青藏高原藏族外周血淋巴细胞cDNA文库的构建和鉴定

青藏高原藏族外周血淋巴细胞cDNA文库的构建和鉴定

1.青藏高原藏族外周血淋巴细胞cDNA文库的构建和鉴定 篇一

法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官, 它位于肠道末端、泄殖腔背侧, 是B淋巴细胞发育和成熟的场所, 在禽类早期的免疫反应中发挥重要作用。有研究表明, 法氏囊是IBDV的主要靶器官, IBDV感染后主要在法氏囊B淋巴细胞中复制、增殖[3]。然而, IBDV与法氏囊B淋巴细胞相互作用的分子机理仍不十分清楚。本研究成功构建了法氏囊B淋巴细胞c DNA酵母表达文库, 为进一步利用酵母双杂交系统研究IBDV的感染和致病机制奠定了基础。

1 材料

3周龄SPF白来航鸡, 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供;RNA提取相关试剂, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;酵母双杂交文库构建试剂盒及相关试剂, 购自Clontech公司。其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 法氏囊B淋巴细胞的制备

摘取3周龄SPF鸡法氏囊, 使用4℃预冷的PBS清洗, 置200目铜网上研磨, 然后再次加入PBS冲洗, 将PBS洗液收集于15 m L离心管中, 30 g离心5 min;去除杂质, 将上清液转移至新的离心管中, 510 g离心5 min;弃去上清液, 用PBS重悬沉淀, 510 g离心5 min;弃去上清液, 沉淀用2 m L PBS轻轻重悬;取少许悬液在显微镜下观察细胞形态, 其余细胞悬液用于提取总RNA。

2.2 B淋巴细胞总RNA的提取与鉴定

选用新鲜制备的法氏囊B淋巴细胞, 使用RNAiso Plus (Ta KaRa) 按照操作说明提取细胞总RNA, 用20μL DEPC水溶解, 使用紫外分光光度计测定所提RNA的浓度和纯度, 并进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2.3 c DNA文库的构建

2.3.1 c DNA第一链的合成

按照Make Your Own“Mate&Plate”Library System User Manual提供的方法, 取2μg总RNA, 加入1μL CDSⅢ (Oligo-d T) 引物, 加dd H2O至4μL, 72℃水浴2 min, 冰上冷却2 min, 14 000 g离心10 s;加入2μL 5×First-Strand Buffer, 1μL DTT (100 mmol/L) , 1μL d NTP (10 mmol/L) , 1μL SMART M-MLV Transcriptase, 42℃水浴10 min;加入1μL SMARTⅢ修饰的Oligo, 混匀, 42℃作用1 h;然后72℃水浴10 min终止反应。反应体系冷却至室温后加入1μL RNase H (2单位) , 37℃作用20 min。

2.3.2 双链c DNA的合成

使用LD-PCR合成双链c DNA。反应体系为:c DNA第一链2μL, 10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL, 50×d NTP Mix 2μL, 5'PCR引物2μL, 3'PCR引物2μL, 10×Melting Solution10μL, 50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL, 加dd H2O至100μL, 共做两管。PCR反应条件:95℃30 s;95℃10 s, 68℃6 min (每增加1个循环延伸时间增加8 s) , 共26个循环;68℃5 min。反应完成后, 每管取7μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 检测c DNA条带。

2.3.3 双链c DNA的纯化

将上述两管PCR反应产物合并, 使用CHROMA SPIN TE-400柱子纯化c DNA, 去除200 bp以下的c DNA片段, 将纯化的c D-NA溶于20μL dd H2O中。

2.3.4 酵母感受态细胞的制备

按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Clontech) 所提供方法制备酵母菌株Y187的感受态细胞。

2.3.5 酵母感受态细胞的c DNA转化

将纯化的法氏囊B淋巴细胞ds c DNA与6μL p GADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187, 所用试剂和方法参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual (Clontech) 。将转化后的酵母沉淀用15 m L生理盐水重悬, 取少量悬液用生理盐水倍比稀释至1/10和1/100, 分别取100μL稀释液均匀涂布于直径为100 mm的SD/-Leu平皿, 30℃倒置培养3~5 d, 计算酵母菌落数, 判定转化效率, 转化效率以总菌落数来指示。总菌落数=酵母菌落数 (cfu/m L) ×15 m L。若总菌落数大于1×106cfu, 则本次转化合格。将剩余悬液用无菌玻璃珠均匀涂布于直径为150 mm的SD/-Leu平皿 (约100个) , 倒置培养3~5 d;酵母菌落长出后, 将平皿放置4℃预冷3~4 h, 每个平皿加入5 m L冻存液, 冲洗菌落并收集于无菌玻璃瓶, 混匀后分装成每管1 m L, -80℃保存。

2.4 c DNA文库的质量评价

2.4.1 文库酵母细胞浓度的测定

使用细胞计数板计数所保存文库酵母细胞的数目并计算其浓度。

2.4.2 文库效价的测定

取10μL酵母文库, 倍比稀释至1/1 000、1/10 000, 分别取100μL稀释液均匀涂布于直径为100 mm的SD/-Leu平皿, 30℃倒置培养3~5 d, 通过酵母菌落计数得到文库效价。文库效价 (cfu/m L) = (酵母菌落数/0.1) ×稀释倍数。

2.4.3 文库插入片段的检测

在SD/-Leu培养皿中随机挑取10个菌落, 使用质粒p GADT7测序通用引物T7SPU和3ASPL, 进行菌落PCR, 验证插入基因的大小。具体方法如下:用枪头挑取菌落少许, 溶于10μL dd H2O中, 加入10×Ex Buffer 5μL, d NTP4μL, 上、下游引物各1μL, Ex Taq 0.5μL, 加dd H2O至50μL。反应条件为:95℃5 min;95℃30 s, 58℃30 s, 72℃3 min, 共35个循环;72℃10 min。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 然后将剩余PCR产物送华大生物工程技术服务有限公司进行测序, 以确定插入基因的种类。

3 结果

3.1 法氏囊B淋巴细胞的制备结果

制备的法氏囊B淋巴细胞形状均一, 状态良好 (见图1) , 经计算细胞浓度为2×108/μL。

3.2 B淋巴细胞总RNA的提取与鉴定结果

经紫外分光光度计测定, 法氏囊B淋巴细胞总RNA浓度为2.44μg/μL, OD260/280值为1.9。琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S RNA3条带, 见图2。

3.3 双链c DNA的合成及纯化结果

使用LD-PCR方法扩增得到ds c DNA, 经琼脂糖凝胶电泳, 可见呈涂布状分布的电泳条带, 介于200~5 000 bp之间, 见图3。

1.细胞总RNA。

M.DL-2 000 Marker;1, 2.ds c DNA;3.DL-15 000 Marker。

3.4 文库的质量评价结果

3.4.1 转化效率

法氏囊B淋巴细胞c DNA和线性化的空载体共转化Y187, 在1/100稀释度的SD/-Leu平皿中有322个酵母菌落生长, 计算可得文库总菌落数为4.8×106cfu, 高于参考标准1×106cfu, 说明文库制备时转化效率较高。

3.4.2 文库酵母细胞浓度的测定结果

文库的酵母细胞浓度为5.2×107个/m L, 高于参考标准2×107个/m L。

3.4.3 文库效价测定结果

在1/10 000稀释度的SD/-Leu平皿中有950个菌落生长, 计算可得文库效价为9.5×107cfu/m L, 高于参考标准2×107cfu/m L。

3.4.4 文库插入片段的检测结果

在SD/-Leu培养皿中随机挑取10个菌落, PCR结果表明, 重组率为100%;测序结果表明, 这些序列均为鸡源序列。见表1。

%

4 讨论

酵母双杂交技术在1989年由S.Fields等[4]发明, 经过不断改进与发展, 该技术已经成为研究蛋白质之间相互作用的重要方法之一[5,6,7]。与其他蛋白质研究技术相比, 该技术具有其独特的优势:灵敏度高, 可以检测到蛋白质间微弱的相互作用;由于融合蛋白之间的相互作用发生在真核酵母细胞内, 蛋白质可能保持其天然的折叠状态, 由该系统检测到的蛋白质之间的相互作用更接近于体内的真实水平[8]。

研究根据Clontech公司的Make Your Own“Mate&Plate”Library System User Manual所提供方法构建鸡法氏囊B淋巴细胞c DNA文库, 提取法氏囊B淋巴细胞总RNA, 采用SMART技术来合成c DNA, 不需要添加接头, 提高了连接效率。使用LD-PCR技术合成了质量较好的c DNA, 通过同源重组将这些片段克隆入酵母载体p GADT7。与以往酵母双杂交文库构建的方法相比, 该方法更加简单, 而且文库质量也较好。

构建文库时选择了IBDV强、弱毒株均可感染的法氏囊B淋巴细胞, 是基于其在IBD发生中所起的重要作用。有研究表明, 人为去除法氏囊的鸡感染致死量IBDV后不表现任何临床症状[9]。3~6周龄的雏鸡对IBDV最易感, 其他年龄段的鸡也可感染该病毒。IBD的急性发病期持续7~10 d, 期间法氏囊中B细胞迅速坏死、减少, 法氏囊萎缩, 并伴有结缔组织增生。IBDV进入机体后首先在肠道相关巨噬细胞和淋巴细胞中复制, 进入血液循环造成原发性病毒血症。感染后4小时, 盲肠巨噬细胞和淋巴细胞内可检测到病毒;感染后5小时, 病毒抵达肝脏;感染后1 1 小时, 病毒到达法氏囊并在其中复制, 随后病毒再次进入血液并向其他组织扩散, 继而引起发病[10]。此外, 法氏囊中B细胞的发育阶段也对IBDV的复制有重要影响, 而IBDV与法氏囊中相关因子的相互作用是IBD发生的关键。

本研究构建了鸡法氏囊B淋巴细胞c DNA酵母表达文库, 为应用酵母双杂交技术来研究IBDV与宿主的相互作用奠定了基础, 对进一步揭示IBDV的致病机理有重要意义。

参考文献

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