干细胞培养技术

干细胞培养技术（精选16篇）

1.干细胞培养技术 篇一

大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化

目的:建立海马神经细胞原代培养技术.方法:取新生1～3d的Wistar大鼠,开颅,迅速分离出海马组织在Hanks中剪碎,加入0.125%胰蛋白酶2mL消化,胎牛血清终止消化,细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的`6孔培养板中.结果:神经细胞存活率高,纯度达90%以上,神经细胞生长良好.结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞.

作 者：张金波 王淑秋 朱金玲 罗佳滨 张淑红 金岳雷 ZHANG Jin-bo WANG Shu-qiu ZHU Jin-ling LUO Jia-bin MA Xiao-ru JIN Yue-lei 作者单位：佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007刊 名：黑龙江医药科学英文刊名：HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARMACY年，卷(期)：200932(4)分类号：Q421 R388关键词：海马神经细胞 原代培养 胰蛋白酶

2.干细胞培养技术 篇二

动物细胞培养技术在生物、医学等研究领域都有着广泛的应用, 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。动物细胞的生长除了要给细胞组织提供一个无菌、恒温的环境, 还要给予充分的营养。动物细胞培养技术有着很大潜力的开放空间, 前景光明, 但是它同时也面临着技术方面的诸多问题和挑战。本文将通过分析细胞喂养技术取得的进展, 探讨动物细胞培养存在的问题以及动物细胞未来的发展方向, 从而建立并筛选出合适的细胞系培养方法。

1 动物细胞培养的基本概念

细胞培养指的是从体内组织取出细胞, 并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境, 给予充分营养, 使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段, 也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后, 由于受群体环境影响, 需要转移到另一个容器, 这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话, 则表示传代成功, 这些细胞称为细胞系或细胞株。

2 动物细胞培养技术的内容

2.1 体外培养动物细胞的生物学特性

动物细胞没有细胞壁结构, 机械强度低, 对剪切力较为敏感, 因此无法很好地适应体外环境。此外, 在体外进行培养的细胞失去了神经体液调节以及细胞间相互影响等作用, 她们不仅失去原有组织结构, 还不易保持原有细胞形态, 处于缺乏动态平衡的生活环境中, 分化能力也降低, 直至发展成为恶性细胞。因此, 在体外进行动物细胞培养应密切关注体外细胞的状态, 生长环境提供的条件是否适宜生存, 有无被微生物感染等。

2.2 细胞培养所需环境

(1) 无菌无毒环境无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代谢物质影响的难题, 因此, 在进行体外细胞培养时, 要及时清除细胞产生的代谢废物, 确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。

(2) 气体环境气体主要是O2和CO2, O2可以给细胞提供能量, 而CO2不仅是细胞增殖所需的物质, 也是其自身的代谢产物, 此外, CO2还有着调节培养基p H的作用。

(3) 温度适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长, 若温度超出适宜温度范围, 不仅会影响到细胞的正常代谢, 损伤细胞, 甚至会使其致死。

(4) 缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液, 提供水分和无机盐, 维持细胞的正常代谢。

(5) 培养基培养基分为天然培养基和合成培养基两种, 它是细胞生长繁殖的直接环境, 为细胞提供所需的营养。天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。动物细胞培养主要用的是合成培养基。合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质, 有特殊要求的还会添加适量血清。

2.3 细胞培养方式

(1) 贴壁培养对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。一般这样的细胞需贴附于不起化学作用的物质的表面生长, 最终在表面生长至单层, 当整个平面被铺满时, 细胞会出现接触抑制的现象。

(2) 悬浮培养悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面, 细胞可悬浮于液体培养基, 并大量增殖。因此, 悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。

(3) 固定化培养无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。固定化培养属于包埋培养方式, 目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。固定化培养不仅剪切力较低, 传递效果较好, 而且还易于收集并分离纯化细胞产物。用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力, 细胞生长较为集中, 生长密度也高。

3 动物细胞培养存在的问题及展望

近一个世纪以来, 动物细胞培养技术经过研究人员的不断开发, 已经有了很大的进步。但是, 目前的技术水平还无法彻底满足细胞生物制品开发和生产的要求。首先, 由于动物细胞培养的技术和方法还不太成熟, 细胞的成活率和利用率较低, 从而造成动物细胞技术效率较低的现象发生。其次, 在进行较长时间、较大规模的细胞培养中, 工作人员无法排除细胞代谢产物对自身的影响, 且细胞群体的生理机能也会在这个过程中受到影响, 一般会表现出分泌和代谢能力的降低甚至丧失。此外, 动物细胞培养技术所用的培养设备和培养用微载体耗费昂贵, 导致研究成本增加, 限制了我国大规模开展动物细胞培养的工程。

4 总结

动物细胞培养技术在未来的发展方向应将重点放在优化细胞环境, 改进细胞特性等方面上, 最终达到提高生物制品的产率和产量, 扩大生产规模的效果。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。在不久的将来, 许多生物实验材料和工业化生产都需要动物细胞培养技术来开展自身的研发工作。

参考文献

[1]顾芸, 等.壁虎脊髓细胞的原代培养及形态学观察[J].南通大学学报 (医学版) .2007, 1.

[2]郑鑫, 等.中国林蛙输卵管上皮细胞的培养及其生物学特性研究[J].食品科学.2006, 5.

3.干细胞培养的器官和组织 篇三

诱导多能干细胞只是干细胞的一种，但是，可以绕开使用胚胎干细胞的伦理限制，而且具有丰富的来源，因此被视为再生医学和器官移植的重要突破。此后，研究人员就希望能用诱导多能干细胞在实验室中培养和生成各种器官、组织和细胞，用以治疗更多疾病。现在，研究人员发现，诱导多能干细胞确实能培养并生成有生理功能的多种器官、组织和细胞。

诱导多能干细胞培育出肝脏

英国《自然》杂志2013年7月3日报道，日本横滨市立大学谷口英树研究小组与美国西奈山医学院研究人员合作，利用人类诱导多能干细胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠体内，结果这些肝芽成功生长成微型人类肝脏或称“迷你肝脏”，并像健康器官一样具有正常的肝功能。这是世界上首例用诱导多能干细胞培养的立体肝脏。在此之前，已经有研究小组能够用诱导多能干细胞培养出肝细胞，但是还不能培养出可以在人体内发挥功能的立体结构肝脏。

日本和美国研究人员利用人类诱导多能干细胞培养的肝脏从严格意义上来说还不是肝脏，但是可以看成是微小肝脏，它们的直径只有4毫米～5毫米，却表现出了肝脏的生物活性和生理功能。

研制的过程是，将人类皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞，并且让其分化成表达肝脏基因的早期肝细胞。然后在培养基中加入从脐带血中提取的内皮细胞和制造骨骼、软骨和脂肪的间充质干细胞，内皮细胞的作用是指挥血管排列和生成。此后，这些细胞在培养基中自行成长为球状的细胞团，如同人类胚胎中肝脏最初的发育一样。两个月后，这些细胞团快速生长成直径为4毫米～5毫米的微小肝脏，研究人员再把这种微小肝脏移植到小鼠的皮肤下。此后，微小肝脏与小鼠的血管慢慢连接起来，最终发育成类似成体肝脏的器官。这种微小肝脏还接管了小鼠肝脏的一些正常的工作。

为了验证这种微小肝脏是否有生理功能，研究人员对小鼠注射了两种药物，以检查肝脏是否有代谢药物的功能。这两种药物是抗炎药酮洛芬和治疗高血压的药物异哇胍。结果发现，小鼠的血液中产生了通常来自人类肝脏的代谢产物而非小鼠肝脏的代谢产物。这说明移植进小鼠体内的微小肝脏发挥了作用。

同时，研究人员还做了一个对照研究，以检测微小肝脏是否有解毒功能，以便帮助肝功能衰竭的小鼠存活。实验用了两组小鼠，一组小鼠的每一只体内都植入了12个诱导多能干细胞培养的微小肝脏，另一组小鼠作为对照组，未植入微小肝脏。研究人员对两组小鼠都注射白喉毒素。结果，移植了微小肝脏的一组小鼠有近1/3存活超过了40天，而对照组小鼠在10天内都死亡了。

此外，研究还发现，诱导多能干细胞生成的微小肝脏能够分泌肝脏的特异性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且产生人类特异性代谢物。诱导多能干细胞生成的微小肝脏最为重要的特点是，它很快就能与附近的血管融合，从而获得受体血液系统的支持。这是器官移植最重要的一步，因为有了受体血液系统的支持，而且不受到受体免疫系统的排斥，移植的器官就会持续生长，成为受体体内的一员。因此，尽管这种能首次连接到受体血液系统的具有复杂生理功能的器官还比较微小，但已经是再生医学的一个重要里程碑。

当然，未来如果能进一步表明诱导多能干细胞培养的微小肝脏移植进人体后不受人的免疫系统排斥，那么微小肝脏就可以移植给人体，至少可以取代成人30%的正常肝脏功能。这对于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意义。当然，如果诱导多能干细胞培养肝脏的技术进一步成熟和有效，则有可能培养出像成人肝脏那么大的肝脏，器官移植将会获得突破性进展，因为病人再也不用长时间等待供体器官了。但是，要达到这一步可能还要等上较长时间。

培育简单器官和组织更容易

由于肝脏具有较为复杂的多种生理功能，如解毒功能、代谢功能、分泌胆汁、免疫防御功能等，这就意味着用干细胞培育肝脏更具挑战性和复杂性。因此，在用干细胞培育较为简单的器官方面，应当更有收获。事实也完全证明了这一点。

现在，多个国家的研究人员已经能用诱导多能干细胞培育多种简单的器官，如血管、肌肉、毛囊等。

美国麻省总医院史迪尔肿瘤生物学实验室主任雷克思·杰恩等人利用人类诱导多能干细胞衍生的血管前体细胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且这些血管维持活性长达280天。

用人类诱导多能干细胞培育的血管主要可以用于治疗心血管病和糖尿病导致的血管损害。比如，糖尿病晚期常导致病人的大血管并发症，如动脉粥样硬化、冠状动脉狭窄（可导致冠心病甚至心肌梗塞）、供应大脑的血管狭窄（可导致脑缺血甚至脑梗塞）、供应下肢的血管狭窄（可导致下肢的疼痛和坏疽），这时就可以用再造血管的方法来治疗晚期糖尿病人。同时，还可以用新血管为新生组织提供血液供应。

过去的一些研究显示，利用人类诱导多能干细胞能生成构建血管所需的内皮细胞，但是，将这些细胞导入到小鼠身上却无法形成持久的血管。于是，麻省总医院的研究人员利用来自健康成人以及1型糖尿病病人的人类诱导多能干细胞，在小鼠大脑外表面和皮肤下生成了血管。研究小组采用了一种最初用于人类胚胎干细胞衍生内皮细胞的方法，以此来扩大和培养人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞群生成能够形成血管的内皮细胞。

随后，研究人员把这些内皮细胞与间充质前体细胞（可生成必要的结构细胞）一起移植到小鼠大脑的表面。在两周内，移植细胞形成了血液灌注的血管网络，它们与邻近的天然血管一样发挥了功能，并在小鼠体内持续发挥功能长达9个月。此外，研究人员也用同样的方法在小鼠皮肤下移植内皮细胞与间充质前体细胞，结果也生成了功能性的血管。但是，在皮肤下的移植需要移植更多的细胞，约为移植到大脑的5倍以上，并且生成的血管的寿命比在大脑生成的血管寿命短。

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这项研究还表明，来自健康人的细胞和患1型糖尿病患者的人类诱导多能干细胞衍生的内皮细胞都可以生成能长期维持功能的血管。但是，不同的人类诱导多能干细胞和包括来自同一患者的不同细胞系在生成血管的潜力上有差异，因此，还需要更深入地了解干细胞生成血管的更多机理，而且需要找到更好的方法来操控生成特定器官所需的特异内皮细胞类型。

当然，由人类诱导多能干细胞生成的血管是否能应用于糖尿病病人，还需要在安全性和实用性方面进行更深入的研究，但毕竟这项研究已经让人们看到了一些希望。

另一方面，用干细胞培养成熟的心肌也有了新的突破。过去，在培养基中培养的心肌细胞并不像人体心肌细胞那样具有生理功能，例如传导生物电信号和收缩。为了解决这些问题，美国杜克大学生物医学工程系的尼纳德·伯萨克等人采取了一种新的方法来培育心肌，即用胚胎干细胞来培养心肌。胚胎干细胞不同于诱导多能干细胞，可能会受到伦理制约，而且所能获得的胚胎干细胞也有限，当然其全能分化和生长的效果优于诱导多能干细胞。

研究人员在实验室中把人胚胎干细胞分化得到的心肌细胞放入三维水凝胶中。此后，心肌细胞自行组装成心肌束，形成了纤维细胞在外、内皮细胞穿插其中的三维结构。而且，这种组织并非是心肌细胞的堆积，而是一块8毫米×8毫米的心肌组织，并且达到了与体内心肌细胞类似的功能指标。通过注入不同的药物可以检测心肌电传导性能的变化和检测药物对心肌收缩能力的影响。由此证明，这种由胚胎干细胞培养的心肌组织不仅可以传导生物电流，而且可以自主搏动。

研究人员认为，这种心肌组织的结构和功能都超过了以前的人工心肌，也是迄今为止和人体组织最接近的人造心肌薄片。虽然这是依靠胚胎干细胞培养的，但是，通过仔细总结培养的机理，未来可以通过提取心脏病人的皮肤细胞以获取诱导多能干细胞，再由后者来培养特异的心肌组织或心脏，如此，则可以修补病人的坏死心肌，或者直接为病人移植用其自身的皮肤细胞培养的心脏。

培育血细胞

诱导多能干细胞还能培育更多的血细胞，以用于输血、诊断和治疗疾病。

人的血液由血浆和血细胞组成。血浆相当于结缔组织的细胞间质，为浅黄色半透明液体，其中除含有大量水分以外，还有无机盐、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各种营养物质、代谢产物等。血细胞则分为红细胞、白细胞、血小板。人的血细胞总是在不断地新陈代谢。红细胞的平均寿命约120天，有粒白细胞和血小板的生存期限一般不超过10天。淋巴细胞的生存期长短不等，从几个小时到几年。一般而言，血细胞及血小板来自造血器官，红细胞、有粒白细胞及血小板由红骨髓产生，无粒白细胞则由淋巴结和脾脏产生。但是，由于疾病和造血功能异常会导致一些血液方面的疾病，如贫血。

贫血是指人体外周血液中红细胞容量减少并低于正常范围下限的一种疾病，但是由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白（Hb）浓度来代替。在中国一般把成年男性Hb<120g/L、成年女性（非妊娠）Hb<110g/L、孕妇Hb<100g/L定为贫血。贫血的原因有多种，如造血干祖细胞异常所致的贫血，再生障碍性贫血就是其中一种；还有造血微环境异常也可导致贫血，例如骨髓基质和基质细胞受损会产生贫血；还有造血原料不足可致贫血，造血原料是指造血细胞增殖、分化、代谢所必需的物质，如蛋白质、脂类、维生素（叶酸、维生素B12等）、微量元素（铁、铜、锌等）等。任何一种造血原料不足或利用障碍都可能导致红细胞生成减少。

因此，贫血的根本原因是红细胞减少，因而导致血红蛋白减少，血液携氧供氧能力下降，这就会对全身造成不同程度的影响。例如，造成神经系统的损害，表现为头昏、耳鸣、头痛、失眠、多梦、记忆力减退、注意力不集中等；贫血更影响呼吸循环系统，表现为气急或呼吸困难，并且有心悸、心律失常和心功能不全；贫血也影响消化系统，因为贫血时消化腺分泌减少甚至腺体萎缩，进而导致消化功能降低、消化不良，出现腹部胀满、食欲减低、大便规律和性状的改变等。

长期以来，治疗慢性贫血的效果并不如意。研究人员也在寻找新的方法，例如输血和单独输入红细胞。但是，输血和输入红细胞也可能发生排异反应和输血反应，甚至染上其他传染性疾病。如果能用病人的皮肤细胞产生诱导多能干细胞，再由后者生成红细胞，就可以把红细胞输入病人体内，治疗贫血。

现在，美国波士顿大学医学院的乔治·墨菲与波士顿大学公共健康学院的戴维·希尔领导的研究团队采用一种新的方法，对诱导多能干细胞进行分化，在试管内制造出了大量的人类红细胞和血小板。这些红细胞有望用于治疗贫血和诊断疟疾、镰状细胞贫血，而血小板则可用来检查心血管病和治疗凝血障碍。

研究人员先是从波士顿大学再生医学中心的诱导多能干细胞库获得人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞接触生长因子，随后添加了用来调节芳香烃受体（AhR）通路的化合物。以前的研究表明，这一通路会通过芳香烃受体与环境中的有毒物质相互作用来促进癌细胞发育。但是，使用这种新方法可以使功能性红细胞和血小板的产量在短时间内大量增加。

由于通过人类诱导多能干细胞可以培育大量的红细胞和血小板，就不仅可以用于治疗疾病，如贫血和治疗血小板不足导致的紫癜、出血，还可以将红细胞和血小板用于成分输血，同时由于是量身定做，不会让病人产生排异反应、输血反应和染上其他传染性疾病。

【责任编辑】张田勘

4.细胞克隆培养论文 篇四

摘要：随着生命科学时代的带来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，引起了社会各界的广泛关注。克隆包含动物、植物等方面，动物克隆在畜牧业生产、医药生产、疾病治疗、生物学基础理论研究、以及动物转基因工程等诸多领域蕴藏着巨大的应用潜力。通过科学研究者的努力，哺乳动物的克隆技术在农业和生物制药等方面取得了进步，展示了克隆技术的应用价值和发展前景。

关键词：动物克隆技术

1、克隆技术含义: “克隆”，即无性细胞繁殖系，又称为一个细胞株或细胞系，细胞株与细胞系没有本质的区别。也可以理解为复制，拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。无性繁殖的手段有很多种，包括孤雌生殖，胚胎切割和细胞核移植等等。而产生克隆动物的方法则称为动物克隆技术。

在《中国大百科全书·生物学者》中，对“克隆”的解释是：克隆又称无性繁殖细胞系和无性繁殖系，是一个细胞或个体以无性繁殖重复分裂或繁殖所产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传结构。克隆技术同整个生物界的进程一样，是由低级到高级，有简单的复杂不断发展和进步的。它由单个细胞获得2个以上细胞、生物体，发展到生物体内的生物大分子的自我复制，在DNA复制酶的作用下，复制生成俩个一模一样的DNA分子。

2、动物克隆的进程：

1938年，国外就有人提出提出成年动物的细胞核入卵子法克隆哺乳动物的设想。

1978年，我国著名科学家童第周成功地进行看了克隆黑斑蛙的实验，他将黑斑蛙的红细胞核移入到事先去除了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵发育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1996年，用成年哺乳动物体细胞克隆出的哺乳动物个体克隆羊多莉出世，开创了体细胞繁殖哺乳动物的成功先例。

2003年，克隆马出世，是世界上首例哺乳动物生下自己的克隆体。

2003年8月，中国科学家在世界上首次采用克隆技术培育出含人免DNA混合物胚胎。

2003年9月，沃斯宣布他已克隆出了含人，牛DNA的混合胚胎。

2008年1月7日，2头具有绿色荧光遗传特征的小猪在哈尔滨诞生。

3、动物克隆技术的应用：

动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学，遗产学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。

动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5%的动物携带外源基因外源基因整合动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的几率低难以遗传给下一代。Schnieke等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子IX的转基因羊比原核显微注射法要有效得多。其中，两者最显著的差异是体细胞克隆的中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出世后才能得知，而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性的制备雌性的转基因动物，有利于在母乳中表达外源基因。

克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培养出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏病、神经损伤等多种疾病。用这种方法培养出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善。目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。

动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短了育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。

4、动物克隆技术的不足及未来发展方向

动物克隆技术然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步的应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels等报道克隆羊的端粒较同年羊短。Renard等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。

导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支持是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累不少数据，但一些很基本的问题任亟需解决。

动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要做连续核移植等。

综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进步。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决将有助于人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。

5、结束语

要紧跟世界科技发展的潮流，充分利用克隆技术为人类带来巨大的利益，又要严格控制可能造成混乱的克隆人出现。

参考文献：

《生命伦理学》、《生命的化学》 学院：呼和浩特职业学院

专业：生物技术及应用 年级：12级

5.干细胞培养技术 篇五

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞.方法无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨,用冲洗法冲出骨髓,用直接贴壁法分离纯化MSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定,并检测第3代MSCs的.细胞周期.结果体外培养的原代MSCs 72 h内可见有少量贴壁细胞,7 d左右达到汇合.免疫细胞化学示,MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性,而CD14、CD34、CD45表达阴性.流式细胞仪示,CD14阳性率为0.19%、CD29为64.36%、CD34为0.17%、CD44为86.73%、CD45为0.18%、CD73为90.21%、CD105为74.25%、CD166为54.60%.细胞周期显示,第3代MSCs约有90%的细胞处于G0/G1期.结论MSCs在体外很容易分离培养和扩增,DAPI标记MSCs敏感性好,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径.

作 者：何忠杰 马俊勋 方驰华 杨丽萍 作者单位：何忠杰,马俊勋(南方医科大学附属珠江医院普通外科,广东,广州,510280)

方驰华(中国人民解放军总医院304急救部,北京,100037)

杨丽萍(中国人民解放军总医院304烧伤研究所,北京,100037)

6.干细胞培养技术 篇六

细胞悬浮培养技术是当代最先进的抗原生产工艺技术, 与传统的培养方式相比具有明显优势:一是单位细胞培养容积生产效率提高140倍以上。二是单位抗原效价提高10倍～100倍。就高效价猪瘟疫苗来说, 转瓶培养时每毫升抗原效价为8万RID, 悬浮培养高达150万RID, 抗原效价提高了18倍。三是同等产能所用空间减少50%。四是有效化解外源病毒污染风险。传统的牛睾丸原代细胞生产方式易携带牛病毒性腹泻黏膜病病毒 (BVDV) , 给猪瘟疫苗带来了巨大的外源病毒污染风险, 而传代细胞悬浮培养可有效化解这一生产难题。五是密闭自动化运行, 大大减少了人工操作步骤和污染机会, 悬浮培养条件稳定, 可保持病毒的生物学特性, 生物安全性好, 质量稳定。

普莱柯公司利用国内首创的传代细胞悬浮培养技术研制成功的高效价猪瘟疫苗, 创造了猪瘟疫苗质量新标准。目前, 猪瘟疫苗的国家标准有两个:一是市售标准, 其单剂量抗原效价为750RID。二是政府采购标准, 其单剂量抗原效价为7500RID。专家建议每头猪用3～4剂量, 相当于30～40剂量的市售猪瘟疫苗。普莱柯公司利用国内首创的传代细胞悬浮培养技术所开发成功的猪瘟疫苗单剂量抗原效价高达3万RID, 相当于政府采购标准的4个剂量, 相当于市售标准的40个剂量, 引发了我国猪瘟疫苗生产方式的革命。

采用悬浮培养技术开发成功的高效价猪瘟疫苗, 使我国生物制品产业实现了两大突破:一是实现了工厂化抗原生产由单层细胞培养升级为悬浮培养的重大工艺技术突破;二是实现了猪瘟疫苗生产由牛睾丸原代细胞升级为传代细胞的重大工艺技术突破。

7.单细胞藻类培养方法的改进 篇七

1常用种类

贝类育苗中常用种类较多，有小球藻、塔胞藻、扁藻、金藻（等鞭金藻和叉变金藻）、硅藻（新月菱形藻）；海参育苗中常用种类有盐藻、角毛藻和新月菱形藻。以上几种藻类对温度、盐度、光照有着不同的适宜范围，在不同的育苗期可以提供相应的大量饵料。

2培养方法

主要有一级培养、二级培养、三级培养。在大规模生产中，饵料室条件好的，一级种源较多的可以省略二级培养，由一级培养直接到三级培养，下面就一级培养和三级培养分别做如下介绍。

2.1一级培养

2.1.1容器工具主要有三角烧瓶（5 000 mL），根据生产规模决定需要多少，还有1 000 mL三角烧瓶2个，配制营养液用，还有10 mL移液管，水桶、脱脂棉、毛巾、漏斗、棉手套等。

2.1.2消毒海水和工具都采用加热消毒法，分别要烧开1～2 min，待凉后再用。

2.1.3扩种当藻种达到生长高峰期时是扩种的最佳时期，以前老方法是一瓶扩出一瓶，一次性按比例添加营养盐，（1 000 mL加1 mL）这样大概7 d一个周期，现在采用新方法，一瓶扩成三瓶加水到3 000 mL，加营养液，3～4 d藻液达到指数生长期，再加水倒5 000 mL同时加营养液，3 d后藻液浓度达到高峰期，这样同样一周的时间可以多培养一瓶藻液。营养液要用kv方，营养全面，藻液生长速度最快。

2.2三级培养

2.2.1培育池池深最好不要超过1 m，一般80～90 cm为最佳，5～10 m2为一个培养池。

2.2.2消毒水泥池要用1:1 HCl刷洗，后用清水冲洗干净。海水、工具要在接种前一天用含有效氯100 mg/L的漂白液充气消毒，充匀后可停气，消毒时间要在12 h以上，接种当天要用100 mg/L硫代硫酸钠中和，充气搅匀检查无余氯后可使用。

2.2.3施肥首先是营养盐的配置，硝酸钠60 mg/L；磷酸二氢钾4 mg/L；柠檬酸铁铵0.45 mg/L；硅藻类还可添加硅酸钠4.5 mg/L；小球藻类可添加尿素4 mg/L；营养盐根据需要按海水比例配置，可提前用烧开消毒的海水配置好，根据需要添加。

2.2.4接种海水经消毒处理，营养盐配好后可进行接种，首先在温度上要和藻液温度接近，温差最好<3℃。其次选种在质量上，选择生活力强、生长旺盛、颜色正、无沉淀、无吸附现象，无敌害生物污染的；在数量上，藻种必须达到一定的浓度，要加大起始接种量，使一开始培养藻类就在培养中占优势，对敌害生物也起到抑制作用，又能缩短培养周期。接种比例一般为1∶5。

2.2.5管理每天搅拌4次，上午8:00、11:00下午14:00、17:00，每次1 min，每次操作都要做好消毒处理，严格消毒避免污染。每天要做好镜检和定量工作，及时处理饵料是否有污染和生长密度的各种变化。以便及早做出处理决定。（提前决定啥时扩种，有污染的不能继续扩种等日常管理）

3小结

8.细胞培养室管理规章制度-new 篇八

1.细胞培养室是进行各种细胞培养的净化级实验室，所有进入实验室的人员都必须遵守实验室有关的规章制度，接受实验室管理人员的管理。

2.禁止带外来非实验人员进入实验室，每组同时操作人员不得少于两名，一名操作，一名负责质控。

3.实验前超净工作台和实验室开紫外照射30分钟。

4.严禁将与实验无关的物品带入实验室；在本实验室内不得进行微生物等其它易污染物的培养。

5.实验人员必须经专业培训，在进行实验前必须熟悉实验内容，操作步骤及各类仪器的性能和操作方法，严格执行操作SOP，并做好必要的安全防护。

6.实验前要清洁双手，新吉尔灭泡手，75%酒精棉球擦手。实验完毕清除杂物，清洁台面，切断电源，物品归类还原，并有清场记录。

7.认真做好细胞培养实验记录，以了解细胞生长情况，用于实验的分析和整理。

8.室内常规用品不准随意拿出室外，所有物品不得挪作它用。

9.对室内的仪器如低温冰箱，CO2培养箱等要记录运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修。

10.个人存放于冰箱内的培养液要注明姓名、配制日期、不得随便使用他人的培养液，以免交叉污染。

9.干细胞培养技术 篇九

【摘 要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果 获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。

【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定

0.引言

巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞， 具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1， 2] ， 被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。

1.材料与方法

1.1实验对象

清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养

随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。

1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定

（1）台盼蓝染色计算存活率。

4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。（终浓度0.04%） ； 计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

（2）瑞氏染色计算细胞纯度。

细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。 结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片，再用油镜。

2.结果

2.1小鼠巨噬细胞的分离培养

（1）巨噬细胞的观察与鉴定.

巨噬细胞体外培养24h观察结果。如图1

（2）台盼蓝染色结果。

从腹腔分离出来的巨噬细胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活率>95%，如图2

（3）瑞氏染色结果。

从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度>98%，如图3

图1巨噬细胞体外培养24h观察 图2台盼蓝染色结果

图3 瑞氏染色结果

3.讨论及结论

巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答[6]，以及巨噬细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。

虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗液了，但具体操作略有差异[7]。预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。虽然这些刺激剂能分离收集到大量的巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。本实验提取巨噬细胞的方法是对文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相对处死小数后进行系列操作而言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠定了基础。

【参考文献】

[1]徐远义，黄允宁，常越，等.多抗甲素诱导小鼠腹腔巨噬细胞对癌细胞杀伤增强机制的研究[J].免疫学杂志，2006，22（4）：396-398.

[2]黄琼，李志，杨杏芬，等.流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[J].中国药理学与毒理学杂志，2007，21（2）：140-146.

[3]张华，钟英英，方廖琼，等.羊胎盘免疫调节因子对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响[J].中国生化药物杂志，2005，26（2）：70-72.

[4]李海涛，肖丹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[J].现代生物医学进展杂志，2008，8（4）：638-639.

[5]SO，IH，T-SH，etal.Rearrangement of action cytoskeletion during infection with Escherichia coli O157 in macrophage[J].Cell Struct Funct，1999，24（5）：237-246.

[6]Fulton SA，Reba SM，Pai PK，etal.Inhibition of major histocompatibility complex Ⅱ expression and antigen processing in murine alveolar macrophage by mycobacterium bovis BCG and the 19-kilodalton mycobacterial lipoprotein[J].Infect Immun，2004，72（4）：2010-2110.

10.干细胞培养技术 篇十

关键词：子宫内膜异位症,子宫内膜,间质细胞,腺上皮细胞

子宫内膜异位症(endometriosos,EMs)体外模型是研究其发病机制及探讨新的治疗方法的工具。模型可分为两种,一种是在体模型,还有一种是离体模型。由于人子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞还没成功建立体系,因此,原代培养成为了EMs的重要体外研究方法。现今,和腺上皮以及宫内膜间质分离培养的相关文献非常的多[1],但未检索到比较EMs在位子宫内膜和正常子宫内膜分离培养方法差异的文献。本研究的目的是对EMs患者在位子宫内膜腺上皮及间质细胞进行高纯度分离、培养,从而对子宫内膜细胞常规培养方法做出改进。

1 资料与方法

1.1 临床资料及子宫内膜组织标本的获取

随机选取2007年7月‐2012年3月在深圳市第二人民医院及中山大学附属第二医院妇产科住院治疗的手术患者共12例,年龄25~40岁,分为EMs组和正常组。EMs组选择有不孕症史的因子宫腺肌病或卵巢子宫内膜异位囊肿手术治疗的患者7例,所有病例均经腹腔镜或开腹手术确诊,分期不限;正常组选择已正常生育的非子宫内膜异位症、非子宫内膜病变及非恶性肿瘤的入院手术患者5例。所有患者术前3个月未使用激素类药物,行腹腔镜术之前,通过患者的阴道取样,或者直接对切除的子宫进行刮取,将采集的子宫内膜立刻置于无菌的5 ml磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)离心管中,并且转移到实验室,在低温下进行分离培养。经术后病理检查,患者的子宫内膜都没有发生病变,获取子宫内膜样本及所需操作均在术前取得患者同意。

1.2 主要试剂及仪器

D-MEM/F-12培养基及胶原酶I(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),培养皿、培养瓶以及多孔板等(Corning公司);倒置显微镜(Leica公司,DMi1),400目不锈钢筛网(博理医疗仪器有限公司),立可灵一次性宫腔组织吸引管(上海家宝医学保健科技有限公司,C3.1型),二氧化碳(CO2)细胞培养箱(Thermo公司,3429型),低速离心机(北京医用离心机厂,DT5-1B);小鼠抗人波形蛋白单抗、小鼠抗人角蛋白单抗、即用型链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin-peroxidase complex method,SABC)免疫组化染色试剂盒和二氨基联苯胺3(3'-diaminobenzidine,DAB)(武汉博士德公司)。

1.3 方法

1.3.1 子宫内膜腺上皮及间质细胞的分离及培养

①在无菌操作的条件下,使用PBS液清洗子宫内膜,共计3次;除去血块及黏液,将子宫内膜组织剪成大小约为0.5~1.0 mm3碎块。②加入2.5~5.0倍体积的0.1%胶原酶I,混匀37℃水浴60~120 min(EMs组标本120 min,正常组标本60~90 min)。③经步骤②处理后,使用规格为38 mm的过滤网进行过滤,并且把滤液以1 000 r/min的速度进行离心,时长为5 min。经离心处理后,摒弃上层清液,下层的沉淀主要成分为间质细胞;把过滤网上残留的物质进行漂洗并收集,然后进行离心处理,摒弃上层清液,下层的沉淀主要成分为腺上皮细胞团。④使用细胞计数器进行细胞计数后,将混有间质细胞的沉淀液以5×105/ml接种于加有培养液的培养瓶内。再将混有腺上皮细胞团的沉淀液以400个/cm2接种于加有培养液的培养瓶内。⑤EMs组间质细胞标本在培养瓶中培养30 min,正常组间质细胞标本在培养瓶中培养45~60 min之后,摒弃悬浮在上方的腺上皮细胞和细胞,再次分别将培养液加入其中。⑥正常组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养120~150 min,EMs组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养90~120 min,之后吸出悬浮在上层的腺上皮细胞团和细胞,并且将其转移到加有培养液的新培养瓶中或直接种到6孔板及24孔板中。⑦置于CO2体积分数为5%并且温度为37℃的孵箱中进行培养,培养1 d后更换培养液,之后每隔2、3 d再更换1次。

正常组子宫内膜腺上皮及间质细胞分离培养主要参照唐雪莲[2]的方法,本实验中对EMs组子宫内膜腺上皮及间质细胞分离培养进行了如下改良:相比正常组,延长EMs组消化时间30~60 min(步骤②),缩短了其后的贴壁等待时间约15~30 min(步骤⑤、⑥)。

1.3.2 子宫内膜腺上皮及间质细胞的形态与纯度鉴定

①将细胞置于倒置显微镜下,观察上述细胞的形态学差异。②用小鼠抗人波形蛋白单抗、小鼠抗人角蛋白单抗对腺上皮细胞及间质细胞分别进行免疫染色,操作按照说明书进行。其中小鼠抗人波形蛋白单抗、小鼠抗人角蛋白单抗的工作浓度均为1∶100。

1.3.3 子宫内膜腺上皮及间质细胞的传代

原代细胞铺满瓶底后,进行传代,向瓶内加入0.125%胰酶加0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),室温下消化2 min,加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养基终止反应。用吸管将细胞自瓶底吹下并使其呈均匀混悬液。将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min,弃去上清,加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养基,将细胞吹匀,按1传3的比例进行传代培养。

2 结果

2.1 细胞培养结果

12例子宫内膜标本中10例培养成功,2例培养失败。其中,1例是因为细菌污染所致,1例是因为细胞量过少所致。经原代培养的子宫内膜细胞,在接种1 d之后,基本能贴壁。接种4~7 d,腺上皮细胞铺满;接种3~7 d间质细胞铺满,细胞存活率≥90%。

2.2 对间质细胞培养过程的观察

EMs组间质细胞贴壁较快,约15 min后开始逐渐贴壁;正常组约30 min后开始贴壁,2 h后大部分贴壁;EMs组和正常组子宫内膜间质细胞在体外生长时外观特征相似。两组间质细胞均呈梭形,纺锤状,折光性强,胞质薄而透明,核椭圆,长期培养后细胞延伸为长梭形,相互平行排列成束。两组原代培养的间质细胞纯度相当高,几乎见不到腺上皮细胞团,偶见的小团样生长腺上皮细胞经传代1、2代亦可去除纯化。间质细胞易被传代,生存期长,10代以内其形态基本不变。

2.3 对腺上皮细胞培养过程的观察

EMs组腺上皮细胞团贴壁较快,约90 min后开始逐渐贴壁;正常组约2 h后开始贴壁,24 h后均贴壁良好。EMs组和正常组子宫内膜腺上皮细胞在体外生长时外观特征相似。两组腺上皮细胞胞质饱满,核大圆,核仁明显,细胞多数形态为星形、多角形,形状不规则,呈旋涡状成团生长。腺上皮细胞团中偶见间质细胞插入性生长,较散在。培养瓶中腺上皮细胞约占细胞总数92%~98%。两组腺上皮细胞均能传1、2代,传代后细胞数量逐渐减少。2.4消化时间及贴壁时间不同对两组细胞生长的影响

本实验发现在使用胶原酶I消化两组细胞时,正常组标本消化60~90 min,正常组的子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞可以达到较好的分离效果,但是,如果采用与正常组相同的消化时间EMs组只能得到数量很少的腺上皮和间质细胞(少于正常组的30%)。考虑消化时间不够,延长EMs组标本消化120 min后,间质细胞及腺上皮细胞纯度增加。

正常组间质细胞标本在培养瓶中培养45~60 min之后,间质细胞纯度较高。如果采用与正常组相同的贴壁时间,EMs组只能得到纯度较低的间质细胞(混有较多的腺上皮细胞)。考虑贴壁时间较长,一部分腺上皮也已贴壁。故减少培养时间,EMs组间质细胞标本在培养瓶中培养30 min之后,间质细胞纯度明显提高。

正常组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养120~150 min之后,间质细胞基本全部贴壁,悬浮液中腺上皮纯度较高。如果采用与正常组相同的贴壁时间,EMs组只能得到数量很少的腺上皮细胞。考虑贴壁时间较长,大部分腺上皮细胞也已贴壁,悬浮液中腺上皮细胞剩余较少。故减少培养时间,EMs组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养90~120 min,腺上皮细胞数量明显提高。

2.5 细胞纯度鉴定

对EMs组子宫内膜细胞使用改进后的分离培养方法后,分别取得EMs组间质细胞及腺上皮细胞原代细胞。用对腺上皮细胞特异的细胞角蛋白单克隆抗体标记腺上皮细胞,对间质细胞特异的波形蛋白单克隆抗体标记间质细胞,原代培养的EMs组腺上皮细胞角蛋白染色阳性,纯度率约95%;原代培养的EMs组间质细胞行波形蛋白染色呈阳性反应,细胞纯度率可达97%以上。

3 讨论

子宫内膜细胞的原代培养,其生物学特性未发生很大变化,仍具有二倍体遗传物性。体外原代培养EMs患者的在位以及异位子宫内膜细胞,能够将细胞在组织原位信息,当作是研究子宫内膜细胞的代谢、分化以及生长的实验模型,能够为异位症的临床研究与治疗提供依据。根据经血逆流致病学说,发生EMs的组织是子宫内膜。有学者指出,体外培养子宫内膜细胞,实际上是模拟EMs[3]。经研究证实,对子宫异位患者的内膜进行体外培养,内膜细胞的生化活性以及内膜细胞和在为内膜细胞的相似;和异位子宫的内膜细胞相比较,在为子宫的内膜细胞更容易获取足够的标本量,所以,利用EMs患者在位子宫的内膜进行分离培养,所得到的间质细胞和腺上皮细胞可以当做EMs的体外模型。

11.干细胞培养技术 篇十一

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定

目的:建立一套可靠的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅱ)分离、纯化和培养技术, 为进一步研究小鼠支气管肺泡干细胞(BASC)的增殖、分化及其在肺腺癌发生中的作用奠定基础.方法:采用分散酶消化小鼠肺组织块,经免疫黏附法纯化小鼠AEC Ⅱ,并进行原代培养.用SP-C和CCSP免疫荧光染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定.结果:该方法所获得细胞产量大、纯度高.AEC Ⅱ比例约为(80±2.6)%(n=5),Clara细胞约(6.7±1.2)%(n=5),并能维持培养3～5 d.透射电镜观察AEC Ⅱ,细胞内可见板层小体.结论:该方法是一种可靠的`小鼠AEC Ⅱ的分离、纯化和培养技术,可满足一般的实验要求.

作 者：安江洪 钱莘 敖绪军 卓文磊 陈正堂 AN Jiang-hong QIAN Shen AO Xu-jun ZHUO Wen-lei CHEN Zheng-tang  作者单位：第三军医大学附属新桥医院解放军肿瘤研究所,重庆,400037 刊 名：医学研究生学报  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATES 年，卷(期)：2008 21(3) 分类号：Q813.1 关键词：肺泡Ⅱ型上皮细胞   原代细胞培养   小鼠支气管肺泡干细胞  

12.干细胞培养技术 篇十二

豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定

目的` 探索豚鼠膀胱Cajal样问质细胞的原代培养方法.方法 颈部脱臼法处死豚鼠,无菌条件下分离出膀胱肌组织制备成肌条.采用V型胶原酶酶解法分离细胞,将细胞悬液接种于含干细胞因子的细胞培养基中培养,隔日换液.用酪氨酸蛋白激酶受体特异性抗体标记细胞,证实细胞类型.结果 培养后的Cajal样间质细胞保持其固有特征,可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起,该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体抗体荧光染色阳性证实细胞培养成功.结论 用V型胶原酶消化法可获得成年豚鼠膀胱Cajal样问质细胞,并在体外条件下生长,可用于Cajal样间质细胞的电生理学研究.

作 者：Wang Qian 王勤章 Ding Guofu 李维仁 Wang Wenxiao 王江平Li Yinglong Wang Qian Wang Qinzhang Ding Guofu Li Weiren Wang Wenxiao Wang Jiangping Li Yinglong 作者单位：新疆石河子大学医学院一附院泌尿外科,新疆石河子,83刊 名：现代泌尿外科杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MODERN UROLOGY年，卷(期)：200813(4)分类号：Q813.11关键词：干细胞因子 V型胶原酶 酪氨酸蛋白激酶受体 Cajal样间质细胞

13.滩羊骨髓间充质干细胞分离与培养 篇十三

关键词：滩羊,骨髓间充质干细胞,体外分离培养,全骨髓法,差速贴壁法

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Dtromal Cells,BMSCs)源于中胚层,是骨髓细胞中除造血干细胞之外的细胞部分,具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。在特定培养的条件下,BMSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及神经细胞等多种类型的组织细胞。BMSCs具有增殖能力强,来源广泛,取材方便、体外培养稳定等优点,已成为组织工程种子细胞的首选[1,2]。目前在小动物上如小鼠、大鼠、兔上研究比较广泛,而在牛羊等大动物的研究上相对较少[3],尤其是在滩羊的研究就更少,因此实验重在探讨宁夏滩羊BMSCs的分离培养,以筛选出适合滩羊BMSCs的培养条件,以期为后续的相关研究提供滩羊BMSCs。

1 实验动物

实验动物来源于宁夏暖泉滩羊种羊场饲养的1岁雄性滩羊。

2 实验方法

2.1 BMSCs的分离、培养及传代

将滩羊麻醉后用16号骨穿针行髂骨穿刺,待进针感觉到有明显的落空感后,用10 m L注射器抽取骨髓5 m L,与含有肝素钠的DMEM培养液等量混匀后1 000 r/min离心5 min,弃上清液;向沉淀中加入DMEM液至15 m L,混匀后沿管壁缓慢加入到含有等量淋巴分离液,1 800 r/min离心15 min,缓慢取出,可见离心管分为清晰的5层:从上而下依次为脂肪层、血小板层、单核细胞层、淋巴细胞分离液及红细胞和巨噬细胞层,其中单核细胞层含有BMSCs[4,5]。

吸取单核细胞层后加入5 m L DMEM,移液枪缓慢吹打混匀,1 500 r/min离心5 min后弃上清液,重复操作3次。向沉淀中加入细胞培养液(含有10%胎牛血清、5%马血清及双抗的低糖DMEM)10 m L,反复吹打制成单细胞悬液,接种到25 cm2培养皿,每瓶加细胞混悬液5 m L,置37℃、5%的CO2、饱和湿度孵箱内进行培养,3 d后首次全量换液,以后每3~4 d半量换液1次。倒置显微镜下观察细胞变化,待80%左右的细胞融合成单层后,用0.25%胰蛋白酶消化传代,获得羊BMSCs。

2.2 BMSCs的冻存与复苏

取第3代处于对数生长期的羊BMSCs,用0.25%胰蛋白酶消化,2 000 r/min离心10 min,弃上清液,加入等量的冻存液(含有胎牛血清的DMSO),吹打均匀,细胞密度为1×108个/m L,每个灭菌冻存管中加入1 m L冻存液,封口膜封存。放入程序降温盒中置-70℃冰箱过夜,然后移入-196℃的液氮中。

取出冻存管后,迅速投入37℃水浴箱中,将融化的细胞悬液移入离心管,加入1 m L完全培养基吹打均匀后,以1 000 r/min离心10 min,弃上清液,加入完全培养基5 m L吹打均匀,接种于直径为25 cm的培养皿中进行常规培养。

2.3 BMSCs的脂肪诱导分化

取生长良好的第3代BMSCs,胰蛋白酶消化后,调整细胞密度2×105个/m L,接种于24孔板中,24 h后加入成脂诱导剂(含有地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及消炎痛),每3~4 d换液1次,21 d左右观察诱导分化的情况,并油红染色进行鉴定[6]。

3 结果

3.1 BMSCs的形态学特征

刚接种的原代细胞呈圆形,细胞核呈卵圆形,胞体透亮,折光性好,但初次接种的细胞含有较多悬浮细胞,主要为骨髓造血细胞,利用差速贴壁法去除。一般2~3 d后首次换液,除掉大部分悬浮细胞,换液后可见少量贴壁细胞,形态不均一,为梭形或不规则细胞,带有多个长的胞浆突起。7 d换液后悬浮细胞基本去除,BMSCs原代细胞聚集为细胞群落,形态以不规则的多角形为主。2周左右可见多处大片聚集生长的细胞群落,中心细胞为梭形,可见2~3个突起。

原代细胞生长缓慢,一经传代后,生长较快。传代细胞接种后2~4 h即可贴壁,6~10 h左右基本完成贴壁;第2~5天细胞呈梭形或不规则的三角形,也有扁平形且带突起的细胞,胞内可见2~4个核,细胞呈大体均匀分布,但有多个明显的梭形细胞集落呈克隆样生长,7 d左右达到80%融合度,细胞密集单层排列,生长抑制,即可进行传代,未见明显的钙化结节形成。

3.2 BMSCs的冻存和复苏

采用程序降温盒冻存的细胞,死亡较少,滩羊BMSCs复苏后,贴壁较快,但是稍慢于传代的滩羊BMSCs,6~8 d即可达到80%细胞融合度,其形态和活性与传代细胞没有明显差别。

3.3 BMSCs的成脂诱导

21 d诱导培养后,细胞由梭形变为空泡状,与脂肪组织内的脂肪空泡相似,并用油红染色后,脂肪滴呈红色。

4 讨论

BMSCs以其独特的细胞增殖分裂模式、稳定的细胞特性、连续传代培养和冷冻保存后仍保持多向分化潜能等特点,成为组织工程的理想的种子细胞。由于BMSCs数量少,且在体外培养条件下,仅有少数BMSCs能活跃复制。因此,探索体外分离、纯化和体外扩增BMSCs的方法,保持其增殖潜能与多向分化潜能的适宜培养条件,是进一步研究间充质干细胞应用的重要基础。目前,从骨髓中分离和纯化BMSCs的方法主要有:全骨髓细胞接种法,密度梯度离心法(Percoll或Ficoll密度梯度离心法),细胞表面分子标记分选法,免疫磁珠法[7,8,9,10]。

密度梯度离心法分离的细胞纯度较高,但会影响细胞的增殖活力,且操作较繁琐[11]。流式细胞仪、免疫磁珠分离系统等进行分选,可获得高纯度的BM-SCs,但对细胞的活性影响较大,甚至可能导致细胞完全失去活性。相比之下,全骨髓培养法获得细胞贴壁早,没有分离液和长时间的室温操作对细胞的损伤,不会剔除骨髓富含的各种黏附分子和生长因子,但细胞纯度不高,有血细胞混杂,不便于早期观察[4]。

14.干细胞培养技术 篇十四

关键词　细胞生物学　科学素养　科学精神

素质教育历来是高等教育阶段的主要任务，提升学生的科学素养是素质教育中一项最基本的内容，尤其是对生物学而言，更应该注重提高和培养学生的生物科学素养，这样才能够培养出能适应当代生命科学发展需要的应用型专门人才。所谓生物科学素养是指参加社会生活、经济活动、生产实践和个人决策所需的生物科学概念和科学探究能力，包括人们所掌握的生物科学知识、技能和方法，以及在此基础上形成的生物科学能力、科学观以及科学品质等方面。①细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，是21世纪自然科学的三大前沿学科之一，是当前生命科学领域中最活跃、最富有发展前景的学科，是生物类专业的主干课程之一。因此，在细胞生物学教学中如何提高学生的科学素养对于培养新时期的生物人才至关重要。本文主要对当代大学生生物科学素养现状、实施生物科学素养教育的重要意义以及如何在细胞生物学教学之中提高学生的科学素养进行了综述，旨在为生物教学提供一定的参考价值，以供方家借鉴。

1　当代大学生的生物科学素养现状及其存在问题

生物相关专业的学生对生物科学技术具有浓厚的兴趣，生物科学技术基础知识扎实，对生物技术发展持积极的肯定态度，具备良好的科技强国的信念。但是，他们对高新生物科学技术知识和先进实验技术了解较少，生物科学实验实践技能较差，对生物科学科研精神的理解和研究方法的掌握不足。有调查表明，当代大学生对于当前的一些生物热点问题有一定的了解，但是对于高新技术的应用和新的科学研究领域的认识不足。在理性上，有43%的学生是盲目的怀疑，或者是盲从专家和他人的观点，对事物较少有自己的看法；在探索求知精神上，“科学功利主义”对学生的影响最大，使得学生视野狭窄、目光短浅；在实证精神上，有62%的学生缺乏实验实证精神，偏重抽象思维，缺乏科学实验的精神和价值眼光。②此外，许多高校只注重生物专业课的常规教学，很少举办专门的科研活动，且科学技能培养与锻炼的途径缺乏，这使得大学缺乏浓郁的科学素养氛围，学生较难形成一定的科学技能，由此科学实践能力也较差。

2　细胞生物学教学中培养科学素养的意义

细胞生物学是生物学类及农林医药类本科生一门必修的专业基础课，是现代生命科学的前沿分支学科之一，它是以细胞为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平等三个层研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的生活史和各种生命活动规律的学科。细胞生物学是一门承上启下的学科，和分子生物学一起同是现代生命科学的基础，并广泛渗透到遗传学、发育生物学、生殖生物学、神经生物学和免疫生物学等的研究中，和农业、医学、生物高新技术的发展有密切的关系，是生命科学的重要支柱之一，在解决人类面临的重大问题、促进经济和社会发展中发挥重要的基础作用。同时，细胞生物学又是一门实践性很强的学科，重要理论与实践密切地联系着。随着生命科学自身和生物产业的快速发展，对生命科学相关领域创新型人才的需求也在不断增加。由此可见，细胞生物学课程中科学素养的培养对于建立与其专业层次、研究方向相符合的细胞生物学知识构架体系，培养和锻炼学生的科学思维能力具有非常重要的作用。

3　细胞生物学教学中如何培养学生的科学素养

细胞生物学作为生物学类及农林医药类的一门专业基础课程，在培养学生的科学素养方面，具有举足轻的重要作用。然而，科学素养的提高不是一朝一夕之功，教师应始终将其贯穿于自己的教学之中。如何在细胞生物学教学中培养和提高学生的科学素养，以下是笔者的一些想法和体会。

3.1　加强课堂教学中的“生活化”融合

细胞生物学的知识理论性强，内容抽象深奥、难于理解，教师可以试将抽象的内容与日常生活相联系，使学生有此联想起有趣的、熟悉的生活场景或事物，这不仅使抽象的内容具体化和动态化，使其容易理解，而且激发了学生的探究欲望和学习兴趣。例如讲解“蛋白质的分选”时，引导学生由细胞社会联想到人类社会。细胞中的各种蛋白质发挥结构或功能作用的部位几乎遍布细胞的各种膜区和组分，只有当蛋白质各就各位并组装成结构和功能复合体，才能参与细胞的各种生命活动。这就好比在人类社会中，各专业的毕业生只有找到适合其自身特点的工作岗位才能发挥所长。总之，运用发散性思维，尽可能地将细胞生物学抽象的理论知识与生活实际联系起来，并配合以多媒体辅助手段，使抽象的内容变得形象生动，易于理解掌握。

3.2　侧重教学内容的前沿性和新颖性

细胞生物学发展极为迅速，随着科学家们研究成果的不断涌现，其内容处在不断更新的动态过程中。因此，教师在教学过程中，要注重联系学科的前沿和热点，讲述较先进的科学结论，跟踪国际上最新进展。此外，教师在注重教学的同时，宜以科研并举，以科研引导和促进教学；教学与培养科学研究型人才紧密结合；教学内容与最新科研进展同步，使学生在正确掌握细胞生物学基础上学会解决与之相关的科学研究问题。如将教师的主要科研成果与基础理论教学有机结合，结合教学内容介绍自己的科研成果，这样既生动又贴切，学生又很熟悉，使学生获得学习的兴趣和动力，亦可以启发学生的创新思维能力，培养学生的科研钻研精神。

3.3　增加细胞生物学实验综合性和设计性实验的比例

综合性实验注重知识的综合运用，实验原理和方法步骤较为复杂，可以使学生更好地理解实验原理，正确使用仪器设备，锻炼学生综合分析问题的能力；设计性实验是指学生根据实验项目，自主设计实验方案，自主准备实验材料，自主配制实验所需试剂，根据自己的时间自主安排实验进程，设计性实验可以充分调动学生的实验积极性，培养学生的创新思维和勇于探索的精神。由此可见，综合性和设计性实验可以锻炼学生综合分析问题和解决问题的能力。③然而目前许多高校由于实验条件和课时安排的限制，细胞生物学实验主要以基本操作和验证性实验为主，综合性和设计性实验较少甚至没有，这在一定程度上限制了学生综合素质和创新思维的培养。④因此，教师应根据科学性、可行性和实用性原则增大综合性和设计性实验的比例。如我们精选了真核生物基因组的提取、纯化、鉴定、扩增、酶切、重组、转化、筛选的大实验，膜蛋白的分离与鉴定等综合设计型大实验，这些实验中的每个实验都构成了一个综合性整体，同时，在实验材料的选择上尽量做到由学生自主选择。通过每一次的综合设计实验，使学生进一步巩固了已学习的知识和已掌握的技术，并能够对实验结果进行合理的正确的资料采集、整理、分析和归纳，有效地培养了学生的科学素质、科学精神、创新思维及分析问题和解决问题的能力。

3.4　组织各种“科学小组”，布置学科发展前沿的讨论，与全程科研训练对接，以培养学生的科学态度和科学精神

在教学活动中，我们采取“科学小组”的组织形式来进行，让学生以小组为单位，对细胞生物学相关前沿研究领域和应用方面的研究进展进行自由探索和讨论，然后开展组与组之间的交流。同时，在进行“原代细胞培养”和“膜蛋白的分离与鉴定”等综合性和设计性实验时，也采用科学小组实验的形式，组内每个学生承担不同实验的角色，而模仿真正”课题工作”。这不仅可以实现教师与学生的多向交流与合作，而且拓展了理论和实验教学的时间和空间。此外，在教学过程中，我们不断向学生介绍周围一些教师的科研计划，并鼓励学生积极参与到教师的研究活动当中，引导学生学会阅读科研文献，以了解其中的科学研究思路和科学研究方法，鼓励他们撰写专题课程论文或综述性文章。通过以上这些方式，一方面可以激发学生浓厚的学习兴趣，另一方面可使学生们在学习中直接体会到科学研究的原过程，以培养学生的科学态度和科学精神。

15.干细胞培养技术 篇十五

体外分离培养小鼠胃Cajal间质细胞的实验方法研究

目的 对KM小鼠胃Cajal间质细胞进行体外分离、培养,并对其进行鉴定,摸索高效实用的方法,为进一步探索研究Cajal间质细胞的移植、替代治疗及药物实验提供基础.方法 以KM株小鼠胃为组织来源,体外分离、培养ICC,并进行细胞传代,光镜下观察其形态,用荧光标记C-Kit特异性抗体标记细胞,进行免疫组化鉴定.结果 细胞稳定贴壁后,形成梭形或三角形突起,3 d后可出现长突起,并可逐渐形成网络连接.结论 酶解法分离细胞成功,但纯度低,数量不足;体外培养ICC 24 h后逐渐稳定贴壁,3 d以后可形成网络连接,可稳定培养3周以上;传代后细胞正常形态逐渐发生变化,20 d后可逐渐凋亡.

作 者：柳利明 农晰婷 秦榕 路明亮 黄华 作者单位：昆明医学院第二附属医院消化内科,云南,昆明,650101刊 名：昆明医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF KUNMING MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：31(3)分类号：Q813.1+1关键词：小鼠 胃 Cajal间质细胞

16.干细胞培养技术 篇十六

实验报告

由于本次实验分三天进行，日期分别为10月31日（周一）、11月2日（周三）、11月4日（周五），实验内容分别为动物细胞培养、结束，动物细胞冷冻以及最后的动物细胞的复苏，又因为冷冻和复苏可视为连续环节，故本报告分成两个部分来记录本次实验，具体内容如下：

I.动物细胞的培养和计数

一、实验目的由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。

本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。

二、基本原理

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。

体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。

体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。

动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清；对于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节pH。

动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。因为动

物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2，点样后其厚度为0.1mm，这样每个方格的体积即为1.0×10-4ml，细胞数的计算公式为：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为： 活细胞数÷总细胞数×100％。

三、仪器、材料和试剂

1.超净工作台

2.倒置显微镜

3.二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为5％。

4.培养基：DMEM培养基，除菌过滤；自制无血清培养基，0.22μm滤膜除

菌过滤。

5.血清：Hyclone新生小牛血清。

6.PBS缓冲液，0.22μm滤膜除菌过滤。

7.胰酶：溶于PBS缓冲液，浓度0.25％，0.22μm滤膜除菌过滤。

8.玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃湿热灭菌，30分钟。

9.血球计数板

10.移液枪

11.台盼蓝染色液：0.4克台盼蓝溶于100ml PBS缓冲液，过滤待用。

四、实验步骤

1.贴附型细胞传代培养

（1）倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基；

（2）用10ml无菌PBS洗涤，倒掉；

（3）加入2ml胰酶溶液（0.25％），进行消化；

（4）显微镜下观察，直至所有细胞由铺展状态收缩为圆球形；

（5）倒掉胰酶；

（6）按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养

箱。

2.悬浮细胞传代培养

按贴附型细胞传代培养步骤（6）操作即可。

3.细胞计数

（1）将干净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙；

（2）待计数样品如果需要，用PBS进行稀释；

（3）取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液（0.4％），用滴管轻轻吹打混

合；

（4）用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球计数板的两个平台上，直至平

台上完全充满细胞悬浮液，（5）显微镜下计数，并按上述公式计算细胞密度；

五、实验结果

通过倒置显微镜的观察计数，得出的结果是，在平台1上四个大方格得到的活细胞总数为206个，死细胞总数为0个，在平台2上四个大方格得到的活细胞总数为210个，死细胞总数为1个。

根据细胞数的计算公式：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

可得到细胞总数为：

平台1:（206+0）×1×104÷4=5.15×105 细胞数/mL

平台2:（210+1）×1×104÷4=5.275×105 细胞数/mL

所以平台1上活细胞比率即细胞存活率为100%，平台2上活细胞比率即细胞存活率为1÷211=0.474%

六、讨论与分析

本次实验根据老师提供的讲义可明显发现几处需要注意的地方：

1.胰酶消化的程度必须掌握好，消化不足则细胞结团，无法分散，这将严重影响传代后细胞的生长，消化过量则会使细胞严重受损；

2.在将细胞悬浮液滴加到血球计数板上时注意不能过量以至于细胞悬浮液溢出平台，同时不能出现气泡；

3.对于稀释比例，应掌握在每个大方格内含25－50个细胞为合适；

4.对于每个大方格中刚好压在边线上的细胞，应当只计入两条边线上的细胞而忽略另两条边线上的细胞，例如将上侧和左侧边线上的细胞计入，那么下边和右边边线上的细胞则不能计入，不论细胞是大半在方格内还是小半在方格内。

稀释实验时，存在不少问题，老师也在事后指出了，因为是垂直式超净工作台，所以在其中进行实验时，要时刻注意需要保持无菌的试剂瓶瓶口位置，不能有遮住瓶口的操作，否则就会有导致染菌的危险，另外，从注意事项2也同时可看出事先没有做好量的粗略估计也可能在实验过程当中造成意外的失误。

计数实验时可能由于对倒置显微镜不太熟练的原因，在计数上花费了不少的时间，这需要在以后的操作实验中不断练习，也同时可能是因为这个原因，计数可能存在一定的偏差，这也必须在今后的实验中注意。另外，从注意事项1和4中，可以看出消化的程度还有计数的方法都将影响到最后的实验结果与准确性，消化的程度更会直接影响细胞的存活率。

II.细胞的冷冻和复苏

一、实验目的细胞在体外长期传代中并不是稳定不变的，它们常常会发生各种变异，表现在形态、生长特性、细胞的结构甚至细胞核型也会发生变异，这些变异往往会导致目标产物的丢失，细胞功能的丧失以及生物安全性方面的问题。因此，在构建好细胞株后需要建立一个细胞库，用低温冷冻的方法将细胞保存起来，以便随时有新鲜的细胞可供使用，确保研究或生产所用的细胞在一定的时间内具有结构和功能的稳定性和一致性。

本实验的目的是让学生学习和了解细胞冻存、复苏的目的和基本操作方法。

二、基本原理

在动物细胞的组成成分中90％以上是水，而水在冷冻过程中会形成冰晶，由于动物细胞没有细胞壁，冰晶会使细胞膜发生破裂而导致细胞死亡，因此要维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亚砜因为其对细胞具有良好的保护性和较低的毒副作用二成为首选。

在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下降速率，实际操作中二甲基亚砜的浓度通常为5－10％，一般来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中对细胞产生伤害的原因主要是解冻过程所形成的局部渗透压波动，通常采用的方法是快速解冻。

三、仪器、材料和试剂

1.程序降温仪

2.超净工作台

3.离心机

4.液氮罐

5.冻存液：10％DMSO＋10％小牛血清＋80％培养液

6.冻存管（无菌）

7.离心管

8.细胞培养操作用具包括方瓶、移液管、培养基等，无菌。

四、实验步骤

1.冷冻过程

（1）准备好分散良好的细胞悬浮液并用台盼蓝染色计数；

（2）离心并将细胞重新悬浮在冻存液中，使细胞密度达到6×106活细胞/ml；

（3）将细胞分装在冻存管中，每支1ml，旋紧冻存管盖子；

（4）静置30分钟，使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡；

（5）将冻存管置于程序降温仪内，设置降温速率1℃/min，－40℃后5℃/min，降温至－

100℃停止；

（6）将冻存管置于液氮罐（－196℃），长期保存。

2.复苏过程

（1）准备好玻璃方瓶、移液管、离心管等（无菌），新鲜培养基；

（2）将冻存管从液氮罐中取出，立即置于40℃水浴中，直至冻存管内细胞悬浮液完全融

解，此过程约1－2分钟；

（3）在超净工作台内将冻存管内细胞悬浮液移至离心管，加入10ml新鲜培养基，离心

（5min，1500rpm）；

倒掉上清液，将细胞重新悬浮于10ml新鲜培养基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。

五、实验讨论

因为冷冻和复苏的实验没有相关需要记录的数据，所以本部分跳过了实验结果这一节，直接进行讨论。这两次实验的注意事项为：

1.涉及和液氮相关的操作，应戴好防护手套以防冻伤；

2.冻存管盖子必须旋紧，否则液氮容易渗入冻存管内，这样不仅可能导致污染，而且

将严重损伤细胞。

可能由于老师考虑到实验过程中的危险性，并没有让我们进行有关于液氮的实验操作步骤，但这两项注意还是值得我思考和借鉴的。这两次实验的重点是冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中采用快速解冻，减少解冻过程所形成的局部渗透压波动对细胞产生伤害。如不注意这两点，会对细胞冻存和复苏后细胞的存活率带来影响。

其实这两次实验的主要内容基本都与垂直超净工作台有关，个人认为老师的用意也是在此，让我们了解实验室中动物细胞不论用在何处，无菌首先是第一位的，因为要考虑到动物细胞的生长周期较长，所以保持无菌操作的必要性就变得尤为重要。