pcr实验室

pcr实验室（精选13篇）

1.pcr实验室 篇一

PCR实验室基本要求

1、主体结构：

主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。

2、标准的三区分隔和气压调节：

将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区Ⅰ，缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。

3、消毒：

在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。

4、机械连锁不锈钢传递窗：

试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。

5、地面

地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少800mm×800mm）接缝需要小于2mm。

6、照明

灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。标准的PCR实验室在建设的过程中应注意： ●规范的安装流程和全面的服务流程。●严格按照规范科学设计的安装流程。

●安装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。PCR 实验室基本要求

2.1 PCR 实验室依据所使用的方法可分为试剂准备、标本制备、扩增、产物分析等三或四个区域。只是使用实时荧光PCR仪、HIV病毒载量测定仪的PCR实验室，有上述前面三个区域即可。各区域应完全独立分隔，不应有任何的空气直通。

2.2标准的PCR实验室产物分析区或三个区域的最后一个区域（即扩增及产物分析区），空气流向应由室外向室内，可通过在室内设置通风橱、排风扇或其他排风系统达到空气流由室外向室内流动的要求。

2.3 PCR实验室各区域仪器设备配备通常如下： 2.3.1标准的PCR实验室 试剂准备区: 仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。2.3.2 标准的PCR实验室 标本制备区

仪器设备主要应有生物安全柜（最好为B2, 可避免提取核酸在柜内反复循环，造成标本间交叉“污染”，出现假阳性结果。此外还应配备加样器、台式高速离心机（冷冻及常温）、台式低速离心机、恒温设备（水浴和/或干浴仪）、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。

2.3.3 标准的PCR实验室 扩增区 主要仪器就是核酸扩增热循环仪（PCR仪，实时荧光或普通的）。热循环仪的电源应专用，并配备一个稳压电源或UPS，以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外，根据工作需要，还可配备加样器、超净台等。2.3.4 标准的PCR实验室 产物分析区：

本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪（槽）、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、DNA测序仪、酶标仪和洗板机等。

在理想情况下，PCR实验室试剂准备、标本制备、扩增三个区域可设置缓冲间。在缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。PCR实验室平面布置示意图

一般实验室间隔材料分:彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上, 主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行

一般实验室间隔材料分:彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上, 主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行

**卫生部PCR研究员李金明(卫生部临床检验中心临床免疫室主任,研究员)的PCR建设方案再说吧！国外的资料不一定是最好。个人觉得李金明的实验室区正压（扩增分析区因为没有缓冲，所以为负压），缓冲间负压的作法可以更好的防止气体的外泄及防止试剂准备区、标本制备区、产物扩增区、扩增分析区四区之间的气体相互渗漏。PCR实验室也可以分为三个区，即第三、四区合为一区，必须设立缓冲间。有条件建设实验室采用三十万级的标准来建设。空调系统采用制冷剂各区独立循环，可以防止气流交叉。**疾病预防控制中心实验室建设之PCR 实验室基本要求: PCR实验室可以是分散形式，也可以是组合形式。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程，若实验工艺需要，还应增加样品粉碎过程。

2.pcr实验室 篇二

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增105~107倍,将检测阈值降至1~10拷贝用于基因表达检测,使低拷贝临床标本的检测成为可能。荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。该技术使PCR实现了从定性到定量的革命性飞跃,具有特异性较强、灵敏度高,简便快速等优点。近年来,PCR技术在临床医学中得以快速应用,特别是在肝炎、结核、艾滋病、性病、SARS等病原微生物诊断以及部分遗传性疾病诊断和癌症的辅助诊断等方面的应用[1,2,3]。

2 临床定量PCR实验室管理

临床定量PCR实验室由卫生部管理,依据国家卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)、《临床基因扩增检验实验室工作规范》(卫检字[2002]8号)、《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(2002-1-14)、《临床基因扩增实验室申请表》及《临床基因扩增实验室验收表》执行。实验室申办程序包括:(1)填写调查表,由省临检中心审核;(2)正式填写申请表,上报卫生部临检中心;(3)评审由卫生部、省专家参加,并报省卫生厅备案;(4)合格单位名单由卫生行政部门在媒体公示。临床定量PCR实验室应具备以下条件:标准的实验室设计设置、专业的技术人员、标准操作程序(SOP)和质量管理文件等。

2.1 实验室设置及人员管理

在实验室设计上,建立单流向、一体化的临床定量PCR实验室是安全准确进行基因扩增检验和保障生物安全的重要措施[4]。其具有理想的布局结构、标准的风向设置、严谨的防护措施、简明洁净的外观、合适的环境条件与参数等。它具体包括建设好“3个实验区”(试剂准备区、标本制备区和PCR扩增区及其各自缓冲区)和“3个系统”(单向气流控制系统、单向物品传送系统、生物安全控制系统)。对于人员管理,首先应制定一系列规章制度。检验人员要严格遵守操作规程,制定日常工作中的质量控制流程,严格执行查对制度和考核制度,具有实事求是的工作作风。检验人员必须满足以下条件:(1)经有资质的单位培训,考试合格取得上岗证后持证上岗。(2)专业主管为本科以上学历和中级以上职称3 a以上工作经历。(3)工作人员须有专业技术职称。(4)培训单位须由省卫生厅指定,经卫生部临检中心认可。

2.2 实验室操作规程的规范化

建立符合当今实验室的管理模式,形成管理文件,包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序(SOP)等。质量手册主要包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员管理、实验室设施环境、仪器设备、生物防护措施、标准操作程序、标本管理、记录、报告、应急处理及实验室的工作制度等。SOP文件是最具体、最具可操作性,也是使用频率最高的文件,其精髓就是使所有与实验室检验质量有关的环节都有章可循,要让每一个操作人员都了解并严格遵照执行管理制度和标准操作程序。此外,所有实验的原始资料均应存档;所有的记录均应规范登记在册;原始登记表应记录试剂来源、批号,质控血清的来源及测定值,并注明是否在控;检验者及审核者应签名。如果实验结果对临床诊断有决定意义,其样本应留存,至少要与病历的保存期一致。规范化的管理和操作保证了实验结果的准确性和可靠性,而且便于各项数据资料的核实。

3 临床定量PCR实验室的质量控制

PCR技术自Mullis创立以来广泛应用于多种疾病检测,但PCR测定不同于一般临床检测,由于其灵敏性很高,即使有极少量DNA污染也会造成假阳性,因此对实验条件要求非常严格。检验者在操作过程中必需牢固树立“无基因观念”,严格操作规程,防止一切可能的污染,包括以前的扩增产物、天然基因组DNA、试剂配置、气溶胶、实验所用的器具等。一旦发生污染,实验即不能进行,而且查找污染源非常困难,因此避免发生污染重在预防,并贯穿于PCR检测的全过程。因此质量控制在PCR检测过程中尤为重要。

3.1 室内质量控制

室内质量控制是指一个实验室内部对所有影响质量的各个环节进行系统控制。目的是控制本试验室常规工作的精密度,提高常规工作前后的一致性。临床PCR实验室应开展所有检验项目的室内质量控制,并做好记录和分析[5]。PCR检测包括标本采集、核酸提取、基因扩增、产物检测等步骤,每个步骤都应有相应的质控措施。其中最关键的是标本采集和核酸提取,按照卫生部临床检验中心《临床基因扩增实验室工作规范》严格执行。室内质控贵在坚持,重在不断总结提高。

3.2 室间质量评价

室间质量评价是实验室质量控制体系中的重要部分,是保证患者检验结果及其报告的准确性和可靠性,以及各实验室间结果可比性的重要手段。卫生部临床检验中心组织的全国性室间质量评价活动现已扩展到细菌、免疫、血液、体液、治疗药物监测、分子诊断等领域。临床PCR实验室应积极参加省、市及卫生部临床检验中心组织的各项活动,如实验室室间质量评价、质量评价总结会议、研讨会和学习班,各医院间相互学习、沟通和交流,不断改进和完善本实验室的质量管理。实事求是地汇报室间质评结果,认真地研究反馈的评价信息。接受卫生部或省临检中心的现场调查,如果1个质评项目连续2次成绩不合格,整改并停止项目收费3个月。及时发现问题,做好失控分析和记录,找出问题所在,采取相应措施,力求实验室结果准确、可靠、及时、可比,更好地服务于临床。

4 小结

随着PCR实验室管理方法的不断完善,新试剂盒的相继推出,实验室设备的改良及实验方法的不断改进,定量PCR技术已经发展成为日益强大和用途广泛的技术。此外,PCR技术不同于常规的检验技术,必须按照PCR实验室的一系列要求开展工作才能保证操作的安全性和结果的可靠性。可以预计,PCR技术将会给临床医学检验方法带来一场巨大的变革,并逐步进入我国卫生机构的各级实验室,更好地为临床某些疾病的早期诊断和治疗提供服务。

参考文献

[1]Khodakov D A,Zakharova N V,Gryadunov D A,et al.An oligonu-cleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1,HBV and HCV[J].Biotechniques,2008,44(2):241-248.

[2]Yu C H,Liu L T,Liu S,et al.Enhanced-real time PCR:a highly sensitive method for SARS-coronavirus detection[J].Beijing Da Xue Xue Bao,2006,38(2):211-213.

[3]Matsenko N U,Rijikova V S,Kovalenko S P.Comparison of SYBR Green I and TaqMan real-time PCR formats for the analysis of her2gene dose in human breast tumors[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(2):240-244.

[4]江其生,金济民,李峰生,等.单流向一体化临床定量PCR实验室的优化设计与设备配置[J].医疗卫生装备,2006,27(9):34-36.

3.PCR检验实验室检查要点指南 篇三

北京市医疗器械技术审评中心（100061）郑婕 冯路 赵阳 王辉

摘要：目的目的 明确体外诊断试剂生产企业PCR检验实验室设置和管理相关要求，指导并规范监督管理部门开展现场检查工作。方法方法 采用收集相关文献资料、结合北京市生产企业现状、组织企业验证、经过相关专家讨论、公开征求意见后最终确定主要检查要求。结果与结论结果与结论 要点指南从实验室布局、仪器设施配置、现场及文件检查工作流程及注意事项、人员培训情况四个方面描述了现场检查重点关注的内容。关键词：PCR检验实验室；检查要点指南；工作流程；注意事项

中图分类号：R955 文献标识码：A文章编号：1005-8257（2015）11-0004-02 PCR检验实验室是指通过基因扩增的方式检测特定的DNA或RNA的检验实验室。聚合酶链反应（PCR）是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的技术，其基本过程为模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火和在DNA 聚合酶引导下的链延伸反应三个阶段的多次循环。每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板，理论上，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后，产物量增加到2n倍，在短时间内可在体外可获得数百万个特异靶DNA序列的拷贝。PCR检测试剂越来越成为临床疾病的诊断治疗监测、预后评估的重要手段。PCR检测试剂生产企业也越来越多。但在实际检查中，笔者发现，各个企业PCR检测实验室设置各不相同，管理方式千差万别。

PCR检验实验室是PCR试剂的生产企业在产品检验过程中不可缺少的工作环境，其环境控制水平和质量管理水平直接影响着最终产品的质量。由于该产品本身的特殊性，《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》中，明确对PCR试剂的生产和检验环境做出了规定。《PCR检验实验室检查要点指南》旨在指导北京市医疗器械现场检查人员对PCR检验实验室的现场检查工作。同时，为PCR类体外诊断试剂生产企业在PCR检验实验室的设计和管理要求方面提供参考，将于年内正式发布。1 适用范围

本《指南》可作为北京市食品药品监督管理局组织、实施的《医疗器械生产许可证》核发、变更、换证等现场检查，体外诊断试剂生产实施细则检查，医疗器械生产监督检查等各项涉及PCR检验实验室检查的参考资料。基因测序检验实验室等涉及PCR实验的相关部分应参照本《指南》执行。2 检查要点及流程

2.1 现场观察企业PCR检验实验室布局 PCR检验实验室的设计决定了检验环境的优劣，企业应提供PCR实验室设计方案和/或平面设计图（应标明风向或压差梯度）。①为防止在检验过程中产生的气溶胶对生产过程的不利影响，按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，PCR检验实验室与PCR产品生产区域应在各自独立的建筑物中。②原则上PCR检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。根据使用仪器的功能。区域可适当合并。若使用实时荧光定量PCR仪且不需要进行后续产物分析工作，扩增区、扩增产物分析区可合并[1]。若使用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分 析区可合并。

③各区域在物理空间上应完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态。不应只是形式上的分区，不应一个区域嵌套一个区域。④各区域不应有空气的直接相通。扩增区与扩增产物分析区各区域宜采用独立直排方式出风。采用空调机组方式的，PCR实验室应具备独立空调机组；同时应考虑停机后各房间空气连通的可能性，采取必要的控制措施。

4.PCR实验常见问题 篇四

作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。1假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。3出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。二.PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因

(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。对照试验

1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法

(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。

(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。

5.pcr实验室 篇五

1、技术档案：

技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件

2、仪器档案：

实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等

实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。

扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。

5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值

3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。仪器简单操作流程

标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。仪器的申请、采购、使用、验证程序

样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序 样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本

标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。

检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。

抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认

注 意 事 项

1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致.“写你所做的,做你所写的”.2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如“消毒时间一到两小时”不能这样写,多少就是多少.3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外.4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程.5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用.6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为)

7、所有仪器、设备都要有档案卡.8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。

9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚.10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制度、硬件、意识。

11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风.12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充.13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾.14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记等.15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单.16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管.17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,只能报数值.18、SOP文件中PE5700的温湿度要求应该为温度15－30℃、湿度为< 80％。

19、SOP中

医院申报实验室注意事项

专家组参观实验室回答的问题

1，“你们的冰箱的铁链我可以从底下抽上来，实验室能做好保密性吗？

可以的，你们能做到就行，注意保密！

2，实验室需要配置冷冻离心机，生物安全柜，如果做HCV时,注意重新添置新实验室。

3，生物防护中是否有锐器的防护注意事项？ 4，实验室的温湿度计的放置位置？ 最好放在实验室内。

5，实验室中如何做好离心管抑制物的检测？ 而非爆管、裂管的检测！

6，在做HCV时规定从抽血化验到送达实验室要几个小时要有明规定！3小时左右！

7，溶血标本有何具体的判断标准？脂血呢？

实验室末次会议的提问

1，你们单位（达安）试剂，当我们新鲜标本做HBV时，提取中40微升+40微升提取液处理，待放置过夜后，第二天加样时，有的标本特难取样，有何处理办法？ 2，实验室中垃圾你们如何处理的？

3，实验室中阴性标准检测后变成阳性你怎么办？（我们实验室一共有三管阴性阴性对照，第一个阴性检测管是试剂什么都不加，直接上机，第二个阴性检测管是试剂中加入在实验开始时打开盖的1.5离心管带有蒸馏水的，第三个阴性检测管是与实验一起提取的阴性血清。）4，实验中如果阳性质控，阳性梯度，标本呈阴性请分别解释？ 5，实验室必须配置生物安全柜，高速离心机！

临床基因扩增检验实验室技术验收现场问卷

（口试和/或笔试）

一.现有一个患者向你提出：“我在你们医院检测HBV DNA为阳性，但在另一家医院检测为阴性，你们医院是怎么做的检测？”，此时，你怎么办？

（该题主要是考实验室人员是否知道并遵守所制定的抱怨处理程序）

二．现有一个临床大夫拿着几张HBV DNA定量PCR检验报告单找到PCR实验室，说：“你们的PCR结果到底准不准，我这个病人刚开始检测，HBV DNA是57×10拷贝数/ml，用了拉米呋啶治疗后二周，再检测结果为3×107拷贝数/ml，降了不少，但再过二周检测，又变成了6×107拷贝数/ml，升高不少，这到底是怎么回事？”，如果这个大夫刚好问的是你，你怎么办？并如何解释其提出的问题？

(该题除了考实验室人员是否知道并遵守所制定的抱怨处理程序外，还要求其对特定PCR检验的批间变异有充分的认识)

回答思路：

这两题分别对应患者和临床医生提出的抱怨。考点为你是否按照所制定的程序来处理：无论是患者还是医生提出抱怨，我们都应该“按照”程序先记录抱怨人姓名、抱怨内容等，然后等问题解决后记录处理结果等，最后记录反馈意见等。

注意：一般问题中出现“此时，你怎么办？”，其考核的重点均为“形式”而非“内容”。所以题目中无论病人抱怨的是服务态度不好还是结果报告不准，医生抱怨的是检测结果和临床诊断不符还是报告发放不及时，回答的方向都应该是：“我们接待他们后，先在登记表上记录抱怨的什么什么相关信息，做相应处理，解决后记录处理结果，最后填反馈表，归档总结，跟着以后改进等等等等”。对各种具体问题的处理就按照实际情况来回答就行。

如果题目中出现要你具体“解释某某提出的问题”时，这时是具体考察某一“内容细节”了。第二题中看你对PCR检验的批间变异有否充分的认识：一般PCR检测试剂盒存在着一定的批间甚至批内差异，而且PCR检测前处理也存在着一定的误差，分析软件相关参数的选择也会使定量结果发生变动，这是方法学造成的不可避免的事实。同一操作人、同一仪器、同一批号试剂、同一份标本同时做多份平行管，得到的结果都会不尽相同。所以我们都会允许结果存在一定范围的偏差，一般为一个数量级的拷贝数。5×107、3×107和6×107均在允许的误差范围内，排除了各种影响因素后，出现这种情况很正常，这说明了该病人用药效果不佳。若定量结果有1～2个数量级甚至更大的变化才能反映用药疗效。

三．现有一人打电话到科室，说：“我孩子在你们医院做了一项丙肝的PCR检测，名字叫XXX，请你告诉我检测结果好吗？”。如果是你刚好接了这个电话，你会怎样去做？

（该题考的是实验室人员在患者要求以电子邮件、电话、传真等方式传递报告时，是否能按相应的程序去做）

回答思路： 也是考形式。“对于这种非正常的报告发放形式，我们按照程序，是这样这样处理的。”因为各个医院实际情况不同，所以无论你怎样处理，只要程序中体现了对患者结果的保密原则，具体细节不会太要求。

在程序中按以下几个方式写都是可以的：

1、我们均不以任何非正常形式发放报告。（最干脆！就是有点不近人情，不过对我们来说省事）

2、实在有特殊情况，可以电话查结果，其它发放形式不行。但必须确认身份，包括核对其所查询的患者姓名、性别、年龄、检测项目、送检医生、送检日期、病区床号等情况，并提供患者ID号。

3、可以通过电话、图文传真、电子邮件等形式传送结果，和上面一样，需要核实身份。（最宽松了，不过麻烦了很多）

要注意的是：这些情况均应明确告知查询者，这几种非正常形式发放的报告均仅为临床提供参考，实验的最终结果以正式检测报告单为准。特殊情况报告发放后需详细登记，签署报告人姓名，实验室负责人签字。

“报告的正确发放”为考核重点，一般可能还会引申出“你们是如何发放检测结果报告？”之类的问题，按照程序中写的实际情况回答就行的了。只要遵循保密原则就OK。

最简单的无非把事情都推给医院：说门诊患者报告单送至服务台门诊报告发放处，由那里的医生确认身份后发放。（具体她们是怎么确认、确不确认这已经不关我们的事了）。

若写病人到科室领报告也行，只是“我们怎么确认病人身份”要在程序中体现：询问相关信息、根据收费单或病历唯一条形码（若医院采用计算机网络系统）确认等等。

四．现有你科室同事，拿了一份血清标本给你，说：“这是我一个熟人的标本，他要做HCV RNA检测，刚好他还做生化和免疫检测，我从生化标本分了一些出来，给你做HCV RNA。”你觉得这样行吗？为什么？

（该题主要是考实验室人员对有关标本的收集程序是否清楚并遵守）

回答思路：

问到了“为什么？”表示具体考到细节了。按照我们的收集程序，做PCR尤其是RNA项目需要独立取血，不能从其它检测的标本中分出一些来做。而且对RNA标本的采集、保存、运输都有严格的要求。

一般验收组会对这类问题加以引申。问你每天标本在哪儿采集？采血的人员有否经过专门培训？采集的标本如何保存？

还可以顺便问你结果发放后的标本如何保存、保存在哪儿？保存多久？甚至要你把这多久多久前的标本拿出来给他们看。

五．某一天，你在做HBV DNA荧光定量PCR检测（方法的定量测定范围为103～107拷贝数/ml）中，发现有1份标本的测定Ct值超出方法的测定上限，此时你怎么办？对于没有特异扩增曲线的标本你又怎么报告结果？

回答思路： 此为具体问题：题目已经假设了方法的定量测定范围为103～107拷贝数/ml，我们就按照这个假设来考虑。先看是否为特异扩增的曲线（即看曲线是否为标准的S形曲线），若为标准S形曲线表示的确为阳性标本，Ct值超出检测上限，表示未知标本HBV DNA浓度过大，不在检测线性范围内，应该进行浓度梯度稀释（1/

10、1/100、1/1000„„），重做实验，看哪个梯度处于线性范围内，得到原始浓度乘以相应稀释倍数即得。

若不是特异扩增的曲线（也就是常见的那种前面翘、与阈值线有交点的阴性曲线，计算机不会具体分析，见有交点就给Ct值，而且Ct值还很小，小于测定上限的Cycle数），按阴性报。

六．在PCR检测的核酸提取离心中，如发现有一管离心管出现破裂，此时你怎么办？

（该题是考实验室人员对于其制定的实验室及仪器设备消毒清洁程序是否知道并遵守）

回答思路：

按照离心机的消毒清洁程序：必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾 桶，再用75%酒精擦拭离心室消毒，用移动紫外灯照射30～60分钟后才能开始实验。

可以引申出：离心管破裂，可能质量有问题，为防止以后同类事情的发生，按照耗材质检程序进行离心管质检实验，若不合格停止使用，重新购买并进行质检，合格的耗材才能使用。

七．有一个PCR实验室的荧光定量PCR仪如ABI 7000因某种原因搬动到了另一个实验台面，实验室只是将仪器外表面擦了擦，即用于常规扩增检测工作，你觉得该实验室做得对吗？为什么？

（该题是考实验室人员对于其制定的PCR仪校准程序是否知道并遵守）

回答思路：

考核实验室人员对于其制定的PCR仪校准程序是否知道并遵守。仪器移动应该按照程序进行校准后才能重新用于常规扩增检测工作，以保证实验结果。

7000型核酸扩增荧光检测仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师 进行。实验室联系仪器厂家派技术人员来校准仪器。

平时就算不搬动仪器，实验室也应与仪器厂家达成协议，定期校准仪器。八．有一位实验室工作人员在做PCR实验中，一开始将化验单带至标本处理区，核酸提取完成后，进入了扩增区，但将化验单忘在了标本处理区，此时，他应该怎样做？

（该题是考实验室人员对于其制定的实验室单一流向工作程序是否知道并遵守）

回答思路：

6.pcr实验室 篇六

1 材料与方法

1.1 样本来源

所检测的200份咽拭子样本均采自佳木斯市中心医院门诊部患者, 主要是具有发热症状的呼吸道传染性疾病病例。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒 (KIT 74104) 及RT-PCR反应体系试剂盒 (KIT 210212) 均为德国QIAGEN公司产品;FQ-PCR试剂盒为北京金豪公司生产, RT-PCR引物购自大连宝生物公司, RNA酶抑制剂 (promega) 由上海生物工程公司提供。

1.3 主要仪器设备

Z233MK-2台式高速小型离心机购自德国Eppdendorf公司, 7300基因扩增仪购自美国ABI公司, Gene Genius凝胶成像分析系统BIO-RAD购自美国伯乐公司, FS-91自动DNA扩增仪购自上海复生生物公司。

1.4 方法

病毒RNA提取、FQ-PCR、RT-PVR、扩增产物电泳分析方法均按试剂盒及仪器操作说明书进行。

2 结果

2.1 2种方法检测的阳性率结果

在200份来自临床的咽拭子检测标本中, 用FQ-PCR检测后甲型流感病毒检测阳性的为96份, Ct值最小为12.95, 最大为24.63, 阳性率为48.0%;用RT-PCR检测后结果甲型流感病毒检测阳性的为69份, 凝胶条带在235bp处出现, 阳性率为34.5%。2种方法检测的阳性率差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

2.2 2种方法全程检测所需时间

FQ-PCR:RNA病毒提取需1 h, 配制反应体系及实时荧光RT-PCR反应需2.0～2.5 h, 整个过程大约共需要3.0～3.5 h。

普通RT-PCR:RNA病毒提取需1 h, 实验设计及PCR反应体系配制约需1 h, RT-PCR反应约需4 h, RT-PCR产物检测约需2 h, 整个过程大约共需要8 h。

3 讨论

FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测, 从而实现对起始模板定量及定性的分析。在FQ-PCR反应中, 随着PCR反应的进行, PCR反应产物不断累计, 荧光信号强度也等比例增加[1]。通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进行定性及定量, 它具有灵敏度高、特异性强、所需时间短的优点, 并且实现了PCR检测的密闭操作, 克服了普通RT-PCR易污染以及强致癌物溴化乙啶对操作人员的危害的缺点, FQ-PCR则更体现了其应用的价值[2]。

摘要：目的 比较实时荧光PCR检测 (FQ-PCR) 与RT-PCR在鉴定甲型流感病毒中的优劣, 建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法 对200份临床采集的咽拭子样本进行FQ-PCR与RT-PCR检测, 综合比较2种监测方法之间的差异。结果 FQ-PCR检测200份临床咽拭标本, 96份甲型阳性, 阳性率为48.0%;从RNA提取到检测结果仅需3～3.5 h。RT-PCR检测200份临床咽拭标本, 69份阳性, 阳性率为34.5%;从RNA提取到检测结果约需8 h。结论 FQ-PCR方法快速、特异、灵敏, 在甲型流感病毒检测中具有较大的应用价值。

关键词：实时荧光PCR,RT-PCR,甲型流感病毒

参考文献

[1]程晓雯, 周丽, 赵锦, 等.荧光定量RT-PCR在流感病毒检测上的应用.中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18 (3) :289-290.

7.PCR自我鉴定 篇七

1. PCR mix的制备

Taq buffer(10×) 20 μL

(转 载于:wWw.cnboThwiN.cOM 博 威范文 网:pcr室自我鉴定)

dNTP(2.5 mmol/L)5 μL

Primer Forward(50 mmol/L) 10 μL

Primer Reverse(50 mmol/L) 10 μL

ddH2O 147 μL

Taq(2U/μL) 8 μL

total 200 μL

将上述溶液混匀，10 μL每管分装于200 μL PCR管中。

2. 常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝;然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下(管子做好记号，将平板上点的克隆标号与管子上的对应起来，以便筛选到克隆后进行扩繁培养)，盖紧管子。

3. 将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。PCR反应程序根据具体的引物设置，参考下列程序：

95℃，3 min

95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30个循环

72℃，10 min。

4. 电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。(取5 μL PCR反应液与1 μL上样缓冲液混合，进行1% 琼脂糖电泳，5V/cm，选择适当大小的DNA分子量标准，检查扩增产物。紫外观察PCR产物是否与插入片段大小一致?)

5. 将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增;次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，尽可能安排在早上做PCR，下午就可以提质粒，得到重组载体。

(七)菌液PCR鉴定转化子

1. 取培养过夜的转化菌液20 μL，沸水浴3～5 min。

2. 室温12 000r/min 离心2min。取上清液作为PCR的摸板，按下列反应体系配制

ddH2O 13.5 μL

10×PCR Buffer(25mM Mg离子) 2 μL

dNTP(10mM each) 0.5 μL

Primer l(20μM) 0.5 μL

Primer 2(20μM) 0.5 μL

模板DNA2 μL

TaqDNA聚合酶(2.5U)1 μL

总体积20 μL

3. 加一滴液体石蜡，混匀，短暂离心。

4. 在PCR仪上进行PCR反应。参考下列程序：

95℃，3 min

95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，50 s，30个循环

72℃，10 min。

5. 电泳检测是否得到目的片断。

1 最简单的：用枪尖或者牙签从平板或液体中沾少量菌(多了就会影响反应了，沾上点就够了)，直接加入到PCR体系中反应就行了，依靠变性温度来破裂细菌释放DNA，我一直这样做大量筛选。

2 旁边实验室的方法：用枪尖或者牙签沾少量菌，加入到没有加酶的PCR反应体系中，沸水浴5min，冷却后加入酶，开始反应，有些不容易加热破裂的菌预先煮沸一下，可以释放更多的DNA，有利于PCR反应。

3 用Chelex，旁边的旁边的实验室做菌种鉴定的时候习惯用的方法：可以去除一部分杂质，降低PCR反应所受的干扰。

1) 5%-10%chelex 50μl(配法：5-10g chelex 加入100ml TE)+菌苔，在管壁适当研磨，震荡混匀，短暂离心

2) 煮沸：细菌5min，放线菌10-15min

3) 冷却至室温，10000-1rpm离心5-8min，取上清扩增

注：chelex方法适于细菌、放线菌，chelex提前在65摄氏度水浴中预热，溶液有细小颗粒，吸取时枪尖最好先剪掉，否则不好吸。

这3个方法由简到繁，效果当然是依次提高了。我理解，这样的直接以细菌为模板进行PCR反应，特别是前两种，适用于大量的筛选和验证，由于加入了细菌本身的其他物质以及难免引入的培养基成分，可能会对PCR反应造成干扰，假阳性假阴性都是可能出现的，所以之后最好还要进一步验证。chelex方法可以去除一定的杂质，干扰较小，但是毕竟也不如直接以DNA为模板效果好。楼主需要根据自己的实际需要来选择合适的方法。

把PCR MIX加好，最好把细菌用TIP沾点就可以了。变性温度也不变，时间可长点儿，容易。

我也这样做过，96度变性时延长为10min左右，几乎都能扩增出来。

8.pcr实验室 篇八

检验0905郭媛媛

PCR是我们研究 分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。

摘要：PCR(ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。

关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大 1 引言

人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。

20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，这就是我要介绍的PCR技术。2 PCR技术原理

下面我通过摘录了一个实验[2]，来介绍一下PCR技术的过程及其原理(至于它详细的实验过程和方法详见参考文献)。.在94°C高温下双链变性，分离出DNA单链的模板，然后降温(55°C)，然添加的与DNA单链配对，紧接着温度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸开始渗入，并从引物的结合端开始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互补链，这一过程称为一循环，然后重复该循环，模板DNA被大量复制。

在此，我要特别强调几点注意事项，这也是这个实验设计者提醒我们需要注意的地方：

(1)在配置PCR反映体系的过程中，Taq酶应在加入dNTP混合物后加入，因为有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反应较强，反映体系如果不含dNTP，反应体系中的引物可能被分解。

(2)非特异性扩增产物，可能是模板有与引物同源性高的其他位点，其次是复性温度太低，适当提高复性温度就可以解决这些问题。

以上实验可清楚明了地向我们展示PCR技术的原理。3 PCR技术分类

PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历了20年的飞速发展，是传统微生物学与现代基因学之间的完美结晶，已成为当今世界上不可或缺的一项重要的微生物应用技术，下面我将介绍几种常用的PCR技术[3] 3.1反转录PCR 反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子为模板的扩增技术，主要用于克隆cDNA、检测RNA病毒、合成cDNA探针机构建RNA高效转录系统。3.2定量PCR 定量PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反应产物的数量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通过琼脂糖电泳样品条带得比较，便可以确定两种PCR产物之间的数量关系。另外定量PCR还有广义和狭义之分[4]，在此就不详细介绍了。3.3实时荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用映光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。3.4重组PCR 重组PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上进行点突变，即扩增产物中含有域模板序列不同的碱基。利用重组PCR可造成DNA片段的碱基插入或缺失，从而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR 反向PCR(inverse PCR IP-CR)是对一个已知的DNA片断序列两侧的未知序列进行扩增和研究的技术。3.6多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)即在同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。多重PCR可同时检测多个突变位点或病原生物，有利于遗传病和感染性疾病的诊断。3.7不对称PCR 不对称PCR(asymmetric PCR)即在扩增体系中加入不同浓度的引物，而得到单链DNA产物。

另外还有几种新型的、最近兴起的PCR技术[5]，虽不十分成熟，但发展前景十分广阔。它们包括： 3.8原位PCR 原位PCR是指对组织细胞中特异DNA或RNA进行PCR扩增，然后再用原位PCR进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。目前有报道[6]用这种方法可检测出组织细胞中的人乳头瘤病毒、艾滋病毒、结核杆菌等。3.9巢式PCR 巢式PCR比常规PCR灵敏度大大提高，同时第二次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性。所以这种方法用于临床检验，目前血清中丙型肝炎的监测多用这种方法。

4.PCR技术应用实例

PCR技术自从建立以来，由于其敏感、高效、操作简便，在分子生物学研究、临床医学和其他很多领域中得到4.1分子生物学理论研究[7] 如：制备cDNA文库与筛选，要较多的组织。但如果用PCR技甚至几个细胞就可以构建cDNA高了工作效率。

再如：DNA测序、检测突变碱基、基因重组与融合、用简并引物法扩增未知序列，无不是PCR技术在分子生物学中的应用。4.2临床医学[8]

如：病原体诊断，利用PCR技术可以检测标本中的病毒、细菌、支原体，直至寄生虫等病原生物，标本可以是组织、血液、细胞、分泌物、排泄物等。以后还发展了遗传病基因的诊断、组织器官移植的配型选择、肿瘤的诊断转移和确定、法医学和其他临床医学领域。4.3考古学[9]

由于PCR技术对基因组的完整性要求不高，因而对分子考古学极为有帮助，科判定生物种类间的亲缘关系、进化途径等。

如：1997年德国慕尼黑大学动物研究所科学家宣称[10]，他们对欧洲原始人——欧洲尼安德特人化石中的基因残余物进行分析，结果表示著名的欧洲原始人尼安德特人不是欧洲现代人的祖先，这一结果又得到了英国、俄罗斯和瑞典科学家的进一步证实，为现代人的起源提供了新的论据。4.4 其他领域

PCR技术还在动植物研究领域、组织和群体生物学等领域已得到了广泛的应用[11]。5.前景与总结

结合对以上PCR技术的了解，我认为PCR技术可以加快实现它的工程化，效

既费钱费时，又需术，只要很少组织文库，并且大大提了广泛应用。益化，如：应用在现代环境工程污水处理工程的微生物载体研究上[12]，PCR技术暂时只是致力于理论方面和研究方面，它并没有像其他微生物技术那样给人类社会带来大规模的经济效益，假如可以实现这一设想，那么不但PCR技术本身可以得到更加快速的发展，而且我们还可以促进经济的发展。

比如说：在传统的生物发酵技术上可以结合PCR技术，利用DNA在体外的复制和杂交，并实现表达，可以实现基因工程的超远缘杂交的物种突破难进行的问题；再比如：可以通过PCR技术实现核酸杂交技术，核酸杂交法比抗原捕获特异、敏感，但半衰期短，放射性污染不易处理，显影时间长等缺点，目前国内外常用的生物素检测标本中致癌物质[13]。

另外，还有很多微生物的PCR技术在工程上的应用，这里就不一一列举了。关键是怎样扩大在工程上的应用，以扩大经济效益。这是PCR技术的关键。

PCR技术运用传统生物技术结合近代基因工程原理，包含反转录PCR技术、定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组PCR技术、反向PCR技术、多重PCR技术、不对称PCR技术等多种传统PCR技术和原位PCR技术、巢式PCR技术等一系列新兴PCR技术。最新的进展如[14]：结核杆菌诊断PCR；病毒学PCR技术；HIV感染PCR；检测人COX病；DMS/BMD基因；地中海贫血PCR；血友病A基因„

在工业在分子生物学、临床医学、考古学等众多领域取得了巨大成就，不但只是局限于研究领域，而且还从实用角度证明了PCR技术是一项令人类值得自傲的技术。自从1985年由Millus创立之后，又得到了近二十年的发展，所以PCR技术的发展前景是不可估量的。它绝对是现代生物学技术中一项值得发展的技术，在当今社会乃至未来社会都会有它的立足之地，充分运用它，人类会在文明发展的进程中，发出更耀眼的光芒。参考文献：

[1] 欧阳平凯,《》生物科技辞典,化学工业出版社,北京,2003.10:342 [2] 赵斌,何怡红,《微生物实验》,科学出版社,北京,2002,23(5):11-15 [3] 孙汶生,黄英才,马曹红等,《基因工程学》,科学出版社,北京,2004.8:131-136 [4] 魏平著,《关于定量PCR技术》,科学教育出版社,北京,2001.815:59 [5] 贺淹才,《简明基因工程原理(第二版)),科学出版社,北京,2005,8:175-197 [6] 俞华,《PCR技术发展及应用前景》,人民日报,2003.12(5),第7版 [7] 马中声等,《分子生物学》,教育出版社,北京,2004,7:135 [8] 陆德如等,《现代生物医学技术》,化学工业出版社,北京,2002,7:50-52 [9] 李立家,《PCR技术的应用及前景》,东北大学学报,2002,11:10-15 [10] Geoger White,《 Prospective of PCR Technology》, Science,2000,5(7):29-32

[11] Michael Brand, Methods in Molecular Medicine, Vol.26“《Quantitative PCR Protocols》” Edited by: B.kochanowski and V.Reischi, Humana press Inc.Totowa, NJ, 1999

[12] 李彦春,《关于废水处理的现代技术应用》,环境技术通报,2005,5(4):25-30 [13] 二雄吉平,吴涛译,《关于PCR技术的一些看法》,东京大学学报现代基因技术译丛, 2004,11(4):10-15

9.一种PCR抖动检测算法及实现 篇九

在数字电视广播系统中, PCR (Program Clock Reference) 节目时钟参考, 作为整个MPEG-2传输流的统一时钟, 它的作用在于将发送端的27MHZ时钟以时间戳格式注入码流中, 终端能够根据该信息无偏差地恢复出发送端的参考时钟, 用以调整本地系统时钟计数器STC (System Time Counter) 来达到收发两地的时钟同步, 通常情况下, 传输码流经过复用和再复用后, PCR值并不能完全精确地反映信源编码端的时间信息, 这种现象称为PCR抖动, 如何正确检测和处理PCR抖动对于整个数字电视系统的音视频数据同步起着关键作用【1-3】。

目前关于PCR抖动重点集中在PCR校正算法及STC时钟恢复电路研究上【4-7】, 本文给出了一种完整的标识 (mark) , 非标识 (unmark) 两种类型的基于状态机模型PCR抖动检测算法和实现, 该算法在泰鼎多媒体技术有限公司最新高端数字电视芯片上得到了实际应用, 具有较强的实际应用价值。

2 PCR抖动检测和处理

2.1 PCR/STC差值计算公式

PCR、STC作为系统时钟采样, 具有相同的组成, 均由33位的Base计数器和9位的Extension计数器两个部分共计42位组成, 33位的Base部分由27M系统时钟经过300分频后获得采样值, 用于作为解码音视频同步参考值;9位的Extension部分直接由27M系统时钟获得采样值, 用于时钟恢复电路的锁相环电路修正系统时钟参考值。

本文中, PCR、STC计数器实际采用一组3个32位寄存器用于存贮42位时钟采样值, 分别为高位、低位、扩展位寄存器, 其中高位寄存器存贮33位Base部分的最高位, 低位寄存器存贮Base部分的低32位, 扩展位寄存器存贮9位Extension部分, PCR和STC差值计算公式如下:

其中:∆ (i) 表示第i次P C R与S T C差值;PCRHigh, PCRLow, PCRext分别表示存贮PCR高位值、低位值及扩展寄存器值;STCHigh, STCLow, STCext分别表示存贮STC高位值、低位值及扩展寄存器值。

2.2 状态机模型

由于网络传输等原因, TS码流在传输过程中会存在个别数据包出错的可能, 为了避免此类错误检测, 本文采用了两阶段PCR抖动检测算法, 其有限状态机模型如图1所示:

Lock状态, 系统位于PCR稳定状态, 当STC和PCR差值小于PCR抖动阀值, 系统进入Lock状态;系统第一次检测到PCR和STC差值大于阀值, 系统进入Unlock临界状态;系统检测到“不连续指示”标识或连续两次检测PCR和STC差值大于阀值时, 系统进入Unlock状态。本文采用5400000tick=200ms作为PCR发生抖动阀值。

2.3 PCR抖动检测

PCR抖动检测算法流程描述如下:

当第一个PCR值到达时, PCR值被装载到STC计数器中, 系统进入PCR抖动和系统时钟同步恢复流程;

对每一个新的PCR包, 检测包头“不连续指示”字段是否置1, 如果置1, 则为mark类型PCR抖动;系统进入Unlock状态, 进入PCR抖动处理流程。如果该字段不为1, 进行unmark类型PCR抖动检测, 计算STC和PCR差值;

当差值小于阀值时, 系统进入Lock状态, 此时系统时钟恢复电路通过该差值锁相环电路修正解码器的系统时钟, 使其达到和编码器一致的27MHz时钟, 同时输出到STC计数器, 用于解码器产生解码和显示的同步信号。当检测到连续两次差值均大于一个阀值时, 系统进行unlock状态, 此时进入PCR抖动处理流程。

2.4 PCR抖动处理

在Unlock状态时, 系统进入PCR抖动处理流程, 其算法流程描述如下:

设置PCR抖动标志寄存器, 系统时钟恢复电路在unlock状态下不再修正解码器的系统时钟, 在PCR抖动结束前, 一直使用本地固定27MHZ时钟作为系统时钟输出;

当下一个PCR到达时, STC计数器重新装载最新的PCR值, 此时PCR抖动结束, 系统进入下一轮PCR检测及处理阶段, 系统时钟恢复电路恢复时钟同步机制, STC计数器作为解码器STC时钟输出。

3 算法实现及测试

在实际产品开发中, 本文将整个PCR抖动检测模块设计为一个独立的内核任务, 在Nucleus内核中运行, 同时该内核任务通过消息机制通知上层音视频模块PCR抖动消息。当系统初始化完成后, 该内核任务被激活, 进入就绪状态。图2显示了系统检测到unmark类型PCR抖动测试实际场景截图:

当系统检测到PCR抖动时, 解码器音视频同步模块使用本地固定27MHZ时钟作为PCR抖动期间同步基准, 实际测试结果表明在PCR抖动期间音视频缓冲区数据得到了完全正确显示, 取得了较好的实际应用效果。

4 结语

本文针对实际数字电视产品开发中PCR抖动所引起的接收端解码器音视频数据不能完全同步显示问题, 给出了完整的PCR抖动检测及具体实现, 该算法及实现在泰鼎多媒体技术有限公司最新高端数字电视芯片产品上进行了实际应用, 具备较强的实际应用价值。

摘要：在实际数字电视产品开发中, PCR抖动会导致终端音视频数据无法完全正确显示。给出了一种基于有限状态机模型的PCR抖动检测算法及在Nucleus嵌入式实时操作系统下实现。该算法及实现在泰鼎多媒体技术有限公司最新高端数字电视芯片上得到了实际应用, 具有较强的实际应用价值。

关键词：PCR抖动,Lock,Unlock,Nucleus

参考文献

[1]钟玉琢, 王琪, 赵黎等.MPEG2运动图像压缩编码国际标准及MPEG的新进展[M].北京:清华大学出版社, 2002

[2]卢官明, 宗昉.数字电视原理[M].北京:机械工业出版社, 2004.

[3]刘修文.数字电视有线传输技术[M].北京:电子工业出版社, 2002.

[4]张炜, 刘鹏, 李兵兵.基于MPEG-2的PCR校准策略[J].中国有线电视2006, 19:1913-1917.

[5]杜邓宝, 潘长勇.数字电视传输系统中PCR抖动的校正分析与实现[J].电视技术, 2005, (7) :47-50.

[6]张磊, 王宏远.基于改进的PCR校正算法的MPEG2复用器电路与应用[J].电视技术, 2006, (3) :14-16.

10.pcr实验室 篇十

工作原理：

荧光定量PCR仪，是采用一种新的核酸定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的仪器。其主要部件包括产生温度梯度的热力学结构、进行荧光激发的激发光源、对发射光进行检测的检测系统以及数据获取分析软件工作站

用途：

11.pcr实验室 篇十一

根据GenBank上发表的多株猪流感病毒(SIV)序列,在保守区域设计1对引物,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了可检测出多种亚型猪源流感病毒的RT-PCR方法.通过对反应产物测序分析,与预期结果相符,证明该方法具有很强的特异性;该方法可以检测出约1个TCID50的猪流感病毒,显示较高的`敏感性.通过对12份临床样品进行检测,结果发现:该方法和其他两种方法分离病毒符合率相当.本研究建立的猪流感RT-PCR诊断方法具有高特异性和敏感性,适用于SIV的诊断应用和推广.

作 者：陈坚 刘业兵 张磊 罗俊 宁宜宝 CHEN Jian LIU Ye-bing ZHANG Lei LUO Jun NING Yi-bao 作者单位：陈坚,CHEN Jian(中国兽医药品监察所,北京,100081;广东永顺生物制药有限公司,广州,511356)

刘业兵,张磊,罗俊,宁宜宝,LIU Ye-bing,ZHANG Lei,LUO Jun,NING Yi-bao(中国兽医药品监察所,北京,100081)

12.数字电视PCR分析及校正实现 篇十二

一 PCR (节目参考时钟) 原理

PCR是节目时钟参考的英文缩写。MPEG-2通过在传送

流包中插入PCR来实现系统时基同步, 在解码之前的传输中, 都是离散的数字信号, 因此在分析PCR的时候, 可以设定在一个比较单一、理想的环境中, 归纳为编码和解码端的时钟配对问题和定时问题。TS流包头自适应区域6个字节PCR结构, 如图1所示。

其中PCR由33b的PCR_Base和9b的PCR_ex以及预留6b组成。在编码端和解码端, 通过计数来达到间接计时的目的, 可以假设传输中所有参量的延迟都是一样的。PCR_Base是对编码器的27MHz系统时钟的300分频后的时钟计数值抽样, 它的作用是在解码器切换节目时, 提供对解码器PCR计数器的初始值, 使PCR值与PTS、DTS尽可能地达到相同的时间起点。PCR_ex是计数器对编码器27MHz系统时钟的计数值, 它的作用是通过解码端的锁相环电路修正解码的系统时钟, 使其达到和编码一致的27MHz。解码的系统时钟经300分频后在解码PCR计数器的初始值的基础上继续计数, 这样编码的PCR计数值就过渡到解码端了, 而且由断续的抽样变成了连续的计数值, 这就总能捕捉到和PTS、DTS数值相同的时刻。 (ISO/IEC 13818-1, 对PCR编码端, PTS、DTS的间隔规定为0.1s) 。

DTS是编码时定义的, 在解码器中的预定解码时间。PTS是编码器定义的, 为解码器规定某个单元的显示时间。一个单元解码后被显示, PCR计数器重新计数, 开始下一个单元的工作。PCR的作用有两个:

●读取编码端PCR_Base的读数, 作为自己的初始值;

●提取PCR_ex完成编码解码端的系统时钟的调整, 达到严格的统一。

这两个步骤完成后, 则将随后的几个相同性质的TS包 (通过PID来提取) 的包头统统去掉, 构成一个PES (音频或视频) , 通常一个视频PES包含一帧图像的编码数据和说明其性质的包头, 音频PES包更短。从PES包头提取出DTS, PTS, 与本地PCR (与编码端的PCR已略有区别, 该PCR是第一个收到的TS包中的PCR, 并经过标准时钟计数) 比较来确定各自的排列次序, 或解码或显示。

二 独立时基PCR在节目交接时产生的影响

首先我们来分析锁相环电路是如何同步解码器时钟的, 见图2。

在解码器中, 一个压控振荡器 (VCO) 产生27MHz时钟信号, 由它驱动本机PCR计数, 将本机PCR计数的输出与来自传输包头的PCR进行比较, 得到的差值即为PCR相位误差。PCR相位误差经滤波后去控制VCO, 最终使本机的PCR与传输包头的PCR相同步。

在切换节目开始时, 由于每个节目PCR基点不一样, 解码器需要时间重新进行锁定。系统时钟处于调整阶段, 计数时钟不稳, 导致计数不正确, 使待处理单元的解码显示次序指示不正确, 因此在节目切换开始时会看到短暂的马赛克或无声。待系统时钟调整完毕, 图像解码次序和声音次序都被正常排列, 图像和声音趋于正常。

如果使用基于相同时基的PCR, 解码端就不需要这样一个PCR重新锁定过程, 也就不会出现上述现象, 可以解决节目交接时出现的一系列问题。

三 基于相同时基的PCR校正方案

在ISO/IEC 13818协议中没有对PCR的时基做明确的规定, 1个TS流中的多套节目的PCR可以使用独立的时基, 也可以使用统一时基 (现实中不同节目的产生是不相关的, 所以往往保留原有不相关的时基) , PCR的作用在于为收端提供一个时钟基准, 所以需要的是PCR之间的差值, 而每一个PCR的绝对值是没有意义的, 基于此, 我们在视频服务器使用了新的PCR校正方法, 对TS流进行PCR的重新注入。利用本地的27MHz时钟按照ISO/IEC 13818协议的规则, 重新生成PCR值, 当TS流存在多套节目时, 不区分当前的PCR域为哪套节目的PCR, 而是用一个统一的时钟, 根据时间在每个PCR域内置入新的PCR值, 这样多套节目的PCR共享一个时基。

视频服务器处理过程是设原始节目参考时钟为PCR, 视频服务器选用相同时基PCR输出时, 所有节目用统一参考时钟PCR’, 两者的差值△PCR=PCR-PCR'。生成新的TS流时将原有PCR用新的PCR’替代。由于相应PTS和DTS也要去修改, PTS'=PTS+△PCR, DTS'=DTS+△PCR。但该处理方法不能修正节目源本身的PCR问题。最终实现如图3所示。

上海数字电视播出视频服务器目前采用了基于相同时基的PCR校正方案后, PCR抖动曲线几乎是一条直线, 由于实际误差原因, PCR抖动范围在±30ns内, 可以忽略不计, 改善了节目交接时由于PCR不稳而出现的黑屏或马赛克现象。

四 结束语

我国广播电视正经历着有史以来最深刻的变革, 正在实施从模拟向数字整体平移, 从传统向新媒体发展。广电网络将以数字化为契机, 全面提升数字电视信号质量, 解决实际运营中所碰到的各种问题。.

参考文献

[1]ISO/IEC13818-1-1996, Information Technology generic coding of moving picture and associated audio:system, recommendation H.222.0[S].

[2]MPEG-2运动图像压缩编码国际标准及MPEG的新进展[M].钟玉琢译.北京:清华大学出版社, 2002.

13.pcr实验室 篇十三

本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法.该方法只需将少量(4～6 mg)植物叶片、适量(200μL)TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入1个2 mL离心管,在多功能组织细胞研磨器中振动5 min破碎组织后,直接取1μL DNA溶液作为PCR的模板.本方法具有简单快速、操作效率高、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品的`基因型检测.

作 者：王兰 龙云铭 刘耀光 Wang Lan Long Yunming Liu Yaoguang 作者单位：王兰,Wang Lan(华南农业大学农学院,广东省植物分子育种重点实验室,广州,510642;华南农业大学生命科学学院,广东省教育厅植物功能基因组与生物技术重点实验室,广州,510642)

龙云铭,刘耀光,Long Yunming,Liu Yaoguang(华南农业大学生命科学学院,广东省教育厅植物功能基因组与生物技术重点实验室,广州,510642)