱, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性, 分别用30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%的乙醇洗脱, 测定其中阿魏酸的含量。

另当归提取物每ml含固形物0.5373g, 经过计算, 其纯度为0.158%。结果显示30%乙醇洗脱液所得样品中, 阿魏酸纯度为9.60%, 相对含量最高, 故确定洗脱溶媒为30%的乙醇溶液。当归提取物经过AB-8大孔吸附树脂的吸附、洗脱后, 在固形物含量降低的同时, 纯度呈显著性提高。

3.3.4 洗脱累积率的测定

取AB-8型大孔吸附树脂7克, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 (每ml含1克生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 刚开始连续收集50ml洗脱液, 以后分段收集, 每50ml收集一次, 累计收集350ml。计算各部分洗脱液中阿魏酸的含量, 测定结果可知, 用30%乙醇液洗脱, 收集150ml洗脱液, 99.23%的指标成分已从树脂上解吸下来, 即洗脱体积为9BV。

3.3.5 比洗脱量 (Eluation ratio) 的测定

取AB-8型大孔吸附树脂, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 (每ml含1克生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 收集洗脱液200ml (终点) , 计算其比洗脱量。比洗脱量是吸附达饱和后, 用一定浓度的乙醇洗脱至终点, 单位质量干树脂洗脱成分的质量, 即E=M醇/M。经测定, 比洗脱量为3.16, RSD=2.69%。

3.3.6 不同浓度的当归提取物对AB-8树脂吸附性能的影响

原液浓度会直接影响到AB-8树脂吸附性能。故用不同浓度的当归提取物上柱, 考察其比吸附量及解吸率, 为选择适宜的上样浓度提供依据。定量加入已知含量的当归提取物, 以2BV/1小时的流速上样吸附洗脱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 再用30%乙醇液洗脱至终点。经试验, 虽然上样浓度高, 比吸附量也随之增加, 但解吸率显著降低, 有效成分不能被完全洗脱下来。因此选择当归药液浓度为1.0g/ml为宜。

3.4 讨论

3.4.1 不同类型树脂对同一成分有不同程度的吸附, 同一型号树脂对多种成分也有不同程度的吸附。为了使树脂法成功地应用于生产, 除选用分离介质, 还要配合最佳的工艺条件, 如药液的预处理, 浓度, PH, 吸附和解吸附的速度, 洗脱剂的选用。同一成分, 所用的大孔树脂的型号不同, 其吸附性能有很大的差异, 故富集纯化不同的成分对大孔树脂的选择很有必要。

3.4.2 当归提取物在没有上柱分离之前, 阿魏酸的含量仅为0.9%, 结果大孔吸附树脂富集纯化, 纯度提高到9.6%。

3.4.3 一般情况下, 纯化同一种药物的大孔树脂, 当其吸附量下降30%以上时, 应视为不宜再用。故应该积累树脂再生的研究数据, 建立合理的树脂再生方法及再生合格标准, 使不同批次产品的纯化效果稳定并能节约成本。

摘要：目的:选择适宜的大孔吸附树脂来纯化当归中酚酸类成分, 并优选其相关参数。方法:采用HPLC法, 测定阿魏酸的含量。结果:选择AB-8型大孔树脂作为当归酚酸类成分吸附纯化的树脂。结论:AB-8型大孔树脂对当归酚酸类成分吸附及洗脱参数为:比上柱量=5.6, 比吸附量=3.88, 比洗脱量=3.66, 洗脱溶媒为30%的乙醇, 洗脱体积为9VB。

7.大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇七

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪 (美国沃特世公司) ;AS20500A型超声波清洗器 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司) ;TGL-18C-C型高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;CPA225D型电子分析天平 (德国sartorius公司) ;Lichrospher C18 (250 mm×4.6 mm, 5µm) (江苏汉邦科技有限公司) ;SHB-Ⅲ真空泵 (郑州长城科工有限公司) ;UV-1100红外分光光度计 (上海美普达仪器公司) 。

1.2 试剂及药品

北五味子 (安徽万生中药饮片有限公司) ;五味子醇甲 (批号:110857-201010, 中国药品生物制品检定所) ;五味子甲素 (批号:110857-201010, 中国药品生物制品检定所) ;五味子乙素 (批号:110765-200710, 中国药品生物制品检定所) ;甲醇 (分析纯, 江苏汉邦科技有限公司) ;乙腈 (色谱纯, 美国Tedia公司) ;磷酸 (分析纯, 南京化学试剂有限公司) ;纯净水 (娃哈哈集团) ;AB-8型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) ;D101型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) ;X-5型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) ;HPD100型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) 。

2 实验方法和结果

2.1 三种五味子木脂素的HPLC分析方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Lichrospher C18 (250 mm×4.6 mm, 5µm) , 柱温35℃, 进样量10µl, 体积流量为1.00 ml/min, 波长检测λ=254 nm, 流动相为A (乙腈) -B (水) , 梯度洗脱程序见表1。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2. 1 提取液的制备

取干燥的五味子适量, 用8倍药材量30%乙醇浸泡过夜, 滤过, 滤液弃去, 生药残渣干燥, 粉碎成粗粉, 干燥, 称重。用75%乙醇回流提取3次, 第1次加入4倍量提取3 h, 第2次2倍量2 h, 第3次3倍量1 h, 合并提取液, 放置48 h, 弃去沉淀, 虹吸上清液, 减压回收乙醇得稠状物, 再加2倍粗粉量95%乙醇, 摇匀, 静置24 h, 滤过, 收集滤液即得五味子提取液。将醇提液回收乙醇后, 取3等份, 分别加水稀释成药材浓度为0.128、0.064、0.032 g/ml的药液, 备用。

2.1.2. 2 混合标准品溶液制备

精密称取标准品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素适量, 置于25 ml的容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 即得含五味子醇甲281.6µg/ml、五味子甲素264.0µg/ml、五味子乙素493.6µg/ml的混合标准品溶液, 备用。

2.1.2. 3 供试品的制备

取上述提取液适量, 加倍量甲醇, 摇匀, 14000 rpm离心10 min, 取上清液微孔滤膜 (0.45µm) 滤过, 备用。

2.1.3 系统适应性考察

取混合标准品溶液和供试品溶液按上述色谱条件注入色谱仪, 结果色谱图见图1和图2。

注:1:五味子醇甲, 2:五味子甲素, 3:五味子乙素

注:1:五味子醇甲, 2:五味子甲素, 3:五味子乙素

2.1.4 标准曲线的绘制

精密吸取2.1.2.2项下混合标准品溶液5 ml, 置10 ml量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀。以此法等比例配制后续溶液。分别吸取各浓度溶液10µl, 按2.1.1色谱条件, 进样测定。以质量浓度 (X) 对峰面积 (Y) 进行线性回归, 得到三条标准曲线, 结果见表2, 三种成分在各自浓度范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度

精密吸取同一浓度的混合标准品溶液10µl, 按2.1.1色谱条件, 连续进样6次, 积分三种成分的面积, 分别记录五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的面积, RSD (n=6) 分别为1.05%、1.15%、1.20%。该测定方法的精密度良好。

2.1.6 稳定性

精密吸取同一供试品溶液分别于0、2、4、6、12、24 h进样10µl, 在2. 1.1色谱条件下测定各成分的峰面积, 计算各成分峰面积的RSD (n=6) , 结果为五味子醇甲0.46%、五味子甲素0.44%、五味子乙素0.078%。结果表明供试品溶液中上述三种成分在室温条件下24 h内稳定。

2.1.7 重复性

按2.1.2.3制备方法制备成供试品溶液, 平行6份。在2.1.1色谱条件下分别进样10µl测定, 以峰面积代入回归方程计算三种成分质量浓度, 并计算各成分质量浓度的RSD (n=6) , 结果为五味子醇甲0.94%、五味子甲素1.14%、五味子乙素1.68%。表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收

精密吸取已知含量的供试品适量置于10 ml容量瓶中, 再加入含五味子醇甲281.6µg/ml、五味子甲素264.0µg/ml、五味子乙素493.6µg/ml的混合标准品溶液5 ml, 加甲醇至刻度, 按2.1.2.3方法制备成供试品溶液, 平行6份, 即得。精密吸取上述溶液10µl, 按2.1.1色谱条件进样测定, 计算各成分回收率和RSD, 结果见表3。

2.2 大孔树脂的纯化工艺考察

2.2.1 大孔树脂的前处理

称取一定量的大孔树脂AB-8、D101、X-5、HPD100, 置于适量体积的95%乙醇浸泡24 h (乙醇没过树脂即可) , 过滤, 置于玻璃层析柱内, 用95%的乙醇洗涤, 直到洗涤液加水无浑浊为止。再改用蒸馏水洗涤, 至洗涤液没有醇味, 取出树脂, 抽滤干, 密封保存于4℃冰箱内, 备用。

2.2.2 大孔吸附树脂的筛选

2.2.2. 1 取AB-8、X-5、D101、HPD100四种树脂各5 g于相同的玻璃层析柱中, 取已知浓度的提取液60 ml, 上样流速1 ml/min, 残留液定容到50 ml, 再用50 ml的水冲洗柱子, 测定残留液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量 (水洗液中未检测出三种成分) 结果见图3。

2.2.2. 2 取上述已吸附有五味子木脂素的树脂, 用95%的乙醇冲洗, 直到冲洗液中检测不到五味子醇甲、甲素、乙素为止, 合并醇洗液, 测定洗脱液中所含醇甲、乙素、甲素的解吸量, 结果见图4。四种树脂对三种成分都能达到较好的吸附, 对五味子乙素的吸附呈现出较大差异, 以AB-8的吸附最高, 故考虑选择AB-8作为纯化木脂素的树脂。

2.2.3 上样工艺考察

2.2.3. 1 上样浓度考察

取AB-8树脂5 g 3份, 分别置于相同的层析柱中, 再取浓度分别为0.128、0.064、0.032 g/ml的药液, 以1 ml/min的流速上样, 每5 ml收集流出液, 检测三种成分, 直到检测出三种成分为止, 记录上样液体积, 计算三种成分的上样量, 结果见图5。三种上样浓度之间没有较大的差异, 考虑到上样时间及未来工业生产, 选择0.128 g/ml为最佳上样浓度, 开展后续研究。

2.2.3. 2 上样流速考察

取AB-8树脂5 g 3份, 分别置于相同的层析柱中, 取浓度为0.128 g/ml的药液60 ml, 分别以1、2、3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml的水冲洗柱子, 检测残留液与水洗液中三者成分的量, 三种成分的上样量结果见图6。上样流速之间没有较大差别, 考虑到上样时间, 选取3 ml/min作为最终上样流速。

2.2.3. 3 径高比考察

取AB-8树脂5 g 3份, 分别置于不同粗细的层析柱中, 形成径高比为1∶9、1∶3.5、1∶2的层析柱, 取0.128 g/ml的药液60 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水冲洗柱子, 检测残留液和水洗液, 三种成分的上样量结果见图7。径高比为1∶9和1∶3.5时差异较小, 但当径高比为1∶2时, 柱子的吸附量减少。故选择1∶9或1∶3.5最为最佳径高比。

2.2.4 泄露曲线的绘制

取AB-8树脂5 g置于层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液适量, 以3 ml/min的流速上样, 残留液每20 ml收集1次, 检测三种成分的含量, 以残留液体积为横坐标, 以残留液中三种成分的质量浓度与上样药液中质量浓度的百分比为纵坐标绘制泄露曲线, 结果见图8。

2.2.5 洗脱工艺考察

2.2.5. 1 洗脱浓度考察

取AB-8树脂5 g置于层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液40 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水洗柱, 分别用95%、80%、60%的乙醇适量, 流速为1 ml/min洗脱, 每20 ml收集1次洗脱液, 检测三种成分的含量, 直到检测不到为止, 合并洗脱液, 检测三种成分的总量, 并各取50 ml洗脱液蒸干, 测定固形物的量, 再用10 ml甲醇溶解固形物, 并测定固形物中三种成分含量, 结果见图9。洗脱液所用乙醇浓度之间有差异, 选取95%的醇浓度为最佳。

2.2.5. 2 脱流速考察

取AB-8树脂5 g 3份置于相同的层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液40 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水洗柱, 用95%乙醇适量, 流速分别为1、2、3 ml/min洗脱, 每20 ml收集1次洗脱液, 检测三种成分的含量, 直到检测不到为止, 合并洗脱液, 检测三种成分的总量, 并各取50 ml洗脱液蒸干, 测定固形物的量, 再用10 ml甲醇溶解固形物, 并测定固形物中三种成分含量, 结果见图10。洗脱流速以1 ml/min为最佳, 但三者差异较小, 考虑到洗脱时间, 选择3 ml/min。

2.2.6 洗脱曲线的绘制

取AB-8树脂5 g置于层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液40 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水洗柱, 用95%乙醇适量, 流速分别为3 ml/min洗脱, 每20 ml收集1次洗脱液, 检测三种成分的含量, 直到检测不到为止, 以洗脱液体积为横坐标, 三种成分的质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线, 结果见图11。95%的乙醇洗脱液洗脱至200 ml时能将三种成分完全洗脱。

2.2.7 大孔吸附树脂纯化工艺的验证

按照上述实验结果, 最终确定最佳纯化工艺为:以AB-8树脂, 上样液体积与树脂用量的比例为40 ml∶5 g, 上样浓度为0.128 mg/ml, 流速为3 ml/min, 径高比为1∶3以上;洗脱乙醇浓度为95%, 洗脱流速为3 ml/min。按照上述上样工艺和洗脱工艺平行3份, 验证所选工艺。结果见图12。工艺平行性较好, 能得到较好的验证。

2.3 提取液纯化前后HPLC色谱图的对比研究

取20 ml提取液和相对提取液的过柱滤液置于蒸发皿中蒸干, 测定固形物的含量, 再取20 ml的甲醇溶解, 取适量按2.1.1的色谱条件进样, 得到色谱图13。过柱前后HPLC的色谱峰没有增减, 所选6种木脂素的转移率都能达到75%以上, 在固形物中的含量由99.58 mg/g上升到299.11 mg/g, 占固形物含量的30%。固形物中醇甲、甲素、乙素转移率为80%, 固形物中乙素含量为80 mg/g, 固形物得率:4.8 g/100 g药材。以上数据显示选用AB-8大孔吸附树脂纯化五味子提取液合理。

2.4 大孔树脂纯化固形物中总木脂素的含量测定

2.4.1 标准曲线绘制

采用紫外分光光度法测定, 准确称取适量五味子乙素标准品于10 ml容量瓶中, 用甲醇定容, 取0.1 ml甲醇作为空白样, 依次取0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ml五味子乙素标准溶液, 挥去甲醇, 再分别精密加入5%变色酸澄清水溶液0.5 ml、硫酸1.5 ml、水1 ml摇匀, 置沸水浴中加热30 min后, 迅速冷却, 以上述甲醇管为空白, 分别在488 nm波长处测定吸光度, 计算含量, 以五味子乙素含量为横坐标 (X) , 以吸光度为纵坐标 (Y) 绘制标准曲线, 得回归方程Y=12.51X-0.100, r2=0.988。

2.4.2 木脂素含量测定

取适量纯化液3等份分别置于蒸发皿中蒸干, 用甲醇溶解, 置于容量瓶中, 再加甲醇定容到一定量, 精密吸取适量置于EP管中, 挥干甲醇, 按2.4.1试剂的加入方法和测定方法, 测定固形物中总木脂素的含量。结果见表4。

3 讨论

3.1 本文选取三种木脂素作为大孔树脂纯化五味子木脂素的纯化工艺指标, 是因为首先这三种成分的极性在木脂素中位于高中低的位置, 能最大程度的代表木脂素成分的富集, 再者, 这三种成分在木脂素中含量大, 在临床上的疗效更为广泛确切, 没有选择总木脂素作为指标, 因为显色反应条件不稳定, 误差大, 红外测定精密度差[4,5,6,7,8,9]。

3.2 AB-8大孔吸附树脂最适用于从极性溶剂中吸附弱极性物质。五味子中的木脂素成分大多具有联苯环辛二烯母核, 是一类低极性小分子化合物[10]。用AB-8来纯化能达到很好的分离效果。

3.3 由于木脂素为难溶性有效部位, 浓度过大会形成混悬液, 导致上样量难以控制, 堵塞大孔树脂[11,12,13]。所以在上样浓度的考察时, 结合预实验选择上述的三种浓度。上样流速间没有明显的差异, 考虑到上样时间和工业生产, 选择最大的流速。

3.4 通过对比纯化前后的色谱图, 作者发现6种木脂素的转移率都在75%以上, 固形物量减少两倍, 总木脂素的量占固形物的64%。结果表明大孔树脂纯化能达到精致富集木脂素类成分的目的。可用于五味子药材入药的前处理。

本文建立了同时测定固形物中6种木脂素的方法, 为五味子固形物质量控制提供依据。选择五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素作为大孔树脂纯化的指标, 最后确定了纯化工艺为:AB-8树脂纯化, 上样药液浓度0.128 g/ml, 流速3 ml/min, 径高比1∶3以上, 95%乙醇洗脱。对纯化前后的固形物进行含量测定和分析, 确定AB-8纯化五味子木脂素的科学合理性。

摘要：目的 建立五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的高效液相色谱法 (HPLC) 分析方法 , 以此为指标成分, 利用大孔树脂纯化五味子醇提液, 筛选纯化五味子木脂素的最佳树脂及纯化的最佳工艺。对纯化前后HPLC色谱图进行比较, 并测定五味子总木脂素的含量。方法 动态上样法比较各种树脂对三种成分的吸附及解吸量来筛选最佳纯化树脂, 通过测定三种成分的上样量和洗脱量来考察最佳上样工艺及洗脱工艺, 对比纯化前后HPLC色谱图来研究纯化合理性, 利用紫外分光光度法来测定纯化后五味子总木脂素的含量。结果 最佳纯化树脂为AB-8, 上样药液浓度0.128 g/ml, 流速3 ml/min, 径高比1∶3以上, 95%乙醇洗脱。对比HPLC色谱图发现, 纯化前后色谱峰并无减少。木脂素含量测定结果显示纯化后五味子木脂素的含量占固形物60%以上。结论 纯化合理且必要, 并且工艺简单实用, 可用于工业生产。