基因鉴定技术的名词解释

基因鉴定技术的名词解释（精选16篇）

1.基因鉴定技术的名词解释 篇一

转基因技术的名词解释

转基因技术 的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段 的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。

转基因技术的主要分类

转基因过程按照途径可分为人工转基因和自然转基因，按照对象可分为植物转基因技术、动物转基因技术和微生物基因重组技术。

人工转基因

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中， 由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术(Transgene technology)。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。如今，改变动植物性状的人工技术往往被称为转基因技术(狭义)，而对微生物的操作则一般被称为遗传工程技术(狭义)。

经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”(Genetically modified organism，简称GMO)。

自然转基因

不是人为导向的，自然界里动物、植物或微生物自主形成的转基因现象，例如慢病毒载体 里的乙型肝炎病毒DNA整合 到人精子细胞染色体上、噬菌体将自己DNA的插入到溶源细胞DNA上，农杆菌 和 花椰菜花叶病毒(CMV)等。

植物转基因

植物转基因是基因组中含有外源基因的植物。它可通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种，如玉米稻 、北极鳄梨、转基因三倍体毛白杨。而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长激素、胰岛素、干扰素、白介素2、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等基因已在转基因植物中得到表达。

动物转基因

动物转基因就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。

通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，转基因超级鼠比普通老鼠大约一倍。生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。

但由于转基因动物受遗传镶嵌性和杂合性的影响，其有性生殖后代变异较大，难以形成稳定遗传的转基因品系。因而，尝试将外源基因导入线粒体，再送入受精卵中，由于线粒体的细胞质遗传，其有性后代可能全都是转基因个体，从而解决这一问题。

微生物重组

在所有转基因技术中，以微生物基因重组技术应用最为宽泛和常见。

与动植物不同的是，微生物重组技术通常需要用到专门的重组基因载体——质粒。质粒是一种细胞质遗传因子，因此具有不稳定的遗传特性。但相比于动植物，微生物 重组技术具有周期短、效果显著、控制性强的特点，因而广泛应用于生物医药和 酶制剂行业。经过多年的理论奠基，现已在微生物领域中开发出酵母表达系统、大肠杆菌表达系统和丝状真菌表达系统，其中毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统最受欢迎，具有表达效率高(外源蛋白占细胞总蛋白的10%至40%)、生产成本低的特点，一般常见的诸如胰岛素、白细胞介素、α-高温淀粉酶、重组人p53腺病毒注射液、啤酒酵母乙肝疫苗、抗生素 、饲料用木聚糖酶、壳聚糖酶等都由这两种表达系统生产的。

转基因技术的技术原理

转基因技术的原理是将人工分离和修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。由于导入基因的表达，引起生物体的性状，可遗传的修饰改变，这一技术称之为人工转基因技术(Transgene technology)。

人工转基因技术就是把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。具有不确定性。常用的方法和工具包括显微注射、基因枪、电破法、脂质体等。转基因最初用于研究基因的功能，即把外源基因导入受体生物体基因组内(一般为模式生物，如拟南芥或斑马鱼等)，观察生物体表现出的性状，达到揭示基因功能的目的。

植物

转基因植物是基因组中含有外源基因的植物。通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，改变植物的某些遗传特性，培育优质新品种，或生产外源基因的表达产物，如胰岛素等。

在过去的二十年里，随着分子生物学各领域的不断发展，植物基因的分离、基因工程载体的构建、细胞的基因转化、转化细胞的组织培养、植株再生及外源基因表达的检测等各项技术日趋成熟和完善，有关植物基因工程的研究日新月异，许多以前根本不可能的基因转化工作在越来越多的植物上获得成功。

研究转基因植物的主要目的是提高多肽或工业用酶的产量，改善食品质量，提高农作物对虫害及病原体的抵抗力。常规的药用蛋白大部分是利用生化的方法提取或微生物发酵获得的，这类活性物质一般在活细胞中含量甚微，且提取过程复杂，成本高，远远满足不了社会的需要。应用转基因植物来生产这些药用蛋白，包括疫苗、抗体、干扰素等细胞因子，可以利用植物大田栽种的方式大量生产，大幅度降低生产成本，提高产量，还可以获得常规手段无法获得的药物。

利用植物来生产疫苗的最大优点是他可以作为食品直接口服。通过各种植物转基因技术将多台疫苗基因转入植物，从而得到表达多肽疫苗的转基因植物。随着抗体基因工程能将抗体基因(从小的活性单位到完整抗体的重、轻链基因)从单抗杂交瘤中分离出来，人们就开始想办法利用转基因植物来表达这些抗体。

1989年Hiatt将鼠杂交瘤细胞产生的抗体基因转入烟草细胞获得了植物抗体，并且发现植物抗体具有杂交瘤来源抗体同样的抗原结合能力，既有功能性。在这之后，全长抗体、单域抗体和单链抗体在转基因植物中均获得成功表达。用植物抗体进行局部免疫治疗将是一个引人瞩目的领域，应用高亲和性抗体进行局部治疗可以治愈龋齿及其它一些常见病。植物转基因可获得更多的新品种，蔬菜，水果，花卉都能够在保留其优良品质的情况下优化。

动物

人工转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。 它是按照预先的设计，融合重组细胞、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。

通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉精基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成优良的可养殖品种。

基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。1974年，Jaenisch应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40DNA转基因小鼠。其后，Costantini将兔-珠蛋白基因注入小鼠的受精卵，使受精卵发育成小鼠，表达出了兔β-珠蛋白;Palmiter等把大鼠的生长激素基因导人小鼠受精卵内，获得“超级”小鼠;Church获得了首例转基因牛。到目前为止，人们已经成功地获得了转基因鼠、鸡、山羊、猪、绵羊、牛、蛙以及多种转基因鱼。

还可将转基因动物作为生物工厂(Biofactories)，包括，乳腺生物反应器和输卵管生物反应器等，如以转基因小鼠生产凝血因子IX、组织型血纤维溶酶原激活因子(t-PA)、白细胞介素2、α1-抗胰蛋白酶，以转基因绵羊生产人的α1-抗胰蛋白酶，以转基因山羊、奶牛生产LAt-PA，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌，便于分离纯化，基于系统生物学的发展，转基因系统生物技术-合成生物学成为不仅单基因而且多基因乃至基因组设计、合成与转基因的新一代生物技术。

但由于人工转基因动物，它们受遗传镶嵌性和杂合性的影响，其有性生殖后代变异较大，难以形成稳定遗传的转基因品系。因而，尝试从受体动物细胞中分离出线粒体，以外源基因对其进行离体转化，再将人工转基因线粒体导入受精卵，所发育成的人工转基因动物，雌性个体外培养的卵细胞与任一雄性个体交配或体外人工受精，由于线粒体的细胞质遗传，其有性后代可能全都是人工转基因个体。

2.基因鉴定技术的名词解释 篇二

微小核糖核酸(microRNA,简称miRNA)是一类特殊的非编码单链小分子RNA,由19~25个核苷酸组成。大量研究证实,miRNA可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA而阻碍其翻译,从而在生物生理、发育、代谢以及疾病发生、发展、转归过程中起着广泛而超乎想象的作用,现已作为药物干预的新靶点而成为生物医学研究的热点[2,3]。特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”。丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有显著的生物活性和组织靶向性[4,5,6]。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为玄参科地黄属Rehmannia Libosch.ex Fisch.et Mey多年生草本植物,是著名的“四大怀药”之一,具有滋阴清热、补血止血等功效,为清热凉血要药,用于温热病热入营血,身热口干、舌绛或红等症状,为多种方剂配伍要药及中成药的主要原料。现代研究表明,其主要含有梓醇、地黄苷、红景天苷等化学成分[7],具有抗炎和神经保护等多种药理活性[8,9,10]。但这些研究发现与其“清热凉血”的主治功效尚相去甚远,尚不能阐明其药效物质基础及作用机制。因此,本研究采用高通量测序的方法,从miRNA角度揭示地黄的药效物质基础,探讨地黄核酸类物质对机体生理功能的影响,拓展现有以次生代谢成分为主体的药效物质研究模式,为目前药效物质尚不明确的中药研究提供一种有益的尝试,也为具有我国特色的中药miR-NA新药研发提供依据。

1 材料

1.1 实验动物与药材

雄性清洁级ICR小鼠,体质量18~22 g,由浙江省实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(浙)2014-0001。地黄:采自河南焦作,经浙江中医药大学俞冰副教授鉴定为R.glutinosa R.Brown新鲜块根。

1.2 实验仪器与试剂

Hiseq 2500高通量测序仪:Illumina,USA;Bioanalyzer 2100生物分析仪:Agilent,USA;Qubit 2.0核酸定量仪:Life technologies,USA;荧光定量PCR仪:BIO-RAD,USA。RNA质检试剂盒:Agilent,USA;总RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;动物RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;Trizol reagent:Invitrogen,USA;高通量测序试剂盒:Illumina,USA。

2 实验方法

2.1 样品制备

实验分3组,地黄原植物组、空白组和喂食地黄组。其中,空白组和喂食地黄组,每组各5只小鼠。取2 g新鲜采集的地黄块根迅速置-80℃冰箱冻存,用于后续的地黄miRNA提取。另取50 g新鲜采集的地黄块根,在冰浴中碾磨,制成1 g生药/m L浓度的匀浆。将地黄匀浆灌胃给予小鼠(预先禁食12 h),按10 g生药/kg体质量给药(相当于临床等效剂量)。分别于灌胃后1 h,随机挑选5只喂食地黄的小鼠,取血分离血浆置于-80℃保存。同时,分别于上述各时间点随机取5只小鼠作空白对照,分离制备血浆,进行后续高通量测序。

2.2 miRNA c DNA文库构建及高通量测序[11]

采用Illumina试剂盒,将总RNA样品经富集、纯化,c DNA合成及PCR扩增后,获得小RNA文库,经文库质量检测合格后上机进行高通量测序分析。测序所得35个核苷酸及以下序列存在很多无用信息,需要通过去接头序列、低质量序列、污染及进行序列统计等过程来完成初级分析,然后与美国国家生物技术信息中心Gene Bank上玄参科植物RNA数据作为查询库,滤除非miRNA的小核酸序列,最后只保留16~30个核苷酸的高质量miRNA序列。对于剩余序列,则分别截取完全一致的RNA匹配序列位点上游或下游各300个核苷酸的序列,用RNAfold软件进行二级结构预测。当候选miRNA位于二级茎环结构的臂上,并满足miRNA的判断要求,则确认为地黄特有的miRNA。

经过质量控制程序处理和一系列非目标序列过滤处理后,分别构建地黄miRNA文库、喂食地黄小鼠血浆miRNA文库及空白小鼠血浆miRNA文库,用于后续数据分析。

2.3 地黄药效miRNAs的Q-PCR验证[12]

筛选喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,获得通过喂食进入血液的地黄miRNA,即地黄药效miRNA。采用荧光定量PCR法,检测地黄miRNA、喂食地黄小鼠血浆miRNA和空白小鼠血浆miRNA的表达丰度,验证小鼠体内检出的地黄miRNA。

2.4 miRNA靶基因预测及其功能分析

使用Target Scan、miRanda两款软件对筛选出的miRNAs分别进行靶基因预测。对两款软件预测出的靶基因分别按照每款软件的评分标准进行筛选。Target Scan算法中去除context score percentile小于50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max-Energy)大于-10的靶基因。最后取交集作为目标miR-NAs的最终靶基因。最后对各个miRNA的靶基因分别进行Gene Ontology(GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析,构建miRNA与靶基因的网络信号图。

3 实验结果

3.1 样本保守miRNA的鉴定及地黄新miRNA的发现

依据miRNA基因在动植物中广泛保守这一特性,按照生物信息分析流程,将地黄、小鼠全血样本高通量测序获得的原始数据与miRBase数据库及相关基因组序列比对,筛选分析后获得样本已知miRNA及全新的miRNA基因共357个。进一步分析鉴定喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,从上述差异miRNA中筛选得到2个地黄miRNA,见表1。进一步采用Q-PCR法,验证上述2个miRNA在地黄及喂食地黄小鼠血浆中的表达丰度,最终鉴定出2个地黄miRNA(表1中的miR2118、miR5290),可在地黄及喂食地黄小鼠血浆中稳定表达,见图1。

定位:成熟miRNA在前体中的定位;LM:成熟miRNA的长度;LP:前体序列的长度。

3.2 药效microRNA的靶基因预测及其功能分析

对上述鉴定所得的2个地黄miRNAs采用Target Scan与MiRanda软件,以人类mRNA为靶标,进行靶基因预测,共预测得到这2个地黄miRNA可能调控的3604个靶基因,并进一步对这些靶基因经GO分析,可知鉴定所得的2个地黄miRNA可能调控的靶基因的宏观功能范畴。发现这些靶基因主要在生化过程、细胞成份和分子功能三大区域发挥功能,见图2,参与转录调控、生物大分子合成代谢调控、磷酸化反应及胞内蛋白激酶级联反应、蛋白质转运及胞内离子运输等重要的生物学过程,发挥金属离子通道活化调控、跨膜转录因子活化、离子通道活化调控、胞内蛋白激酶信号传导等生物学功能。

KEGG通路数据库可提供生化物质相互转化所有可能的代谢途径,通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径[13]。采用DA-VID程序对2个地黄miRNA进行预测靶基因的生物学通路KEGG分析,以Pvalue of Fisher’s Exact Test<10-3为基准,筛选出地黄miRNA主要参与的8条信号通路,分别是慢性骨髓白血病、MAPK信号通路、神经胶质瘤、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递、癌症相关信号通路、Hedgehog信号通路等,见图3。其中,图4为MAPK信号通路示意图(灰色标记部分为miRNA可能干预的靶点),是地黄药效miRNA抗炎效应的主要作用通路。利用cytoscape软件绘制MAPK信号通路的miRNAs-gene网络结构图,见图4,利用结构图论的方法对网络中miRNA在网络中的调控地位进行评价,评价的标准以miRNA在网络中的度(Degree)来衡量,度表示网络中的miRNA调控靶基因的数目,度越大代表miRNA调控的靶基因越多,在网络图中miR2218、miR5290的度基本相当,均为核心miRNAs(中间黑色节点代表miR-NA,周围淡灰色代表gene,灰色边代表miRNA对gene有调节作用。)。其主要作用靶标mRNA见图5。

1-12.生化过程;13-20.细胞成分;21-30.分子功能

由图3~5可知,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路,主要涉及细胞凋亡、炎症介质及下丘脑-垂体-肾上腺轴的神经内分泌调节过程,进而负责调节糖、脂肪、蛋白质三大营养物质及水盐代谢。临床实践证明,生地黄主要用于治疗消渴(糖尿病)、高血脂等代谢性疾病,以及脑缺血等神经性损失疾病,而这些疾病的机制均与以中枢神经系统为核心的神经免疫内分泌系统紊乱有关。因此,笔者推测地黄miRNA可能是其发挥抗血糖、神经保护作用的物质基础。

3讨论

核酸是细胞最基本和最重要的生物大分子。早在15年前国外学者即已开始着手核酸药物的大规模筛选和合成,并主要用于治疗肿瘤和HIV等病[14]。而核酸类成分(如虫草素、香菇太生、腺嘌呤)也是很多中药的活性成分,其广泛存在于冬虫夏草、香菇、灵芝、桑椹、太子参、人参等补益类中药材中,并作为此类中药材的质量控制指标[15,16]。但由于受到核酸结构稳定性及研究关注的侧重,传统认为这类物质并非人体所需,且经过胃肠道消化后吸收进入体内的均不再是具有生物活性的单体小分子,从而限制了核酸类成分的研究与开发。

特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”;丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有一定的药理活性和组织靶向性[17,18,19]。张辰宇等[20]最新研究表明,来源于金银花的miR-2911可以以进食的方式完整进入动物体内,并且能直接作用于流感病毒,通过抑制流感病毒PB2和NS1基因表达,进而抑制流感病毒的复制来达到治疗流感的目的。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。

本研究以地黄miRNA为模版,在喂食地黄的小鼠全血中通过高通量测序检测获得2个全新的地黄miRNA,且均具有高度表达(拷贝数10为中度表达,10以上为高度表达)。采用荧光定量PCR,确证了上述地黄miRNA可在种间“穿梭”,通过饮食途径、消化吸收进入体内。并进一步通过靶基因预测并经GO与KEGG pathway分析判定,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路的生物学过程,可对金属离子跨膜运输、神经-内分泌、炎症介质及相关癌症发生、肿瘤增殖等多个转录因子具有调控作用,提示地黄miRNA具有潜在的药效作用,可能是地黄中一类新型的药效物质。然而,地黄miRNA具体调控人体疾病的靶向基因和分子机制还需要进一步的研究证实。更进一步,植物miRNA作为外源性基因进入体内需要考虑类似于转基因食品安全性的问题;由于其药效靶标的多样性,是否会对机体的正常功能产生影响,以及其药效作用的确认还有待于进一步的实验论证。

摘要：目的:筛选地黄microRNAs(miRNAs)类药效物质及其靶基因功能分析。方法:采用高通量测序法,测定地黄、空白小鼠和喂食地黄匀浆液小鼠肝组织及血浆中miRNAs的表达丰度,并与Gene Bank上的植物microRNA数据库比对,结合荧光定量PCR验证,鉴定吸收进入体内的地黄miRNAs,以人类mRNA为靶标,采用Target Scan与MiRanda预测地黄miRNAs的靶基因,并通过GO与KEGG分析靶基因的相关功能。结果:共鉴定出2个地黄miRNAs可吸收进入体内,其主要在生化过程、细胞成分和分子功能3大区域发挥作用,并影响肿瘤、代谢、炎症等相关信号通路。结论:miRNAs可能是一类新型的中药药效物质。

3.基因鉴定技术的名词解释 篇三

语言上的改变

而当人们的警觉性提高,基于生态考虑和消费者保护而展开的行动也陆续展开,包括配额进口、严格标示等。不仅初等粮食和玉米、大豆、面粉等必须标示,甚至加工制造的食用油、罐头、面包、各种点心速食等,也都将被要求标示。美国几个跨国速食集团,为了顺应时代的变化,已相继决定将停止使用基因改造粮食为产品的原材料。

而一切的改变,最后都必将落实到语言上。

近年来,有关基因改造食物已开始被冠上“Franken-”这样的字首,它最恰当的翻译可能是“科学怪×”,例如:

“科学怪食物”Frankenfood、“科学怪水果”Frankenfruit、“科学怪种子”Frankenseeds、“科学怪菜”Frankenveggies、“科学怪鱼”Frankenfish、“科学怪猪”Frankenpigs、“科学怪鸡”Frankenchicken。

当然,由这个字首还可以延伸出许多其他字,如称呼被污染的空气为“科学怪空气”Frankenair,被工业污染的水为“科学怪水”Frankenwater,污染严重的城市则成了“科学怪城”(Frankencity,而从生态环境主义比较极端的立场而言,这个世界俨然成了“科学怪世界”(Frankenworld)。

根据《纽约时报》专栏作家威廉·萨菲尔的说法,加上“科学怪×”这个字首另创新字,似乎开始于1992年6月。当时美国的“食品暨药物管理局”决定,将取消基因工程作物原有的逐案评估。这是政策上的放水,于是,波士顿学院的英语教授保尔·路易斯撰文投书《纽约时报》的言论版。他在文章里指出,玛丽·雪莱(1797-1851)于1818年发表的小说《科学怪人》Frankenstein中描述,“实验室将改良的人类肉体制造出来以后,科学家即不断地让这些东西变成了生命”、“如果他们今天要卖给我们科学怪食物,可能我们就需要召唤村民,点起火把,到他们的实验室古堡去制止”。

“科学怪食物”这个词从此即告出现。

科学怪世界

路易斯教授使用“科学怪食物”这个词之后,《波士顿环球报》跟进,对这个新词加以夸赞,认为“它非常精彩地总结并凝聚了遗传上被膨大了的番茄和染色体改造过的牛等受争议的产品,并将它们可怕的非自然性表露了出来”。路易斯在访问中指出,“科学怪×”这个字首在音韵上极为铿锵流畅,“你可以加上这个字首说科学怪水果、科学怪空气,科学怪水,反正现在早已是个科学怪世界了!”

自此,“科学怪×”渐趋流行,并成为新的常用词,由于它是从西方家喻户晓的经典小说《科学怪人》延伸而成,因而老少能解,大家一看就知道这种新词的意思是什么。

《科学怪人》引发思考

而由“科学怪×”来追溯玛丽·雪莱所写的《科学怪人》这部经典小说,则能体会出更深一层的文化含义。玛丽是19世纪的奇女子,她在文学及文化上的地位和影响力,远远超过她的大诗人丈夫雪莱(1792-1822)。

玛丽一生写了7部小说,以《科学怪人》最为重要,它不仅仅是部小说而已,甚至还是一种“文化原型”,所有对科学创造的质疑,都要回溯到《科学怪人》。她的这部小说,被改编成电影至少200次。以它为基本原型的文学创作更不计其数。

在《科学怪人》里,科学怪人对他的创造者维克托说:“我是你的受造物,我对我的主人及君王将会温驯服从,你也必须遵守你的角色,那是你负欠于我的。”“对我,尽你的责任,那么我对你和其他人类,也将尽我的责任。”因此,《科学怪人》表面看起来,说的是科学的反面预言,而就深层看,它谈的却是“创造者的义务”,当创造者不对他所造之物尽其义务,则受造物就会起而反抗,或演变成可怕的祸害。

而当人类模仿上帝,那么,他能尽上帝一样的义务吗?玛丽·雪莱的答案显然是否定的。而她无疑替这个大世界提出了一个深远影响的问题,她的问题在过去近200年来也不断被后人重新提起。

在这个许多事情和事物都被加上“科学怪×”字首的时代,玛丽·雪莱所提出的问题,更值得我们思考了!(南方朔)

4.功能基因组学的名词解释 篇四

运用遗传技术，通过识别其在一个或多个生物模型中的作用来认识新发现基因的功能。功能基因组用功能不明的分离基因作为起始点，然后选择具有该同源基因的生物模型。这一生物模型可以是简单的酵母细胞或复杂的线虫甚至老鼠。基因被选择性的用多种遗传技术灭活，在此生物体上选择性去除的效果被确定。通过这种方法去除基因，它对生物功能的贡献就能够被识别。功能基因组在评估和检测新药时十分有用。在另一种方法中，一整套基因被系统地灭活，人们就可以检测其对特定细胞功能的影响。这里，一个新的基因和其功能就同时被识别了。

5.基因鉴定技术的名词解释 篇五

根据NCBI中公布的人瘦素cDNA序列,设计并合成了6个89bp左右的DNA小片段,经重叠延伸PCR扩增获得464bp的.rhLep的完整基因片段.构建pET22b(+)/rhLep表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的50%以上.表达产物用Ni2+亲和层析柱纯化,SDS-PAGE结果表明,含6×His标签的目的蛋白的相对分子量约16kD.MTT比色法实验显示,当低剂量(10～30ng/mL)时,rhLep具有促进内皮细胞生长的作用;在高剂量(50～225ng/mL)时,rhLep具有杀伤人内皮细胞的活性.其最大杀伤率达到98.8%.吖啶橙荧光染色观察到高剂量rhLep对人内皮细胞有明显的凋亡作用.以上工作为进一步了解瘦素的体内体外生物活性奠定了基础.

作 者：吴娜 张长弓 谢莲英 王臻 颜江华 WU Na ZHANG Chang-Gong XIE Lian-Ying WANG Zhen YAN Jiang-Hua 作者单位：吴娜,谢莲英,王臻,WU Na,XIE Lian-Ying,WANG Zhen(厦门大学生命科学学院,厦门,361005)

张长弓,颜江华,ZHANG Chang-Gong,YAN Jiang-Hua(厦门大学医学院抗癌研究中心,厦门,361005)

6.基因鉴定技术的名词解释 篇六

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从抗锈病小麦品种西农88基因组DNA扩增出3条与植物抗病基因同源的序列,分别为WRGA1、WRGA2和WRGA14.这三条同源片段均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的`保守性结构域Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(HD),它们与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为46.0%-9.9%,三个片段间在氨基酸水平上的同源性为80.7%-56.8%.Northern杂交表明WRGA1在小麦中受水杨酸正调控,属诱导型表达.

作 者：黄萱 徐子勤 陈立余 王健 HUANG Xuan XU Zi Qin CHEN Li Yu WANG Jian 作者单位：西北大学,省级生物技术重点实验室,西安,710069刊 名：分子细胞生物学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF MOLECULAR CELL BIOLOGY年，卷(期)：200639(2)分类号：Q94关键词：小麦 NBS-LRR 同源克隆技术 抗病基因同源序列 水杨酸

7.基因鉴定技术的名词解释 篇七

1 资料与方法

1.1 一般资料

(1) 细胞株与质粒:PVA腺病毒载体p Adtrack CMV、p Ad Easy-1、大肠杆菌E.coli, 293细胞。 (2) 试剂:限制性内切酶Xba I、Kpn、Pme I、Eco R I、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、碱性磷酸酶CIAP、DNA提取试剂盒等均购自Ta Ka Ra公司;胰蛋白酶, 小牛血清, DMEM, Polybrene, DMSO为Sigma公司产品;脂质体Lipofectamine TM2000、DNA Ladder:Invitrogen公司胶回收小量试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;中量质粒提取试剂盒购自Omega公司。

1.2 方法

通过在NCBI上的检索, 在Gene Bank数据库中获取基因IL-18、TK的全长序列, 引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0设计, 由invitrogen公司合成。扩增IL-18及TK基因, IL-18引物序列:上游:5’-cac GGTACCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG T-3’下游:5’-gc TCTAGACTAGTCTTCGTTTTGAACAG TGAA-3’, 预计长度:582 bp;TK引物序列:上游:5’-cac GGTACCATGAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3’, 下游:5’-gc TCTAGATCAGTTGGCAGGGCTGCATTGCAG AATC-3’, 预计长度:705 bp。经各自反应条件后, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳, 回收DNA片段。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞, 铺琼脂板后, 37℃生化培养箱内培养10~12 h。挑取含有目的基因的候选克隆, 采用DNA重组技术, 构建Ad CMV-TK及Ad CMV-IL-18。

1.3 Ad CMV-TK与Ad CMV-IL-18的PCR鉴定

分别将Ad CMV-TK及Ad CMV-IL-18重组腺病毒液2 m L感染80%融合的293细胞, 待单层细胞大部分变圆但尚未脱落时收集细胞, 反复冻融3次, 取少许提取腺病毒DNA, 进行PCR鉴定, 并以一个目的基因不同的重组病毒为阳性对照, 采用纯水作为阴性对照。鉴定引物:上游:5’-ACCAAGGAAATCGGCCTCTAT-3’, 下游:5’-GCCATACCTCTAGGCTGGCTAT-3’, 预计长度:115 bp;TK引物序列:上游:5’-TGCATTAACCTGCCCACTGT-3’, 下游:5’-AAAACTGCCCCTCGTCGAT-3’, 预计长度:298 bp。

1.4 制备并纯化高滴定度腺病毒

回合1:从初级转染溶胞产物放大:干冰/甲醇浴冷冻细胞, 37℃水浴解冻循环4次以从细胞释放病毒。用清洁的溶胞产物进行下一回合的放大或-80℃保存。回合2和3:中等规模的放大后;原种储存于-80℃。OD260检测病毒滴度。测量OD260时, 加15μL病毒和15μL空白溶液至100μL TE/0.1%SDS, 旋转30 s, 离心5 min, 测量。

2 结果

2.1 PCR扩增TK及IL-18基因产物的电泳结果

从图1中分析, 扩增的条带与预期的大小相符, 说明得到的正是目的条带 (TK:705 bp;IL-18:582 bp) 。

2.2 重组腺病毒TK及IL-18的PCR鉴定

PCR电泳显示特异性预计大小的片段, 证明重组腺病毒含有TK基因及IL-18基因, 见图2~3 (TK:298 bp;IL-18:115 bp) 。

注:1:IL-18;2:TK;M:Marker

注:1:TK;2:Negative control;M:Marker

注:1:IL-18;2:Negative control;M:Marker

2.3病毒滴度的测定

测得重组腺病度滴度为:Ad CMV-TK=1.28×109PFU/m L, Ad CMV-IL-18=1.28×109PFU/m L。

3讨论

在现代分子生物学和基因工程技术飞速发展的推动下, 肿瘤的生物学治疗日益受到人们的重视, 显示出良好的应用前景。基因治疗是生物学治疗的一个重要组成部分, 有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达, 而这在很大程度上取决于基因治疗所采用的载体系统, 基因治疗多为病毒性载体, 常见的病毒性载体如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等, 而以腺病毒为载体的治疗在基因治疗研究中应用广泛[3,4]。

腺病毒是一种无包膜的线状双链DNA病毒, 在体内疗法的基因转移中具有很大的优势[5,6], 由于其感染细胞时DNA不整合到宿主染色体上, 不存在激活致癌基因或插入突变等危险, 制备容易, 操作简单。腺病毒载体具有以下优点: (1) 人类是腺病毒的自然宿主, 因此较为安全; (2) 靶细胞范围广, 它不但能感染复制分裂细胞, 也能感染非分裂细胞, 并且能介导体内多种组织的基因转移, 如肺、脑、神经系统等; (3) 滴度高, 可达1011~1012PFU/m L; (4) 可在肠道内及呼吸道内繁殖, 它的重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注等多类方式给予, 以达到有效的基因转移和治疗; (5) 该载体没有包膜, 不容易被其补体所灭活, 可直接在体内使用[7,8]。但载体也有不足之处: (1) 基因转移缺乏特异性; (2) 载体是一种非整合载体, 对于非分裂相细胞, 其介导的基因转移可持续表达几个月, 但对于增殖旺盛的细胞, 要达到长期的基因表达, 则需重复给予; (3) 重复给予时机体可能产生免疫应答, 影响基因表达和治疗效果。

神经胶质瘤是常见的神经系统原发恶性肿瘤, 约占全部中枢神经系统肿瘤的45%~55%, 传统的手术、放疗及化疗等联合治疗效果不理想, 低级别胶质瘤患者平均生存3~5年, 而高级别胶质瘤则为1~2年[8,9,10]。自杀基因治疗在胶质瘤的基因治疗中占有极为重要的地位, 自杀基因疗法是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞, 此基因编码的特异性酶类能将细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞毒性产物, 以达到杀死肿瘤细胞为目的[11]。研究发现, 只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养, 不仅转染的癌细胞被杀灭, 二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡, 即“旁观者效应”[12,13,14]。但是自杀基因治疗不能有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应, 机体免疫反应是自杀基因旁观者效应的主要因素, 免疫基因治疗虽可提高肿瘤细胞的免疫原性, 诱导机体的抗肿瘤免疫应答, 但直接杀伤肿瘤作用不强, 因此可将自杀基因及免疫基因治疗联合应用以增强疗效[15]。

8.基因鉴定技术的名词解释 篇八

肠激酶(enterokinase, EK)是一种专一识别DDDDK氨基酸序列、并水解K后肽键的丝氨酸蛋白水解酶.根据GenBank序列进行人工合成牛肠激酶轻链基因cDNA,测序正确后将其插入甲醇酵母分泌型载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA/EKL,重组载体经线性化后转化Pichia pastoris SMD 1168H,筛选得到重组牛肠激酶轻链工程菌.分别对重组酵母工程菌进行高密度发酵、 rEKL (recombinant enterokinase light chain, rEKL) 纯化、 N端序列测定、生物学活性鉴定等研究工作.结果表明,发酵上清中rEKL含量高,纯化的rEKL专一性强、无其他杂酶活性、 N端15个氨基酸序列与文献报道一致. 图5 参17

作 者：李德华 苟兴华 胡海洋 徐琦 刘忠荣 吴洽庆 余晓东 LI Dehua GOU Xinghua HU Haiyang XU Qi LIU Zhongrong WU Qiaqing YU Xiaodong 作者单位：李德华,LI Dehua(重庆师范大学生命科学院,重庆,400047;成都地奥制药集团有限公司,成都,610041)

苟兴华,胡海洋,刘忠荣,GOU Xinghua,HU Haiyang,LIU Zhongrong(成都地奥制药集团有限公司,成都,610041)

徐琦,XU Qi(成都地奥制药集团有限公司,成都,610041;四川大学化工学院,成都,610065)

吴洽庆,WU Qiaqing(成都地奥制药集团有限公司,成都,610041;中国科学院成都生物研究所,成都,610041)

余晓东,YU Xiaodong(重庆师范大学生命科学院,重庆,400047)

9.无菌技术的名词解释 篇九

无菌技术是在医疗护理操作过程中，保持无菌物品、无菌区域不被污染、防止病原微生物入侵人体的一系列操作技术。无菌技术作为预防医院感染的一项重要而基础的技术，医护人员必须正确熟练地掌握，在技术操作中严守操作规程，以确保病人安全，防止医源性感染的发生。

无菌技术的基本操作

(一)工作帽的应用

戴工作帽可防止头发上的灰尘及微生物落下造成污染。护理传染病人时，也可保护自己，工作帽大小适宜，头发全部塞入帽内，不得外露。每周更换两次，手术室或严密隔离单位，应每次更换。

(二)口罩的应用

戴口罩可防止飞沫污染无菌物品。口罩应盖住口鼻，系带松紧适宜，不可用污染的手触及。不用时不宜挂于胸前，应将清洁面向内折叠后，放入干净衣袋内。口罩一经潮湿，则病菌易于侵入，应及时更换。

(三)洗手、刷手、消毒手

1.洗手 执行无菌操作、取用清洁物品之前，护理病人前后，接触污染物之后均应洗手。方法：用肥皂搓洗手掌、手背、指间、手指及关节，以环形动作搓擦。而后用流水冲洗双手，将皂沫全部冲净，必要时反复冲洗，最后用清洁小毛巾擦干双手。2.涮手 即利用机械及化学作用去除手上污物及微生物的方法，是做好消毒隔离、预防交叉感染的重要措施。方法：取无菌刷蘸肥皂乳(或肥皂块)，先刷指尖、然后刷手、腕、前臂、肘部到上臂下1/2段，特别要刷净甲沟、指间、腕部，无遗漏地刷洗三遍，每遍3分钟。刷洗时，双手稍抬高。每遍刷完后，用流水冲去肥皂沫，水由手、上臂至肘部淋下，手不能放在最低位，以免臂部的水返流到手。刷洗毕，用无菌小毛巾依次拭干手、臂。手、臂不可触碰其它物品，如污染必须重新刷洗。3.消毒手 消毒液泡手能有效地去除手上的微生物。方法：刷洗后，双手及上臂下1/3伸入盛有消毒液的桶内，用无菌小毛巾轻擦洗皮肤5分钟，手不可触及桶口。浸泡毕，拧干小毛巾，揩去手、臂、消毒液，晾干。双手保持于胸前半伸位准备穿手术衣。

无菌技术的使用法

(1)无菌持物钳(镊)应浸泡在盛有消毒溶液的无菌广口容器内，液面需超过轴节以上2-3cm或镊子1/2处。容器底部应垫无菌纱布，容器口上加盖。每个容器内只能放一把无菌持物钳(镊)。(2)取放无菌持物钳(镊)时，尖端闭合，不可触及容器口缘及溶液面以上的容器内壁。手指不可触摸浸泡部位。使用时保持尖端向下，不可倒转向上，以免消毒液倒流污染尖端。用后立即放回容器内，并将轴节打开。如取远处无菌物品时，无菌持物钳(镊)应连同容器移至无菌物品旁使用。(3)无菌持物钳(镊)不能触碰未经灭菌的物品，也不可用于换药或消毒皮肤。如被污染或可疑污染时，应重新消毒灭菌。(4)无菌持物钳(镊)及其浸泡容器，定期消毒灭菌，并更换消毒溶液及纱布。

(五)无菌容器的使用法

经灭菌处理的盛放无菌物品的器具称无菌容器。如无菌盒、贮槽、罐等。无菌容器应每周消毒灭菌一次。

(六)无菌包的使用法

无菌包布是用质厚、致密、未脱脂的棉布制成双层包布。其内可存放器械、敷料以及各种技术操作用物，经灭菌处理后备用。1.无菌包的包扎法 将物品置于包布中间，内角盖过物品，并翻折一小角，而后折盖左右两角(角尖端向外翻折)，盖上外角，系好带子，在包外注明物品名称和灭菌日期。2.无菌包的打开法 取无菌包时，先查看名称，灭菌日期，是否开启、干燥。将无菌包放在清洁干燥的平面上，解开系带卷放于包布角下，依次揭左右角，最后揭开内角，注意手不可触及包布内面。用无菌钳取出所需物品，放在已备好的无菌区域内。如包内物品一次未用完，则按原折痕包好，注明开包时间，有效期为24时。如不慎污染包内物品或被浸湿，则需要重新灭菌。取小包内全部物品时，可将包托在手上打开。解开系带挽结，一手托住无菌包，另一手依次打开包布四角翻转塞入托包的手掌心内，准确地将包内物品放入无菌容器或无菌区域内(勿触碰容器口缘)，盖好。

(七)无菌盘的铺法

将无菌治疗巾铺在清洁、干燥的治疗盘内，使其内面为无菌区，可放置无菌物品，以供治疗和护理操作使用。有效期限不超过4小时。1.无菌治疗巾的折叠法 将双层棉布治疗巾横折2次，再向内对折，将开口边分别向外翻折对齐。2.无菌治疗巾的铺法 手持治疗巾两开口外角呈双层展开，由远端向近端铺于治疗盘内。两手捏住治疗巾上层下边两外角向上呈扇形折叠三层，内面向外。3.取所需无菌物品放入无菌区内，覆盖上层无菌巾，使上、下层边缘对齐，多余部分向上反折。

(八)无菌溶液的倒取法

取无菌溶液瓶，擦净灰尘，核对标签，检查瓶盖有无松动，瓶壁有无裂痕，溶液有无沉淀、混浊、变色、絮状物。符合要求方可使用。揭去铝盖 常规消毒瓶塞，以瓶签侧面位置为起点旋转消毒后，用无菌持物钳将瓶塞边缘向上翻起，再次消毒。以无菌持物钳夹提瓶盖，用另一手食指和中指撑入橡胶塞盖内拉出。先倒少量溶液于弯盘内，以冲洗瓶口，再由原处倒出溶液于无菌容器中;倒溶液时瓶签朝上。无菌溶液一次未用完时，按常规消毒瓶塞、盖好，注明开瓶时间。

(九)无菌手套的戴法

10.基因鉴定技术的名词解释 篇十

1 材料

病料:从某养殖场采集5只临床症状明显的疑似患犬瘟热(CD)病死貉的肝脏、脾脏、肺脏、肠等脏器,用胶体金试纸条初步鉴定病原为CDV后,放置于-70 ℃冰箱冷冻保存,待用。

Vero细胞,中国农科院特产研究所预防兽医实验室保存;MEM,购自Gibco公司。

E.coli 感受态DH5α、克隆载体pMD18-T、T4连接酶,均购自宝生物工程(大连)有限公司;RT-PCR试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒及Trizol试剂,均购自Invitrogen公司;DEPC,购自Promega公司。

试验动物:6月龄貉(狐狸),由中国农科院特产研究所毛皮动物实验基地提供。

2 方法

2.1 病毒的分离

2.1.1 病料的处理

取病料加入无血清的MEM培养液研磨后,以8 000 r/min离心,取上清液,待用。

2.1.2 病毒的分离培养

将处理好的病料按1∶10的比例接种于长满单层的Vero细胞上,37 ℃吸附2 h;弃去接种病料,加3%MEM维持液于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养,逐日观察细胞病变(CPE),同时设正常细胞对照。

2.2 理化特性鉴定

按参考文献[2]的方法测定分离株对氯仿、乙醚、pH值为3.0和60 ℃的耐受性。

2.3 免疫荧光试验

取接种3代后产生CPE的Vero细胞,用 pH值为7.4的PBS冲洗3次,加丙酮,室温固定10 min;用PBS冲洗3次,加入兔抗CDV阳性血清,37 ℃ 1 h;用PBS冲洗3次,加山羊抗兔IgG荧光标记二抗,37 ℃ 1 h;用PBS冲洗3次,再用双蒸水冲洗,晾干用荧光显微镜观察有无特异性荧光。

2.4 动物回归试验

选5只貉(狐狸)编号,对照组2只,试验组3只:试验组貉(狐狸)用分离到的HLJ(11)株第3代细胞毒采用皮下注射方式进行攻毒,攻毒剂量为4×104.19TCID50;对照组貉(狐狸)皮下注射同样剂量的生理盐水。每天14:00观察记录每只貉(狐狸)的状态变化。

2.5 H基因序列分析

2.5.1 引物的设计

根据GenBank上发表的CDV3 H基因(登录号为EU726268)序列在保守区设计1对检测引物[扩增片段长预计为430 bp,序列为上游引物(P1)5′-ACCAGACAAAGTTGGCTAWGGAT-3′,下游引物(P2)5′-ATGCTTGGTATTACCTCTACTAACTTG-3′]和1对扩增引物[扩增长度为1 879 bp,序列为上游引物(P3)5′-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3′,下游引物(P4)5′-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3′]。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

2.5.2 病毒总RNA的提取及RT-PCR扩增

用Trizol法提取CDV RNA,反转录合成cDNA,反转录体系为5×RT Buffer 6 μL,10 mmol/L dNTP 3 μL,10 μmol/L随机引物5 μL,Rnase 抑制剂(HPRI)0.5 μL,AMV 反转录酶(10 U/μL)1 μL,RNA模板10 μL,DEPC水 5 μL。42 ℃反应2 h,以cDNA为模板应用PCR扩增特异片段。

PCR反应体系:DNA模板1 μL,上、下游引物(20 pmol/μL)各1 μL,Ex Taq DNA聚合酶0.3 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL,用ddH2O补足25 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火40 s(2 min),72 ℃延伸40 s(2 min),共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶鉴定PCR产物。胶回收PCR扩增产物,将其克隆入pMD18-T载体,37 ℃培养,鉴定后挑取阳性克隆送宝生物工程(大连)有限公司测序。

2.6 H基因序列分析

将测序正确的H基因,用DNAStar软件与GenBank 发表的国内外CDV 毒株进行同源性及系统进化树分析。

3 结果

3.1 病毒分离结果

用Vero细胞(见162页彩图1)与病料处理液同步培养和传代, 传至第3代时, 接种后第2天产生细胞病变,见162页彩图2 。

3.2 理化特性

分离株经氯仿、乙醚、酸、热处理后,其TCID50与对照组差值均大于2.0,说明病毒有囊膜,对氯仿、乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱,见表1。

3.3 免疫荧光检测结果

正常的Vero细胞无荧光出现,见162页彩图3),接种病毒液的细胞出现特异性亮绿荧光,见162页彩图4。

3.4 RT-PCR检测结果

应用CDV特异性检测引物,以分离株HLJ(11)的RNA为模板进行RT-PCR扩增,结果显示出现1条430 bp的电泳条带,与预期结果相同,见图5,证明分离株为CDV,并将其命名为HLJ(11)。

M.DL-1 000 Marker;1.阳性对照;2.分离毒株。

3.5 动物回归试验结果

3.5.1 狐狸攻毒病理变化

攻毒第3天攻毒组狐狸脚掌有发红现象;攻毒第7天攻毒组狐狸都有厌食现象,肛门拭子检测阳性。1号狐狸第8天有呕吐、便血现象,第10天有吐血现象,第11天死亡;2号狐狸第11天死亡;3号狐狸第12天死亡。对照组狐狸精神和食欲没有出现异常反应。

攻毒组狐狸剖检后可见肺脏有明显的坏死灶;肝脏表面有出血点;脾脏肿大,有少量的出血点;直肠充气且有出血点。见163页彩图6。对照组狐狸器官正常。

3.5.2 貉攻毒病理变化

第10天,1号貉的肛门拭子检测结果为CDV阳性;第12～13天,攻毒组貂都出现食欲下降,精神状态异常;第17天1号貉不吃食,2号和3号貉拉稀便;第19天2号貉死亡;第22天3号貉死亡。对照组貂食欲和精神状态良好。

攻毒组貉剖检后可见肺脏局部有坏死灶;膀胱有大量出血点;肝脏质脆,有出血点;脾脏肿大。见163页彩图7。对照组貉器官正常。

3.6 H基因序列分析结果

3.6.1 RT-PCR结果

应用测序引物以分离株HLJ(11)的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到1条1 879 bp的电泳条带(见图8),与预期结果相同。

M.DL-2 000 Marker;1.阳性对照;2.Vero细胞对照; 3.空白对照;4.目的基因。

3.6.2 H基因序列分析

H基因的测序结果显示,其ORF全长为1 824 bp,编码608个氨基酸。利用DNAStar软件对分离株HLJ(11)与GenBank上发表的24株CDV毒株的核酸序列进行同源性分析,结果显示,其与HeB(07)1、SD(09)3、SD(07)1同源性最高,分别为99.9%、99.7%、99.6%;与Strain CDV 3、Convac vaccine strain的同源性最低,为91.4%。

应用DNAStar 软件的Clustal方法对分离株HLJ(11)的H基因序列进行比对并构建系统进化树,见图9,可见分离株HLJ(11)属于Asia-Ⅰ型。

4 讨论

可用于分离犬瘟热病毒的细胞有很多种,但近年来,Vero细胞被认为是分离培养CDV的首选细胞[3]。通常认为,CDV在犬肾细胞上生长缓慢,而利用鸡胚成纤维细胞初代分离困难,需经鸡胚绒毛尿囊膜多次传代才能适应,分离效果不好,周期长。但是 MDCK 细胞对 CDV 的分离最有效而且在该细胞上能够最早检测到 CDV 的增殖[4],国内也有应用 MDCK 细胞成功分离犬源 CDV 的报道。本试验选择Vero细胞,所分离病毒在Vero细胞上生长稳定,CPE出现规律,能够很好地分离出CDV。

CDV H蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一,是抗CDV免疫中很重要的抗原;同时H蛋白决定着病毒感染的宿主特异性,而且较大的H蛋白极易发生变异,从而引起CDV毒力的变化。目前,依据 H 基因序列可将CDV分为 Asia-Ⅰ、America-Ⅱ、European Wildlife、Europe、Arctic-like、Asia-Ⅱ、PDV、America-Ⅰ( Vaccines) 7 个基因型。遗传进化树分析结果表明,分离毒株HLJ(11)与CDV弱毒疫苗株Onderstepoort、Convac亲缘关系甚远。而为了更有效地免疫保护动物,对目前的犬瘟热流行毒株借助基因工程技术研制新型疫苗,对现有疫苗毒株进行改进可能会是一种行之有效的思路。

参考文献

[1]陆承平.兽医微生物学[M].3版.北京:中国农业出版社,2001.

[2]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997.

[3]LOFFLER S,LOTTSPEICH F,LANZA F,et al.CD9,a tetraspantransmembrane protein,renders cells susceptible to canine distempervirus[J].J Virol,1997,71(1):42-49.

11.医学影像技术的名词解释 篇十一

医学影像技术的培养模式

按国家教育部颁布的《普通高等学校本科专业目录》(教高[] 8号)所列的“医学影像学”专业，学制应为五年，授予学位是医学学士。学生的培养目标是“具有基础医学、临床医学和现代医学影像学的基本理论知识及能力，能在医疗卫生单位从事医学影像诊断、介入放射学和医学成像技术等方面工作的医学高级专门人才”。

按照这一培养目标：学生就业后，既能从事医学影像诊断医师工作，也能从事医学影像技师工作。四年制医学影像学专业是国家为适应医疗卫生事业改革和发展形势的需要，满足医疗卫生岗位对人才的需求而设置的本科专业，按照教育部文件规定，四年制医学影像专业授予学位是理学学士。目前，笔者还没有见到有关权威部门或机构制定的四年制医学影像学专业的培养目标，但是，根据所授学位类别可以确定培养目标定位在“能在医疗卫生单位从事医学成像技术的医学高级专门人才”，可以猜测说培养的是医学影像技师;

其次，根据卫生部《关于印发<医师资格考试报名资格规定(版)>的通知》(卫医发(2006)125号)文件十五条之规定，“医学技术类等相关医学类”及“医学专业毕业，但教学大纲和专业培养方向或学位证书证明学位是非医学的”不予受理医师资格考试报名，这也为四年制医学影像本科专业的发展方向“定了调”。虽然目前各省、市在执业医师资格报名时政策把握的尺度有所差异，但作为授予理学学士的四年制医学影像专业本科生目前的专业发展力一同是明确的。

12.元认知干预技术的名词解释 篇十二

其二是自我修养和发展元认知智慧的含义：指掌握了元认知干预技术的人们自觉地控制自身的潜意识心理活动，实现健康、潜能开发、人格优秀等目的的自我心理修养方法体系。

★ 干预的近义词

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★ 组织名词解释

★ 心肌梗死名词解释

★ 名词解释感谢信

★ 公共行政名词解释

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★ 暗娼干预实习报告

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13.基因鉴定技术的名词解释 篇十三

关键词：玉米,转除草剂基因,鉴定

1试验设计

1.1试验处理

选用除草剂41%农达作为原始溶液, 在0.1%~2.1%之间间隔0.2梯度设置11个浓度梯度, 即:0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1。

稀释溶液时加几滴吐温20。

1.2试验材料

选用4个杂交组合 (包括两个转基因组合F1、F2, 两个非转基因组合F3、F4) , 4个自交系 (包括两个转基因材料L1、L2, 两个非转基因材料L3、L4) 共8份材料。

1.3播种方式

每份材料播种100株。

1.4药剂处理方式

在幼苗长到3~8叶时, 用软毛刷涂抹幼苗最上部的2片展开叶片, 涂抹量以叶片上有药滴滴落为准, 涂抹时间在上午没露水之后, 各株间掌握涂抹量均匀一致, 每个处理涂抹5株。试验中不同处理的表示方法为:1代表0.1%浓度处理, 2代表0.3%浓度处理, 3代表0.5%浓度处理, 4代表0.7%浓度处理, 5表示0.9%浓度处理, 6表示1.1%浓度处理, 7表示1.3%浓度处理, 8表示1.5%浓度处理, 9表示1.7%浓度处理, 10表示1.9%浓度处理, 11表示2.1%浓度处理。

1.5田间调查

涂药后3 d、6 d、9 d和12 d各调查1次, 记载每品种的叶片萎蔫情况及死苗情况。1.6涂药日期

6月21日涂药。

2各材料组合涂药后叶片及植株反应

见表1。

3试验结果及结论

通过试验可以得出以下结论。

(1) 不同材料对除草剂的敏感性不同, 自交系比杂交种要敏感。

(2) 转基因的材料在设定的药剂浓度范围内都表现抗药性, 在所调查的时间段内没出现萎蔫及死苗情况。

14.高电压技术的名词解释 篇十四

进行高电压试验需要有正确的试验方法，如耐压试验、介质损耗试验、局部放电试验等。高压电工设备外绝缘的介电强度，受气压、温度、湿度、风沙、污秽、雨水、射线等因素的影响，需要有不同条件下的换算法和等效的试验方法。

高电压测量装置和测量技术是正确进行高电压试验的基础。对不同类型的高电压需采用不同的测量装置。如测量直流电压或低频交流电压的有效值用高压静电电压表;测单次短脉冲(微秒或纳秒级)用高压示波器，测高电压下的脉冲大电流一般用罗戈夫斯基线圈。此外常用的高电压测量装置还有各种分压器、分流器、局部放电仪等。60年代以来，光电测试技术引入高电压领域，它将高电位端的量(如高压回路的电流)转变为光信号，通过光纤传送到低电位端的接受仪器，再将光信号转为电信号，避免了高电压传到低电压的测量系统而引起的危险，以及电磁场对低电压测量系统的干扰。

15.基因鉴定技术的名词解释 篇十五

4株苯系物降解菌菌株的筛选鉴定、降解特性及其降解基因研究

分别以苯、甲苯为碳源,从厦门污水处理厂活性污泥中富集筛选获得了2株苯降解菌B1、B2和2株甲苯降解菌J2、J6.16S rRNA基因鉴定结果表明B1、J2属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.),B2、J6属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.).研究表明,这些菌在pH7～10的碱性范围内能很好生长.在以0.1%(V/V)苯或甲苯为唯一碳源的无机盐培养基中,B1、B2菌在72小时内对苯的.降解率分别为67.7%、94.2%,J2、J6菌对甲苯的降解率分别为92.4%、84.8%.简并PCR扩增、序列分析表明,这些菌含有相同的苯双加氧酶基因,表明苯降解基因在这些降解菌中可能存在水平转移.此外,J2,J6两株菌还含有甲苯双加氧酶基因,而且J2能在甲苯浓度为70%(V/V)的LB培养基中生长.这些降解菌在苯、甲苯污染的生物治理中有应用前景.

作 者：王琳 邵宗泽 WANG Lin SHAO Zong-ze  作者单位：国家海洋局第三海洋研究所,海洋生物遗传资源重点实验室,厦门,361005 刊 名：微生物学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA MICROBIOLOGICA SINICA 年，卷(期)： 46(5) 分类号：Q93 关键词：苯系物   生物降解   有机溶剂耐受性   双加氧酶基因  

16.基因鉴定技术的名词解释 篇十六

1 材料

pEGFP - N1 质粒、N1 - p Kap - 2s质粒,内蒙古生物制造重点实验室提供; att B基因、引物,生工生物工程( 上海) 股份有限公司生产。

限制性内切酶( AgeⅠ、NotⅠ、StuⅠ、Eco O109Ⅰ、AatⅡ、Ase Ⅰ、Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ) ,宝生物工程( 大连)有限公司提供; 连接酶( Ligation High) ,Fermentas公司提供; 抗生素( 卡那霉素) ,北京华越洋生物科技有限公司提供; 感受态细胞( DH5α) ,北京全式金生物技术有限公司提供; 琼脂糖、核酸染料、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒,天根生化科技( 北京) 有限公司提供。

恒温培养箱、低温冰箱、普通PCR仪( AB 2720) 、超微量紫外分光光度计,购自Thermo公司; 电热恒温水浴锅,购自Poly Science公司; 普通台式离心机,购自Sigma公司; 微量移液器,购自Eppendorf公司。

2 方法

2. 1 主要试剂和培养基的配制

LB液体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,加纯化水定容至200 m L,调p H值为7. 0,灭菌,4 ℃保存。

LB固体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,调p H值至7. 0,加琼脂3. 0 g,再加纯化水定容至200 m L,灭菌,4 ℃保存。

10 × TAE电泳缓冲液: Tris碱54 g,硼酸27. 5 g,二水合乙二胺四乙酸二钠3. 72 g,用纯水( 用焦碳酸二乙酯处理过) 定容至500 m L,室温保存。

2. 2 引物的设计( 序列见表1)

注: 方框部分为酶切位点,下画线部分为添加的Loxp序列。

2. 3 目的基因的体外扩增

2. 3. 1EGFP片段的扩增利用引物PF - G和PR - G,以p EGFP - N1 质粒为模板,采用PCR扩增EGFP片段,扩增后的EGFP片段上游含有Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃保存,备用。

PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - G 2. 5 μL,10 mmol/L PR - G 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 2 Neo - HSV - TK - Poly A片段的扩增利用引物PF - K和PR - K,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增Neo - HSV - TK - Poly A片段,扩增后的Neo - HSV - TK - Poly A片段下游含有与EGFP片段上游同向的Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。

PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - K 2. 5 μL,10 mmol/L PR - K 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 3CMV片段的扩增利用引物PF - CMV和PR - CMV,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增CMV,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。

PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - CMV 2. 5 μL,10 mmol / L PR - CMV 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,59 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 4 Kap - 2s - Poly A片段的扩增利用PF - 2s和PR - 2s,以N1 - p Kap - 2s质粒为模板,PCR扩增Kap - 2s - Poly A片段,胶回收测浓度,- 20 ℃ 保存,备用。

PCR反应体系: 模板N1 - p Kap - 2s 0. 4 μL( 512 ng /μL) ,10 mmol/L PF - 2s 2. 5 μL,10 mmol/L PR - 2s 2. 5 μL,2 × GC Buffer 25 μL,d NTP 5 μL,LATaq DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,56 ℃1 min,72 ℃ 150 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 5att B片段的合成att B( 301 bp) 基因由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成,合成时两端已添加AseⅠ酶切位点。

2. 4 p EGFP - N1 - 2s重组质粒的构建

2. 4. 1含有Loxp序列的EGFP基因片段与p EGFP -N1 质粒的连接EGFP基因片段经AgeⅠ和NotⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 经AgeⅠ和NotⅠ37 ℃ 双酶切1 h,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定胶回收EGFP和p EGFP - N1 的浓度,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 34. 1 ng / μL EGFP4. 5 μL,20. 7 ng / μL p EGFP - N1 1. 5 μL,Solution Ⅰ6 μL。

转化: 连接产物转化感受态细胞( DH5α) ,冰浴30 min; 42 ℃ 热激45 s,再冰浴2 min; 加入500 m L室温的LB液体培养基,37 ℃、220 r/min摇床振荡1 h;将菌液4 000 r/min离心1 min; 弃上清液,留200 μL,然后混匀菌液,取100 μL涂在LB( 已加入卡那霉素)平板上,37 ℃倒置培养过夜。如果转化成功,次日平板上会长出菌落。挑取单菌落于LB( 已加入卡那霉素) 液体培养基中,37 ℃、220 r/min摇床振荡14 ~16 h,提取质粒并酶切鉴定,选择结果阳性的质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP - N1 - G。

2. 4. 2含有同向Loxp序列的Neo - HSV - TK -Poly A片段与p EGFP - N1 - G质粒的连接Neo -HSV - TK - Poly A片段经StuⅠ和Eco O109 Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 - G经StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 30. 6 ng /μL Neo - HSV - TK -Poly A 5 μL,23. 2 ng / μL p EGFP - N1 1 μL,SolutionⅠ6 μL。

用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,酶切鉴定,结果阳性的送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP -N1 - GK。

2. 4. 3p EGFP - N1 - GK质粒中启动子CMV的破坏和att B的连接将重组质粒p EGFP - N1 - GK进行AatⅡ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,破坏原CMV片段,胶回收后测定浓度,16 ℃ 过夜连接。连接体系:56. 3 ng / μL p EGFP - N1 - GK 5 μL,去离子水1 μL,SolutionⅠ 6 μL。

用同样方法进行转化,并对破坏CMV后的重组质粒进行菌落PCR鉴定。

att B片段经AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将破坏CMV的重组质粒进行AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 2. 4 ng /μL att B 5 μL,46. 3 ng / μL重组质粒1 μL,Solution Ⅰ6 μL。

用同样方法进行转化、摇菌,提取质粒进行酶切鉴定,结果为阳性的重组质粒命名为p EGFP - N1 -att B。

2. 4. 4CMV片段与p EGFP - N1 - att B质粒的连接CMV片段经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将上一步的重组质粒p EGFP - N1 - att B进行Bam H Ⅰ 和Age Ⅰ 双酶切( 37 ℃1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 18. 5 ng / μL CMV4. 5 μL,33. 6 ng / μL p EGFP - N1 - att B 1. 5 μL,SolutionⅠ 6 μL。

用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确的命名为p EGFP - N1 - att B - C。

2. 4. 5 Kap - 2s - Poly A片段与p EGFP - N1 - att B -C质粒的连接p EGFP - N1 - att B - C质粒进行XhoⅠ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定浓度,采用无缝克隆法与Kap - 2s - Poly A片段50 ℃ 连接15 min。连接体系: 线性40 ng / μL p EGFP- N1 - att B - C 2 μL,80 ng / μL Kap - 2s - Poly A1 μL,5 × In - Fusion HD Enzyone Premix 2 μL,用去离子水补至10 μL。

用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确即为重组质粒p EGFP - N1 - 2s。

3 结果与分析

3. 1 目的基因的体外扩增

3. 1. 1 EGFP片段和Neo - HSV - TK - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,分别获得1,2 泳道1 300 bp左右的条带和3,4 泳道的770 bp左右的条带,均与Neo - HSV - TK - Poly A片段和EGFP片段大小相符( 见图1) ,表明目的基因的体外扩增成功。

M.DL-2 000 Marker;1~4.PCR产物。

3. 1. 2 CMV片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与CMV片段大小相符( 见图2 ) ,表明目的基因的体外扩增成功。

3. 1. 3 Kap - 2s - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1 泳道的2 300 bp左右的条带,与Kap - 2s - Poly A片段大小相符( 见图3) ,表明目的基因的体外扩增成功。

M． DL － 2 000 Marker; 1，2． PCＲ 产物。

M.DL-5 000 Marker;1.PCR产物。

3. 2 重组质粒的鉴定

3. 2. 1 p EGFP - N1 - G和p EGFP - N1 - GK质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - G进行AgeⅠ和NotⅠ双酶切电泳,获得1 泳道770 bp左右的条带,大小与EGFP片段相符。将重组质粒p EGFP - N1 -GK进行StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切电泳,获得2 泳道1 300 bp左右的条带,与Neo - HSV - TK - Poly A片段大小相符( 见图4) 。初步证明EGFP片段和Neo -HSV - TK - Poly A片段连接成功。

3. 2. 2 p EGFP - N1 - GK质粒测序鉴定重组质粒p EGFP - N1 - GK由生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,结果表明在EGFP起始密码子ATG上游和Neo - HSV - TK - Poly A下游均有Loxp的正确序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。综上所述,两段同向的Loxp序列连接成功。

3. 2. 3 p EGFP - N1 - att B质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B进行AseⅠ单酶切电泳,获得3,7 泳道的300 bp左右的条带,与att B片段大小吻合( 见图5) ,初步证明att B片段连接成功。

3. 2. 4p EGFP - N1 - att B - C质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C进行Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与目的片段CMV大小吻合( 见图6) ,初步证明CMV片段连接成功。

M． DL － 5 000 Marker; 1，2． 酶切产物。

M.DL-5 000 Marker;1~7.酶切产物。

M.DL-5 000 Marker;1,2.酶切产物。

3. 2. 5 p EGFP - N1 - att B - C质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果证明att B和CMV连接成功。

3. 2. 6p EGFP - N1 - 2s质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s进行Xho Ⅰ 单酶切电泳,获得2 300 bp左右的条带,与目的片段大小吻合( 见图7) ,初步证明Kap - 2s - Poly A片段连接成功。

M.DL-5 000 Marker;1.酶切产物。

3. 2. 7 p EGFP - N1 - 2s质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确,证明p EGFP - N1 - 2s片段连接成功,可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP - N1 - 2s构建成功,见286 页彩图8。

4 讨论

试验以Cre /Loxp［7］系统为基础去除筛选标记基因,在需要切除的基因两端分别添加同向的Loxp序列,转染细胞后,Cre穿肽膜可以识别Loxp序列并且切除其中间的标记基因,达到去除筛选标记的作用。

为了能够实现目的基因在细胞内的定点整合,试验采用了phi C31 整合酶系统,在构建的载体中添加att B位点,与phi C31 整合酶［8］共转染细胞,phi C31 整合酶可以介导att B［9］位点整合到细胞中的假attp位点上,从而达到了目的基因的定点整合。

试验还采用了无缝克隆［10］的技术连蛛丝蛋白基因与载体,无缝克隆( seamless cloning /in - fusion cloning)［11］区别于传统的PCR产物克隆,唯一的差异在于载体末端和引物末端具有15 ~ 20 个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15 ~ 20 个与载体序列同源的碱基,依靠碱基间作用力互补配对成环,无需酶连即可直接用于转化宿主菌,进入宿主菌中的线性质粒( 环状) 依靠自身酶系将缺口修复。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克隆的重组载体。

此外,本研究旨在建立无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为后续核移植生产无标记的转基因动物奠定基础［12］,所以前期需构建无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体。

5 结论

试验构建的含Loxp序列、att B位点和拟蛛丝蛋白基因( 2s) 的p EGFP - N1 - 2s表达载体经PCR、酶切检测为阳性,测序正确,可以用于后续培养无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为核移植提供安全的供体细胞。

摘要：为了构建可定点整合的无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体,试验以p EGFP-N1为骨架载体,并采用PCR技术分别添加Loxp和att B片段,利用无缝克隆法将拟蛛丝蛋白基因(2s)连入质粒,经过转化、阳性克隆筛选、酶切及DNA测序鉴定。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致。说明试验成功构建了可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP-N1-2s,可用于无筛选标记的转基因供体细胞的构建。