病毒和病毒成份的提纯剖析

病毒和病毒成份的提纯剖析

1.大鲵感染虹彩病毒的诊断和治疗 篇一

关键词：大鲵虹彩病毒；诊断；防治

大鲵（Andrias davidianus），俗称娃娃鱼，属两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是我国特有的珍稀有尾两栖动物，为国家二级保护动物，有很重要的科研价值及药用和营养价值。近年来，随着大鲵人工养殖不断发展，各种疾病也不断暴发，尤其是病毒性疾病，给养殖户造成惨重的经济损失。2013年7月，陕西省商洛市洛南县某大鲵养殖场发生了以大鲵体表和四肢多处溃烂、充血及出血为特征的疾病，经过临床症状观察、病理解剖及实验室检测，诊断病原为大鲵虹彩病毒。现将诊治结果报道如下。

1 基本情况及临床症状

2013年7月，陕西省商洛某大鲵养殖场大鲵突发异常，行动缓慢，摄食减少，前、后肢严重肿胀、溃烂且局部出血，采用肌肉注射青霉素和庆大霉素、头孢噻吩以及中药浸泡等治疗措施均无效，并在治疗过程中陆续死亡，且随着时间的推移，死亡数量越来越大。

2 病理剖检

对病死大鲵进行病理剖检，其结果如下：病死大鲵头部、前、后肢、尾部严重溃烂、肿胀，颈部、腹部、下颌均有大量出血点，腹腔内有淡黄色的积水，肝脏肿大且松软无弹性，胆囊充盈，脾脏、肾脏肿大有白点。

3 实验室检测

3.1 患病大鲵虹彩病毒的细胞扩增检测

取病死大鲵的肝、肾组织各0.5 g于研磨器中加入2 mL无菌水在低温下研磨制成悬液，转移至15 mL离心管，放入-80 ℃反复冻融3次，然后转移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为病毒提取液备用。取一瓶已培养了48 h的EPC细胞，弃去培养液，吸取0.2 mL病毒提取液接种到此培养瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培养液于25 ℃培养，同时做空白对照，24 h有CPE反应，72 h后CPE反应强烈，细胞已完全脱落，确定患病大鲵为病毒感染，见图1和图2。

3.2 患病大鲵虹彩病毒的PCR检测

取前面已经制备的病毒提取液和阳性对照病毒株（阳性对照病毒株选用本实验室分离的大鲵虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小剂量抽提试剂盒的说明书提取组织和细胞分离病毒的DNA。

根据GenBank已发表的蛙病毒属的代表种FV3主衣壳蛋白（MCP）基因高度保守区序列（登录号：AY548484）设计引物用于检测，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

总体积为25 μL的反应体系为：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反应条件为：95 ℃预处理3 min，进行30个循环，每个循环反应包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，用Gene-Genius凝胶成像系统拍照，病鲵病毒提取液检测结果呈阳性，确定患病大鲵为虹彩病毒（CGSIV）感染，见图3。

经过流行病学调查、临床症状观察、病理解剖及实验室检测，该养殖场发生的以大鲵体表和四肢肿大、多处溃烂、充血、出血为特征的疾病，诊断为大鲵虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：标准病毒扩增结果；2：阴性对照；3：病鲵病毒提取液扩增结果。4 诊断结果图3 结果与标准病毒株PCR检测对比

5 防治措施

确诊后，将患病大鲵与健康大鲵进行严格隔离，对养殖场、养殖水体及养殖用具等用聚维酮碘和高锰酸钾彻底消毒。对饵料鱼用高锰酸钾进行浸泡，对未患病大鲵注射大鲵虹彩病毒灭活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，连续注射3次。对患病大鲵注射大鲵虹彩病毒灭活疫苗，注射量为0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，连续注射3次，期间再注射我们自制的中西药结合的抗病毒药物，注射量为2 mL/kg·次，连续注射三天。用药一周后死亡数量逐渐减少。两周后，已无死亡现象，发病的大鲵部分开始摄食，疫情得到了有效的遏制。

6 讨论

该养殖场大鲵被确诊为大鲵虹彩病毒感染，大鲵虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒属Ranavirus中的一种，为双链DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦发病，只能通过注射一些增强免疫和消炎的药物，治标不治本，往往会给养殖户带来巨大的损失。要想遏制病毒病的发生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我们已经研制成功针对大鲵虹彩病毒的灭活疫苗。通过注射大鲵虹彩病毒灭活疫苗，可以有效预防大鲵虹彩病毒病的发生，降低养殖户的养殖风险。

在对该养殖场发病大鲵进行病毒检测时，我们选用的检测方法有细胞扩增和PCR检测两种。通过细胞扩增检测，即使很微量的病毒量也可以检测出，但此方法只能确定是病毒感染而不能确定是那种病毒感染，而PCR检测方法通过与已知标准病毒进行对照，可以确定感染病毒的具体种类，但此方法由于检测过程较为繁琐，常会出现“假阳性”或“假阴性”结果。通过两种方法的结合使用，扬长辟短可以大大提高检测虹彩病毒的准确性。