动物细胞工程论文

动物细胞工程论文（11篇）

1.动物细胞工程论文 篇一

教学准备

1.教学目标

简述动物细胞培养的过程、条件及应用。

2.难点

1.教学重点

动物细胞培养的过程及条件。

2.动物细胞培养的过程及条件。

3.教学用具

4.标签

教学过程

【导入】复习提问

植物细胞工程常用的技术手段有哪些?

这些技术的理论基础是什么?

动物细胞全能性如何?

【活动】自学P44－46(第一段)

自学P44-46(第一段)，思考并标记:

1、动物细胞培养的概念、原理是什么?

2、动物细胞培养的过程是什么?

3、什么叫细胞贴壁、接触抑制、原代培养、传代培养?

【活动】思考讨论

1、动物细胞培养的过程可分为哪几个阶段?

制备细胞悬液;原代培养;传代培养。

2、幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养?思考一下，这是什么道理?

一般来说，幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。

3、为什么动物细胞培养过程要将组织分散成单个细胞?

成块的组织细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增殖，也不利于细胞营养物质的吸收和代谢废物的排出。

4、如何将动物组织分散成单个的细胞呢?

先用剪刀剪碎，后用蛋白酶处理。

5、由此可说明细胞间的物质是什么成分?

细胞间的成份有蛋白质。

6、什么是细胞贴壁?

细胞贴壁:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

7、对培养瓶或培养皿有什么要求?

光滑，无毒，易于贴附。

8、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖?

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。

9、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办?

将贴满瓶壁的.细胞用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞增殖。

这样的过程叫做传代培养。

10、如何理解原代培养和传代培养?

上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养;

之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养。

11、传代培养的细胞都能一直传代下去吗?

不都能。

12、有些为何能一直传下去?

发生突变，朝着癌细胞方向发展。

13、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗?

不全是。

14、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体?

不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。

【活动】小组讨论：

动物细胞培养的具体过程是什么?

(用图解反映大致过程)

【活动】讨论

多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题:

1.体外培养动物细胞时需要提供哪些物质?

2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件?

2.动物细胞工程论文 篇二

动物细胞培养技术在生物、医学等研究领域都有着广泛的应用, 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。动物细胞的生长除了要给细胞组织提供一个无菌、恒温的环境, 还要给予充分的营养。动物细胞培养技术有着很大潜力的开放空间, 前景光明, 但是它同时也面临着技术方面的诸多问题和挑战。本文将通过分析细胞喂养技术取得的进展, 探讨动物细胞培养存在的问题以及动物细胞未来的发展方向, 从而建立并筛选出合适的细胞系培养方法。

1 动物细胞培养的基本概念

细胞培养指的是从体内组织取出细胞, 并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境, 给予充分营养, 使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段, 也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后, 由于受群体环境影响, 需要转移到另一个容器, 这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话, 则表示传代成功, 这些细胞称为细胞系或细胞株。

2 动物细胞培养技术的内容

2.1 体外培养动物细胞的生物学特性

动物细胞没有细胞壁结构, 机械强度低, 对剪切力较为敏感, 因此无法很好地适应体外环境。此外, 在体外进行培养的细胞失去了神经体液调节以及细胞间相互影响等作用, 她们不仅失去原有组织结构, 还不易保持原有细胞形态, 处于缺乏动态平衡的生活环境中, 分化能力也降低, 直至发展成为恶性细胞。因此, 在体外进行动物细胞培养应密切关注体外细胞的状态, 生长环境提供的条件是否适宜生存, 有无被微生物感染等。

2.2 细胞培养所需环境

(1) 无菌无毒环境无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代谢物质影响的难题, 因此, 在进行体外细胞培养时, 要及时清除细胞产生的代谢废物, 确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。

(2) 气体环境气体主要是O2和CO2, O2可以给细胞提供能量, 而CO2不仅是细胞增殖所需的物质, 也是其自身的代谢产物, 此外, CO2还有着调节培养基p H的作用。

(3) 温度适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长, 若温度超出适宜温度范围, 不仅会影响到细胞的正常代谢, 损伤细胞, 甚至会使其致死。

(4) 缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液, 提供水分和无机盐, 维持细胞的正常代谢。

(5) 培养基培养基分为天然培养基和合成培养基两种, 它是细胞生长繁殖的直接环境, 为细胞提供所需的营养。天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。动物细胞培养主要用的是合成培养基。合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质, 有特殊要求的还会添加适量血清。

2.3 细胞培养方式

(1) 贴壁培养对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。一般这样的细胞需贴附于不起化学作用的物质的表面生长, 最终在表面生长至单层, 当整个平面被铺满时, 细胞会出现接触抑制的现象。

(2) 悬浮培养悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面, 细胞可悬浮于液体培养基, 并大量增殖。因此, 悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。

(3) 固定化培养无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。固定化培养属于包埋培养方式, 目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。固定化培养不仅剪切力较低, 传递效果较好, 而且还易于收集并分离纯化细胞产物。用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力, 细胞生长较为集中, 生长密度也高。

3 动物细胞培养存在的问题及展望

近一个世纪以来, 动物细胞培养技术经过研究人员的不断开发, 已经有了很大的进步。但是, 目前的技术水平还无法彻底满足细胞生物制品开发和生产的要求。首先, 由于动物细胞培养的技术和方法还不太成熟, 细胞的成活率和利用率较低, 从而造成动物细胞技术效率较低的现象发生。其次, 在进行较长时间、较大规模的细胞培养中, 工作人员无法排除细胞代谢产物对自身的影响, 且细胞群体的生理机能也会在这个过程中受到影响, 一般会表现出分泌和代谢能力的降低甚至丧失。此外, 动物细胞培养技术所用的培养设备和培养用微载体耗费昂贵, 导致研究成本增加, 限制了我国大规模开展动物细胞培养的工程。

4 总结

动物细胞培养技术在未来的发展方向应将重点放在优化细胞环境, 改进细胞特性等方面上, 最终达到提高生物制品的产率和产量, 扩大生产规模的效果。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。在不久的将来, 许多生物实验材料和工业化生产都需要动物细胞培养技术来开展自身的研发工作。

参考文献

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[2]郑鑫, 等.中国林蛙输卵管上皮细胞的培养及其生物学特性研究[J].食品科学.2006, 5.

3.动物细胞工程论文 篇三

关键词：克隆 核移植 异常发育

中图分类号：Q132 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）14-0036-03

1997年2月27日，英国《自然》杂志公布了一项爱丁堡罗斯林研究所威尔莫特等人的研究成果：经历了247次失败之后，终于在1996年他们得到了一只克隆雌性小绵羊，取名“多利”。自从多利产生国内外生物科学工作者在克隆动物技术上取得了显著的成绩。在畜牧业中，克隆动物具有提高动物生产性能、繁育优良品种、改善畜产品质量等优势；在医药方面，克隆动物在研究人类疾病模型、异种器官移植和生产生物医药产品方面都显示出了巨大的研究潜力。但是目前生产的克隆动物普遍出现死亡率高，个体发育不正常的现象。通过研究发现这一现象与许多细胞因素有关，包括：核供体的重编程、卵母细胞的成熟发育、X染色体活性和基因表达、线粒体的变化、细胞因子的效应等。

1 核供体重编程和卵母细胞成熟

核移植一大目的就是获得多产的后代，但是要成功的获得后代还需要许多事件能够正常发生。首先就是核供体需处在一种能够被重塑，基因组能够被逐渐的重编程的状态；其次就是受体卵母细胞必须成熟，能够启动重组胚的发育；再者，就是体外培养体系必须适应这种胚胎的生长需求。代孕动物的生理状态对核移植后代的成功繁育也有着十分重要的影响，例如，处于排卵前或是排卵后的状态，不同的季节等对应的胚胎的妊娠率和分娩率都有所不同。

核移植过程中，目前不仅囊胚发育率和妊娠率较低，而且产生的后代个体也多有异常问题而出现新生胎儿出生不久就死亡的现象。主要表现在胎儿个头大，心脏肥大、卵圆孔闭合不全、瓣膜发育不全，肝脏肿大和充血、肝组织发育不全、脂肪沉积严重，肺不能正常充气、形态畸形，脾脏较小、出血，肾脏不成形、伴有大量脂肪沉积，脑组织发育不全、含量少，等。1-7究其原因，除了上面提到的，估计得追溯到表观修饰异常和发育相关基因表达异常等细胞内深入的活动机制上来。8-10

2 X染色体

由于剂量补偿效应，哺乳动物的雌性胚胎中的一条X染色体会发生失活。Xist基因的表达决定了这一效应的发生，而且Xist在二细胞时期就开始表达。其表达还引起了子代细胞中X染色体复制不同步，特别是在胚胎致密化之后，这种不同步X复制的细胞比例逐渐增加。

体外生产的胚胎在培养过程中，雄性胚的生长状况要优于雌性胚，特别是在培养液中含有高浓度的葡萄糖、血清以及相对较高的温度都会给雌性胚的生长带来不利影响。这种发育的二态现象，很可能是由于培养环境引起了基因的差异表达。但让人迷惑的是，有一研究发现，有384个基因在正常胚与体外形成胚里表达有差异，其中85%基因在IVP胚胎中表达下调；而与X染色体相关的基因表达却上调11，而且这一情况在雄性胚和雌性胚中相同。Xist与二态现象之间究竟有什么样的关系人需要进一步探索。

在研究X相关基因在存活和死亡克隆牛中的表达时，发现很多基因出现异常表达。有意思的是，Xist基因在雄性克隆牛的组织中呈高度甲基化，而在雌性克隆牛组织内Xist普遍处于低甲基化水平，而且出生后死亡的克隆牛比围产期死亡的还要低。这与核重编程不完全有很大的关系，而且与X染色体选择性随机失活受到干扰有关。尽管Xist基因的甲基化和Xist的转录都有是组织差异的，但是Xist基因DNA甲基化程度高的样品的Xist转录水平也高，这似乎暗示着还存在其他因素在调控Xist转录上起着更大的作用。总之，X染色体的剂量效应及其印记修饰状况与胚胎的正常发育有着重要的作用。

3 线粒体

线粒体在机体里发挥重要作用，它不仅给细胞直接提供能量，而且能维持细胞稳态，介导了信号转导和凋亡等生理活动。线粒体在细胞内的数量，形态和分布状态都影响着细胞的生理功能。线粒体内部基因功能不全，其分离、融合等过程都受到核基因的协作。在成熟的卵母细胞中线粒体的拷贝数约为105个，当其受精后，胚胎发育到囊胚的这段时期，线粒体都不重新合成，都是使用卵母细胞遗传而来的线粒体。近来，研究发现含有高拷贝线粒体的卵母细胞其受精率更高，而且对胚胎发育更有利。Wai等发现含有4000个拷贝的线粒体能够发育到胚胎附植前，而要能够完成完成附植后发育线粒体的数量至少要40000-50000个12。对附植前的胚胎进行研究，发现体外培养条件能引起胚胎内线粒体过早的开始复制，线粒体的形态与定位模式也有所改变。但是目前线粒体影响细胞功能的详细机理还不太清楚。

4 细胞因子

目前，由体细胞核移植或体外受精生产的胚胎成功发育为个体的成率要低于10%。高达70%的核移植胚胎在妊娠的前三个月就会发生流产。而胎盘发育异常是这一现象的主要原因，表现为胎盘子叶重量增加，胎盘子叶数量减少。即使部分胚胎幸运地发育到个体，不少个体也会出现巨大综合症。这些克隆带来的非正常现象，主要与基因不能按照正常的模式表达有关。其中，与细胞分裂增殖和个体生长发育密切相关的类胰岛素生长因子，及其对应的受体和结合蛋白的正常表达对维持胚胎的正常发育有重要的意义。

IGFs有两种类型，IGF-I和IGF-II。IGF-I既有促进生物合成代谢的功能，又有促生长的功能。IGF-II可以介导酶和生物大分子的降解。结合蛋白除了能运输IGFs帮助其定位外，还能延长其半衰期以及调节其活性。它们在胚胎发育期的一个重要的作用就是可以调节出生个体的大小。

研究发现：在25日龄牛胚中，体外受精产生的胚胎表达的IGF-I的水平要显著高于正常发育的胚胎组织；核移植形成的胚胎表达的IGF-II的水平又要显著高于体外受精形成的胚胎；核移植产生的胚盘组织中表达的IGF-II的水平也要显著高于正常的胚盘13。研究还发现：看似正常的克隆牛在出生时血浆中IGF-II的浓度明显高于人工受精的正常对照牛，而出生15天后的IGF-II浓度明显降低； IGF-I在妊娠150天胎儿血浆中的浓度明显高于IVP的正常对照；核移植胎盘尿囊液中IGFBP-l的水平也明显升高14。

5 结语

当前动物克隆技术作为一项新技术，由于其巨大的科研价值和应用价值而发展迅速，但是克隆动物成活率低成为此项技术的制约瓶颈，在克隆动物技术中还存在许多科学问题仍尚待解决。克隆动物的异常发育原因可能与细胞内活动的许多因素都相关，除了上诉提到的因素以外，还有组蛋白的修饰、其他类型的细胞因子、体外培养条件等方面的因素。时下较为流行的重编程理论和表观遗传学理论还不能在微观层面深入对异常发育现象作出合理的解释，新的研究方法和技术以及新发现急需出现。

参考文献

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12 Wai， T.，Ao， A.， Zhang， X.， Cyr， D.， Dufort， D.， Shoubridge， E.A.. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.Biol.Reprod. （2010） 83 52 62.

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4.动物细胞培养总结! !!! 篇四

1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装

离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。

蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。

过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。

过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。

玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。（2）消毒灭菌

1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。

2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。

玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。2.无菌间消毒及设备检查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。

用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。

紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。3.细胞培养用液的配置及分装

RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水，NaHCO3溶于水后，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。

双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。

二．操作步骤 注意事项：

1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。

2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。开始工作：

1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。

2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。1.细胞复苏

提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。

将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。

戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。(注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。封上封口膜。

低俗离心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。37度恒温箱中培养。第二天观察细胞生长情况。培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。2传代培养

附着型胞(adherentcell)传代培养

离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。

轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。）

轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍台子，灭酒精灯。

3细胞换液

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。

用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。旋紧瓶盖。将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。

4细胞冻存 1>准备工作：

提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。

进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30，过后，关闭紫外灯，通风10min。从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基，血清37度水浴。取出室温放置的DMSO。找到防水的医用胶布，滤菌膜，针管和所需枪头饭盒等物品，喷一遍酒精，放入台子照紫外。2>开始工作：

实验前在更衣间换上紫外照过的白大褂和拖鞋。戴上橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。酒精擦拭胰酶、PBS缓冲液、培养基放入超净台。过火镊子取出离心管于试管架，剪好封口膜备用。用滤菌膜和针管过滤DMSO以除菌。

75%无血清培养基，20%的血清，5%过滤除菌的DMSO，混匀配制成所需的冻存液。

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，挂壁残液注意用酒精棉擦去，用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量胰酶约2ml，弃掉枪头。消化数分钟，等待期间，用过火镊子从饭盒中取出冻存管和管盖标记好细胞名称和冻存日期，直立于台面备用。

用微量枪加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。离心5min，1000转/min。

细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。用微量枪将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。用微量枪将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口膜封口，防水医用胶布再缠一圈，标签时间，细胞名称。

冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 铺板和细胞计数

用传代方法制成细胞悬液。倒掉培养基，用PBS液洗涤后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培养液吹打制成待测细胞悬液转至离心管，封上封口膜，离心1000r/min,5min。

等待离心其间，取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，将盖玻片盖在细胞计数槽上，使覆盖细胞计数板上的上下两个“十字”区域。取一只新的15ml离心管，做好标记，摆放好。离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，加入全培养液吹散沉淀细胞成细胞悬液，拧紧管盖，上下颠倒混匀。用枪吹打混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取1ml细胞悬液移入新的15ml离心管，加入4ml完全培养液，即稀释五倍，吹打混匀细胞悬液，上下颠倒混匀细胞悬液。

上下颠倒混匀新15ml离心管内细胞悬液，计数前将待测液吹打均匀，用微量枪从新15ml离心管中取出细胞悬液（约10μl），滴入计数板上盖玻片的一侧缝隙旁，虹吸作用液体会吸入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数，注意滴入悬液量不能太大致使细胞悬液流入旁边的槽中），镜下观察细胞，数出计数板四角大方格中的细胞数（16个小格×4个大格），用计数器计数（约200个）

细胞数 万个/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×稀释倍数（常稀释5倍，若细胞过多不能数清则加大稀释倍数，不断调整新离心管中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。）每皿/瓶需铺板50-100万个细胞，根据细胞计数算出每皿所细胞悬液需毫升数，加入悬液时注意混匀，不得有气泡，吸时注意每次枪尖是否都吸满液体。每皿加入细胞悬液后，用含血清培养基补足至2ml/皿/瓶。24h后观察细胞长至八成满时即可加药处理。

6检验判断细胞状态与加药处理

细胞复苏或传代后24内不可传代，传代4小时后开始贴壁。1>培养基颜色澄清度：

正常生长的细胞培养基澄清透明，倾斜使培养基聚集，对着灯看可透光，若出现丝状沉淀或倾斜培养基对着灯看出现浑浊不透光且镜下细胞之外的部分有密密麻麻的小黑点，很可能是染菌，应弃掉。若镜检在细胞之外部分有一些浑浊，可能因为细胞代谢旺盛分泌物堆积，或者因为消化时间不够以至于过度强硬吹打细胞，造成细胞损伤产生大量细胞碎片，应换液。

新鲜培养基呈粉红色，代谢代谢旺盛的细胞的培养基会变黄，此时若细胞贴壁应换液，若此时细胞已长满，应传代。2>密度：

细胞密度过低，镜下观察稀稀疏疏，则生长缓慢，甚至死亡。较大的细胞密度可促进细胞之间相互作用，促进细胞增殖生长。密度过大，密密麻麻，部分细胞不能伸展成圆形，必须传代，此时不传代，一两天后细胞状态持续不好，开始死亡，镜检漂浮细胞增多。3>状态：

镜下观察细胞，当左右上下移动镜头时漂动的是未贴壁细胞或死细胞，固定不动的是贴壁细胞，贴壁细胞是活细胞。

状态良好的贴壁SY5Y细胞有圆形的胞体和细细分支的突触，突触分明。状态不好的SY5Y细胞，突触不明显，看不到什么细细的分支，甚至成圆形。

消化时快离壁的细胞呈亮亮的圆形。

5.动物细胞.教案doc 篇五

一、课型：新授课。

二、教学目标：

1、知识与技能目标（1）认识动物细胞的结构，并能说明动、植物细胞基本结构的异同；

（2）制作人的口腔上皮细胞临时装片，并使用显微镜观察；

2、过程与方法目标

通过探究法、讲授法、讨论交流法、演示法、多媒体辅助教学等多种方法相结合，以激发学生主动学习为主，提高学生学习的兴趣，引导学生发现问题、分析问题、解决问题。

3、情感态度与价值观目标

（1）体验科学探究的艰辛与喜悦，培养学生严谨认真、团结合作的精神。

三、教学重难点

1、教学重点：（1）动物细胞的基本结构。

（2）制作人的口腔上皮细胞临时装片，并使用显微镜观察

2、教学难点：（1）制作人的口腔上皮细胞临时装片

四、教具准备

1、PPT课件。

2、器材：消毒牙签、滤纸、0.9%的生理盐水、稀碘液、载玻片、盖玻片、滴管、纱布、镊子、显微镜。

五、课时安排：1课时

六、教学方法：

讲授法、探究法、讨论交流、练习法、问答法、演示法、多媒体辅助教学法等。

七、教学过程： 新课导入

【老师】同学们，上课了。首先，我们来回顾一下上节课所学的植物细胞的基本结构； 【师生互动】

【设问】我们已经知道了植物细胞的结构，那么动物细胞是什么样的呢？想看看自己身上的细胞吗？ 【学生】回答

【老师】今天我们就来通过观察自己的口腔上皮细胞，来认识动物细胞；

【板书】动物细胞 讲授新课

【板书】

一、制作人的口腔上皮细胞临时装片

【老师】首先，用洁净的纱布将载玻片擦拭干净。【演示】 【板书】擦

【老师】接着，在载玻片中央滴一滴生理盐水。【演示】

【板书】滴

【老师】接着漱口，因为口腔上皮脱落的细胞较少，而且有很多食物残渣，所以采前必须漱口。【演示】 【板书】漱

【老师】漱完口，我们用消毒的牙签在口腔内壁上轻轻刮几下，注意：不要用力太猛，以免刮伤自己哦。【板书】刮

【老师】把牙签附有碎屑的一端放在载玻片上的生理盐水中，轻轻涂几下。【演示】 【板书】涂

【老师】再用镊子夹起盖玻片，先让它的一端接触载玻片的水滴，再缓缓地放平。注意避免盖玻片下出现气泡。【演示】 【板书】盖

【老师】再在盖玻片的一侧滴加几滴稀碘液，用吸水纸在盖玻片的另一侧吸引，使碘液浸润标本的全部。【演示】 【板书】染——吸

【老师】装片做好后，我们就可以用显微镜观察了。【提问】显微镜的使用步骤是怎样的？ 【学生】回答

【讲解】取——取出显微镜，安——安装显微镜，对——对光，放——放置装片，调——调节焦距，最后观察。

【老师】下面大家就观察一下我们自己的口腔上皮细胞，并画出

生物简图。【学生】学生活动

【老师】你们观察到的细胞是不是和老师这张图片类似呢? 【学生】回答：是

【讲解】这就是人的口腔上皮细胞。

【老师】和我们之前所学的植物细胞的结构进行对比一下，你们觉得动物细胞都有哪些基本结构呢？ 【板书】

二、动物细胞 【学生】回答

【讲解】最外面的这一层叫——细胞膜，颜色最深的这块叫——细胞核，那细胞膜和细胞核之间的叫什么呀？ 【学生】回答：细胞质

【老师】对!人和动物细胞的结构就是这样的，有细胞膜、细胞核、细胞质，当然，还有线粒体。它们的功能和植物细胞中的都是差不多的。【板书】

1、基本结构

【提问】细胞膜有什么功能啊？ 【学生】保护细胞并控制物质进出 【提问】细胞核呢？

【学生】是储存遗传物质的主要场所 【提问】细胞质呢？

【学生】是细胞生命活动的主要场所 【提问】那线粒体呢？

【学生】为细胞的生活提供动力

【老师】看来大家对之前所学的掌握的不错，掌声鼓励下自己。【老师】动物细胞的形态也是多种多样的。看，这是我们的红细胞、肌肉细胞、骨细胞、神经细胞。【板书】

2、形态：多种多样 课堂小结

【老师】下面，我们一起来回顾一下本节课所学的内容。我们首先学习了口腔上皮细胞临时装片的制作，步骤是怎样的？ 【学生】擦、滴、漱、刮、涂、盖、染——吸

【老师】这里的滴，滴的是什么呀? 【学生】生理盐水

【老师】我们做植物细胞时，滴的是什么呀？ 【学生】清水

【提问】为什么我们在观察植物细胞和动物细胞时要分别滴上清水和生理盐水呢？我们把这儿的生理盐水换成清水行不行呢？为什么？

【学生】思考回答

【讲解】因为动物细胞没有细胞壁，使用清水会使细胞吸水而破裂，而生理盐水可以保持人体细胞的生活状态。所以，不能将生理盐水换成清水。

【老师】接着，我们通过观察，认识了动物细胞的基本结构，都有哪些呢？ 【学生】回答

课堂练习

【老师】下面我们就将植物细胞和动物细胞进行对比，来填一填这个表格

【师生互动】完成表格

【老师】下面就请同学们迅速的把课后第一题做一做。【老师】老师这里有两张细胞模式图，你们能区分出谁是植物细胞谁是动物细胞吗？ 【学生】 资料阅读

【老师】下面我们来阅读下书上49页，科学家的故事。【学生】活动

【老师】读完这个故事，你有什么启发呢？ 【学生】回答 课后作业

【老师】好，今天的课就上到这，下来请同学们根据动物细胞的结构，发挥自己的想象力，制作出动物细胞模型

八、板书设计

动物细胞

一、制作人口腔上皮细胞临时装片 步骤：擦、滴、漱、刮、涂、盖、染——吸

二、动物细胞

1、基本结构

6.2.1.3动物细胞教学设计 篇六

2.1.3动物细胞

教学目标

1、掌握人的口腔上皮细胞临时装片制作方法。

2、认识动物细胞的基本结构。

3、说明动物细胞与植物细胞的异同点。

4、认同细胞学说是19世纪自然科学三大发现之一。重点与难点

1.掌握人的口腔上皮细胞临时装片制作方法。2.动物细胞的基本结构。教学过程 【复习】

1.用显微镜观察物体时，被观察的材料的特点是什么？ 2.按制作方法分，玻片标本有哪三种？

3.怎样制作洋葱表皮细胞临时装片？请按步骤排序。4.植物细胞的结构识图。5.将细胞的结构与功能连线。【新课教学】

导入：（展示多种多样的细胞图片）你已经知道植物细胞的基本形态和结构了，那么动物细胞是什么样子的？人的细胞又和植物细胞有什么不同之处呢？（出示本节课学习目标。）

一、观察人的口腔上皮细胞

学生观看视频：《实验：观察人的口腔上皮细胞》

引导学生小结制作人的口腔上皮细胞临时装片的步骤：一檫二滴三刮四涂五盖六染七吸。讨论：

1.制作人的口腔上皮细胞临时装片，为什么要用生理盐水，用清水行不行？ 2.为什么要用稀碘液对人的口腔上皮细胞进行染色？ 3.人的口腔上皮细胞的基本结构是怎样的？

二、动物细胞的基本结构

展示显微镜下观察的人口腔上皮细胞、动物细胞模式图，要求学生识别动物细胞的基本结构。

三、动植物细胞结构比较

展示动物细胞、植物细胞图片要求学生识别其结构。列表比较植物细胞与动物细胞的相同点和不同点。

得到：动植物细胞所共有的结构有：细胞膜、细胞质、细胞核

植物细胞所特有的结构有：细胞壁、液泡、叶绿体

四、科学家的故事-----施莱登、施旺与细胞学说 教师讲述施莱登、施旺与细胞学说。总结（引导学生总结本节课的收获。）

7.动物细胞工程论文 篇七

《动物细胞培养技术》课程教学存在的问题

《动物细胞培养技术》是在学习了生物化学、微生物学、免疫学等课程的基础上, 研究如何使细胞在体外良好增殖的一门课程, 是生物技术及应用专业的一门重要的核心技能课。以往这门课程的实践教学体系存在着很多问题, 主要表现在以下方面。

实践教学目标定位存在偏差高职教育以职业应用能力为主线这一本质要求未落到实处。尽管制定教学培养计划时安排的实践教学课时不少, 但实践教学效果不佳, 教学过程形式化, 不能突出实践技能和综合素质的培养, 偏重理论考核, 轻视现场职业技能考核。教学内容没有将体现职业技术能力、贴近生产、贴近技术的实训项目纳入实践教学体系, 不能很好地适应人才培养目标的需求。

实践教学内容与生产实际联系不够紧密2006年, 我们对专业教学计划进行了重新修订, 加大了实践教学的比例, 但由于受各种条件的限制, 在实践教学内容的选取上综合性、设计性、应用性实验较少, 新技术、新工艺未能及时充实到实验教学中;顶岗实习中工学相脱离, 学生在顶岗过程中与企业员工同样仅仅从事单一项目机械单调的重复性工作, 没有明确的顶岗实习课程标准, 达不到顶岗实习的预期目标。

实践教学保障条件不足实训条件与学科专业建设、课程建设并不完全匹配, 校内实践教学设备、场所建设等投入不足, 缺乏现代化实际生产设备或模型, 与工厂生产一线缺乏联系。校外实训基地建设不足, 学生在实训过程中真正动手进行操作的机会很少, 影响了学生实践能力的提高。另外, 还缺乏优秀而富有实践经验的实践指导教师。

缺乏严格规范的实践教学管理体系对实践教学计划执行的监控不严, 未能真正实现全过程管理, 尤其是顶岗实习管理不能落实到位。顶岗实习时间较长, 学生分布地域广, 企业数量多, 教师指导不到位, 监控指标不具体、不科学, 管理机制不健全, 致使部分学生校外顶岗实习处于无人管理状态。

构建一个符合高职教育特点的实践教学体系是高职教学改革的必然要求。近年来, 我校的《动物细胞培养技术》课程组对课程的实践教学体系进行了研究和重新设计, 使实践学习过程能充分满足学生职业能力培养的需要, 有利于高职生物工程类人才的培养。

课程改革的内容

重视实践技能教学, 重构教学体系通过对生物技术及应用专业毕业生近三年就业岗位进行调查研究, 发现学生首次就业岗位主要是分离提取、疫苗生产和诊断试剂三类企业的营销和生产岗位。经过发展, 再次就业的岗位主要有产品检测岗位、产品营销岗位等。实践性教学环节是理论与实践相结合的纽带, 是实现学生与企业“无缝对接”的重要环节, 因此, 应根据企业需要重构实践课程, 重视学生校内学习技能与实际工作需要的一致性, 积极推行工学交替、任务驱动、项目导向、顶岗实习等有利于增强学生能力的教学模式。近年来, 我校课程组教师采用多层次复合化实践教学, 使实践教学时数占整个教学时数的60%左右, 并构建了由物品准备模块、技能操作模块、细胞检测模块及职业实训模块4个技术模块组成的教学体系, 并与固定企业建立了长期合作关系, 制定了企业接收学生实习的制度, 加强了学生的生产实习和社会实践, 保证学生至少有半年时间到企业顶岗实习。2009年, 全球出现了“甲流”肆虐, 我国的华兰生物工程股份有限公司承担了大规模生产疫苗的工作, 我校生物工程系从当年的5月~11月选派了137名生物技术及应用专业的学生充实到华兰公司生产第一线, 参与治疗“甲流”疫苗的全面生产。除此之外, 在2006~2009年间, 我校生物工程系生物技术及应用专业与华兰生物工程股份有限公司联合成立了订单培养班“华兰班”, 搭建了校企合作发展联盟;与普莱柯生物制品公司联合成立了订单培养班“普莱柯班”, 拓宽了学生的就业渠道;与三叶兽药公司联合成立了订单培养班“三叶班”, 扩展了校企合作的空间;与天宇兽药有限公司成立了“天宇班”, 进一步为学生就业搭建了平台。通过校企合作, 深化课程内容改革, 强化细胞培养的几项技能训练, 突出学生实践能力的培养, 实现了学生与企业之间的“无缝对接”, 同时也增强了学生的就业能力。

改革授课方式授课方式采取校内专业教师与企业兼职教师相结合的方式进行, 使得实践技术与理论有机结合, 将企业技能需求与职业标准融入课程体系, 将企业真实的工作任务作为载体进行项目训练, 加强学生职业能力的培养。实习周、专业实训项目在企业的真实环境中完成, 同时, 在疫苗生产旺季安排学生去企业顶岗实习, 巩固专业技能。

构建严格的实践教学管理体系, 强化实践教学的过程管理实践教学管理分为目标管理、过程管理、质量管理三个方面。针对每项实践教学环节, 应制定具体明确的质量标准, 并严格规范执行。各实践教学环节的质量标准包括实验大纲 (或指导书) 、实训大纲 (或项目单卡) 、顶岗实习大纲、学生实训手册、学生实训报告等。要求教师严格按照教学工作规范和质量标准执行, 加强学生顶岗实习期间的过程管理, 解决“放羊式”顶岗实习的弊病。

构建科学的考核模式课程考核采取理论笔试成绩+在企业的实践成绩+平时成绩的方式。理论部分采用笔试考核, 主要考核基本理论知识和实验技能原理, 即考查学生分析问题、解决问题的能力;平时成绩通过考勤、学习态度、课后作业情况等方面加以衡量。在企业的实践成绩通过顶岗实习后企业反馈的学生表现情况进行评定, 我们专门制定了学生定岗实习实践考核的量化标准, 并严格按照量化标准对学生进行实践考核。成绩的评定构成为:20%实践考核+70%理论考核+10%平时成绩。

加强课程组专兼结合的教学团队建设在教学过程中, 教师要根据知识体系及学生的认知发展水平, 在有秩序、有步骤的教学过程中使学生掌握细胞培养的基本知识与技能, 形成严谨周密、无菌操作的实验习惯。课题组还通过有计划地选派教师到企业进行一年以上的实践锻炼等措施优化师资队伍。此外, 还聘请企业骨干作为兼职教师来校讲学, 兼职教师的理念融入了企业生产中技术手段的前沿和方向, 并为课堂教学的改革不断注入新鲜的血液。

建立健全实践教学保障机制要通过多渠道筹措资金, 优化实践教学环境, 加强校内外实习实训基地建设。除了学校加大投入外, 要争取政府及高职院校行政主管部门的支持, 也可以面向社会和市场多渠道筹集资金, 积极争取社会的支持和企业的协助;要提高“双师型”教师的实践能力, 增加校外兼职教师授课的比重, 完善与现有校外专家指导队伍的关系和活动规则;还要加强实训教材建设。

从教学效果看, 通过将实践技术与理论知识有机结合, 将企业技能需求与职业标准融入课程体系, 将企业真实的工作任务作为载体进行项目训练, 学生对《动物细胞培养技术》课程从思想上更加重视, 学习的主动性较高, 参与意识较强, 影响面较大, 充分提高了学生自主学习的能力和解决问题的能力。通过对《动物细胞培养技术》课程的改革, 为企业获得相应的专业人才提供了保障, 为学生的实习就业打通了渠道, 为学校的人才培养明确了方向, 为校企合作、订单培养搭建了平台, 因此具有十分重要的意义。

摘要：高职高专院校应根据企业需要重构动物细胞培养技术课程体系, 保证学生校内学习实验技能与工作岗位所需技能的一致性, 同时应采取顶岗实习、订单培养、合作发展联盟等措施, 强化学生实践技能, 为学生就业拓宽渠道, 并通过选派专业课教师到企业实岗锻炼, 聘请企业技术人员担任兼职教师等方式, 实现学校与企业合作的“无缝对接”。

关键词：高职高专,动物细胞培养技术,课程,教学改革,创新

参考文献

[1]焦建国, 孙学岭.关于工学结合的实践与探索[J].教育与职业, 2008, (7) .

[2]陈玉华.工学结合教学模式的探讨与实践[J].中国大学生就业, 2008, (13) .

[3]姜大源.职业教育学研究新论[M].北京:教育科学出版社, 2007:230.

8.动物细胞工程论文 篇八

教师设问：展示番茄马铃薯植株，请问该植物体通过什么完成？

生：植物体细胞杂交。

师：回顾必修1：1970年，有两位科学家做了一个人—鼠细胞的融合实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。那么，如何实现人—鼠细胞的融合，以及动物细胞融合后还有什么用途呢？今天我们一起学习动物细胞融合和单克隆抗体。

探究一：动物细胞的融合

师：问题1：植物体细胞杂交的过程是怎样的？

问题2：动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？

生：先用酶去除两种植物细胞的细胞壁，使之成为原生质体，再用物理或化学的方法，诱导两种原生质体融合成杂种细胞，最后用植物组织培养的方法把其培育成新的植物体。

请阅读P52第二段找到动物细胞融合的概念。

师设问：动物细胞融合是怎么一回事？

生：动物细胞融合，也叫细胞杂交，指的是两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

师：动物细胞融合的基本原理与植物原生质体融合的基本原理是否相同？

生：应该相同。

师：对，动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，那么动物细胞融合的具体过程是否也和植物原生质体融合的过程一样呢？

生：应该基本一样吧？

师：植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？

生：物理法、化学法。

师：动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？

生：生物法：灭活的病毒。

师：灭活的含义？融合的原理？详读生物资料卡寻找答案。

生：因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。

师：思考1：不灭活的病毒能做诱导剂吗？

生：不能，因为不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合。

师：回答得非常好！从示意图中我们可以看出，把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞后，它们就先质融合，再核融合，进而形成杂交细胞，这个细胞有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞。刚才我们是用两个动物细胞，那在实际中我们用多少个动物细胞合适呢？

生：多个。

师：为什么用多个呢？如果有很多个杂交细胞，那么如何处理呢？这个问题大家下去后讨论一下。在弄清楚动物细胞融合的原理和过程后，还需说明的是任何一项技术的发现，都不是凭空产生的，必定有一个发展的过程，下面我们阅读课本P52中的小字，了解动物细胞融合技术的发展简史。

思考2：两两融合后可产生几种杂交细胞？

生：两种，自身融合，非自身融合。

师：意义：打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；广泛应用；制备单克隆抗体。

物种间由于存在生殖隔离使得有性杂交方法有局限性，而细胞融合技术能打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能。

正因为如此，细胞融合技术已广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学及生物新品种培育等领域，但此技术还有一个十分重要的用途，就是制备单克隆抗体。那么单克隆抗体是什么呢？与克隆、抗体有什么关系呢？下面我们就共同学习单克隆抗体。

探究二：单克隆抗体制备原理

师：在弄清什么是单克隆抗体之前，我们先回顾抗体的基础知识，思考1：传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？请同学们在阅读课本P52的最后一个自然段的基础上，讨论这个问题。

生：传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。

师：回答得很好！下面我们再来讨论第二个问题2：抗体是由上面细胞产生的？B淋巴细胞有什么特点？请同学们继续阅读课本P53第一自然段，讨论并回答这个问题。

生：B淋巴细胞能产生抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。

师：很好！根据B淋巴细胞的这个特点，若要想获得大量的单一抗体，则如何做呢？

生：克隆细胞群。

师：阅读教材P53，找出单克隆抗体的概念。

生：单个效应B淋巴细胞克隆：无性繁殖。

概念：单个效应B淋巴细胞克隆形成细胞群，细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。

师：一个B淋巴细胞不能无限增殖，科学家是如何解决这一问题的呢？阅读P53，两位科学家的设想是什么？

生：科学家的设计方案：

一种效应B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖

活动探究三：单克隆抗体的制备

师：设问1.注射特定抗原的目的是什么？

生：使小鼠脾脏细胞中产生特定抗体的效应B淋巴细胞。

师：设问2.从小鼠脾脏中分离效应B淋巴细胞是一种还是多种？

生：是一系列效应B淋巴细胞B1B2B3……

师：设问3.诱导细胞融合的手段有哪些？

生：离心、振荡、电刺激、PEG、特有的灭活的病毒。

师：设问4.若细胞两两融合后，有几种融合情况？处理后的细胞种类有几种？

生：三种：BB、B瘤、瘤瘤。

五种：BB、B瘤、瘤瘤、B、瘤。

师：设问5.第一次筛选的目的是什么？阅读P54第五行。

生：筛选出杂交瘤细胞（一系列的多种杂交瘤细胞）。

师：设问6.第二次筛选是为什么？具体如何实现克隆化培养和抗体检测？

生：第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

师：详细讲解抗体检测及克隆化培养（拓展）

通常用“有限稀释法”选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那么上清液可与特定X抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，可能既有能产生特定抗体的杂交瘤细胞，又有其他杂交瘤细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。

该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。

经过多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。

活动探究四、单克隆抗体的应用

师：1.单克隆抗体最主要的优点是什么？

生：特异性强、灵敏度高，可大量制备。

2.单克隆抗体的应用有哪些？

（1）诊断试剂——最广泛应用

在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等，与常规抗体相比，具有准确、高效、简易、快速的特点。

（2）治疗疾病和运载药物

主要用于治疗癌症，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。

“生物导弹”=单克隆抗体+药物

优点：疗效高、副作用小。

9.动物细胞工程论文 篇九

动物细胞培养和核移植技术是动物细胞工程的基本操作，通过分析本节教学内容相对简单但是新名词较多，比如原代培养、传代培养、细胞株、细胞系以及核移植、胚胎移植等，是本节课的重点也是难点问题，学生容易混淆出错。模型建构这种学习方法具有形象，系统，直观的特点，尤其是概念模型有助于将知识系统化，因此在本节的教学中运用概念模型建构的方法攻克难点，分析学生情况，经过三个学期的训练，学生已具备基本的生物学知识，大多数学生具有生物学思维方式，对概念模型的建构也有所了解，因此该教学方法可行。

教学实施情况：本节课通过问题情境导入，学生在利用经验解决问题的`过程中引发新的疑问，怎样获得大量的自体皮肤?引出动物细胞培养，学生讨论激烈，效果良好。第二阶段在先自学动物细胞培养的概念，分析得出原理，在得出原理时出现困难的学生较多，可见学生联系运用所学知识的能力不足;过程的学习通过讨论完成模型建构为主，学生讨论激烈，大部分小组能完成这一模型的建构，但仍有学生不会画概念图，最后的培养条件及应用集体学习，效果良好。第二阶段核移植技术的学习同样以模型建构的方式进行，通过前一阶段的训练，该过程完成较好，学生基本都能独立完成核移植技术的流程图。

10.基因工程和细胞工程 篇十

第一讲 基因工程和细胞工程

1.(2009·浙江卷，1)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（）A．都需要用CO2培养箱 B．都需要用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行 D．都可体现细胞的全能性

2．下列关于运用植物组织培养技术产生新个体的叙述，错误的是

A．属于无性生殖

B．主要理论依据是植物细胞具有全能性

C．培养过程中由于人工培养基含大量营养，不需光照就能发育成完整植株

D．人工培养基中含植物生长发育所需的全部营养物质，包括矿质元素、糖、维生素等 3．(2009·安徽卷，4)2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是

（）A．追踪目的基因在细胞内的复制过程 B．追踪目的基因插入到染色体上的位置 C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构

4．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点：

()

切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是

A．BamHⅠ和EcoRⅠ B．BamHⅠ和HindⅢ C．BamHⅠ和BglⅡ D．EcoRⅠ和HindⅢ

5．对于不同的生物，将重组基因导入受体细胞的方法有差异，下列方法不合适的是

（）A．以质粒为运载体，利用大肠杆菌生产人的胰岛素时，可用氯化钙处理大肠杆菌 B．以噬菌体为运载体，利用大肠杆菌生产人的凝血因子时，可使其直接侵染大肠杆菌 C．以质粒为运载体，利用转基因羊生产人的乳铁蛋白时，可用显微注射技术将重组基 因导入受精卵

（）D．以质粒为运载体，培育转基因植物时，可借鉴质粒侵染细胞的途径，用重组质粒侵染植物细胞

6．蛋白质工程与基因工程相比，其突出特点是（）A．基因工程原则上能生产任何蛋白质

B．蛋白质工程能对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质

C．蛋白质工程可以不通过转录和翻译来实现

D．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 7．如图所示为农作物新品种的育种方式，相关叙述错误的是()

A．②③过程分别称为脱分化和再分化 B．①过程代表植物体细胞杂交 C．⑤过程中常用的基因表达载体是质粒

D．图中育种方式突出优点是克服了远缘杂交不亲和的障碍 8．下列关于原代培养、传代培养的叙述，错误的是（）A．都属于动物细胞体外培养，需要一定的培养条件

B．第一次分瓶之前的培养属于原代培养，以后的培养均属于传代培养 C．50代以后的培养，少部分细胞会获得不死性 D．培养至50代以后的细胞称为细胞株

9．(2010·江苏卷，18)下列关于转基因植物的叙述，正确的是（）A．转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中 B．转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 C．动物的生长激素基因转入植物后不能表达

D．如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题

10．番木瓜，俗称木瓜，有“百果之王”的美称，在人们所食的38种常见水果中，营养价值居首位，从种植到结果只要9～15个月，所以人们一直希望找到与番木瓜果实质量、产量、抗病性、环境适应性等有关的基因，更难得的是它是第一种进行转基因实验的水果。2004年12月，我国南开大学与美国夏威夷大学共同主持番木瓜的基因组测序工作，30余家单位参与该工作，并于2008年4月在《自然》杂志上以封面文章的形式发表了《转基因热带水果植物——木瓜的基因组草图》的成果论文。请回答下列有关问题：

(1)研究组首先从番木瓜细胞中提取出DNA，使用“鸟枪法”将其打成碎片，需要用的工具酶是______________。经过定位和测序后，再重新连接成整体，用到的工具酶是__________________________。

(2)“抗环斑病毒的番木瓜”细胞中的抗病毒基因的表达过程(图解表示)是： ______________________________________________________。

(3)将已导入抗病毒基因的木瓜细胞培养成植株，需要通过下列过程①――→②――→③―→④，①能被培养成为④的根本原因是________________。这个过程中需要用到

脱分化

再分化____________________(激素)；②表示__________，它的特点是______________________。

11．(2011·海南卷，31)回答有关基因工程的问题：

(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。

(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是________________________________________________________。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为________________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成________，常用抗原—抗体杂交技术。

(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________上。

12．下图是单克隆抗体制备流程示意图。

(1)______________技术是单克隆抗体技术的基础。

(2)根据培养基的用途分类，图中培养基属于________培养基。

(3)单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是__________________。(4)动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用诱导剂外，还可以采用____________。

(5)选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞______________________的特点，又具备浆细胞的________________________的特点。

(6)淋巴细胞是由动物体________中的________细胞分化、发育而来的。(7)杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是__________。答案

1．C 2．C 3．C 4．C 5．D 6．B 7．B 8．D 9．A

10．(1)限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶(2)

(3)细胞具有全能性 生长素和细胞分裂素(缺一不可)愈伤组织 细胞排列疏松而无规则，高度液泡化，呈无定形状态的薄壁细胞

11．(1)平相同(2)提供RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录 Ca2 DNA

＋－RNA分子杂交 胰岛素原(蛋白质)(3)T-DNA 染色体

12．(1)动物细胞培养(2)选择(3)特异性强，灵敏度高

11.动物细胞工程论文 篇十一

一、基因工程中的筛选

1.利用DNA探针从基因文库中筛选目的基因

例1为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种.图1是获取植酸酶基因的流程.据图回答：

图1（1）图中基因组文库（小于/等于/大于）cDNA文库.（2）B过程需要的酶是；A、C过程中（可以/不可以）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株.（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中和为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是.

解析基因组文库是从酵母菌体内直接提取DNA构建的，cDNA文库是由酵母菌细胞中提取的mRNA经过逆转录而来的，由于酵母菌细胞内可能只有部分基因表达产生mRNA，因此基因组文库大于cDNA文库.B过程需要的酶是逆转录酶；因为A、C过程都能获得含目的基因的菌株，所以可以使用同一种探针进行筛选.目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用的酶是耐高温的RNA聚合酶.

答案：（1）大于（2）逆转录酶可以

（3）DNAcDNA耐高温

知识链接基因文库包括基因组文库和cDNA文库.基因文库是一套包含特定生物体所有基因的DNA序列.其中，不同的DNA序列片段分别被克隆在适当的载体上.例如，人类基因文库是一群带有人类基因克隆的大肠杆菌细胞.那么我们如何从这个文库中筛选出所需要的目的基因呢？目前，有很多

图4（1）该放射性物质中被标记的元素是 .光合作用过程中，含标记元素的化合物被光反应提供的 还原成糖类.在适宜温度下测得叶片光饱和点，若其他条件不变，进一步提高温度，则该叶片光饱和点的变化是 .（2）由实验结果推断，幼铃脱落显著减少的是 组.B组幼铃放射性强度百分比最低，说明B组叶片的光合产物 .为优化实验设计，增设了D组（激素处理叶片），各组幼铃的放射性强度百分比由高到低排序是 .由此可知，正确使用该激素可改善光合产物调配，减少棉铃脱落.（3）若该激素不能促进插条生根，却可促进种子萌发和植株增高，其最可能是 .

答案：（1）碳；NADPH（[H]）；降低 （2）C；输出减少；C>A>B>D （3）赤霉素

创新之处考查了外源激素对植物光合产物调配的影响.

解析（1）光合产物用碳元素标记.光反应提供的[H]还原C3为糖类和C5.适宜温度下若提高温度，酶活性降低，光饱和点降低.（2）幼铃脱落是光合产物不足导致，C组幼铃中有机物占比最高，因而幼铃脱落显著减少.B组中叶片的放射性强度的百分比较高，说明有机物占比较多，输出较少.由题中数据可知，激素可抑制叶片有机物的输出，有利于幼铃有机物的输入，D组导致叶片有机物输出明显较少，且小于B组，因而幼铃的放射性强度百分比由高到低依次为C>A>B>D.（3）促进种子萌发和植株增高，但不能促进扦插枝条生根的激素，最可能是赤霉素.（收稿日期：2014-09-20）方法能够帮助我们从基因文库的众多克隆中筛选和鉴定带有特定基因的克隆，这些方法大多是以杂交探测技术为基础的.杂交探测是一种利用能和目的基因序列互补的DNA片段为探针，通过分子杂交的手段找出带有目的基因的DNA片段的实验方法.DNA探针是根据已知的有关目的基因的某些信息（部分DNA序列或蛋白质产物等）通过化学方法合成的核苷酸单链，制作DNA探针时，可利用目的基因的部分核苷酸序列，而无需使用全部的核苷酸序列， 因此虽然mRNA形成过程中存在加工过程，导致逆转录后获得的DNA可能和原DNA不完全相同，但仍可用同一种探针进行检测.探针要利用放射性元素或荧光色素进行标记以利于检测.

2.利用标记基因筛选重组细胞

例2目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图2-a所示.

图2（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于.（2）现将pBR322质粒和目的基因经BamHⅠ处理后构建的重组质粒导入大肠杆菌细胞，为检测重组质粒是否导入原本无ampr和tetr的大肠杆菌体内，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图2-b的菌落.再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图2-c的结果（空圈表示与图2-b对照无菌落的位置）.与图2-c空圈相对应的图2-b中的菌落表现型是，图2-c的结果显示，多数大肠杆菌导入的是.

解析（1）构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，以便于筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）.（2）在含氨苄青霉素的培养基上培养，能够生长的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性基因，这些大肠杆菌中导入了pBR322质粒或重组pBR322质粒.经BamHⅠ处理后，pBR322质粒中的四环素抗性基因被破坏.因此在含四环素的培养基上培养，能够生长的大肠杆菌具有四环素抗性基因，这些大肠杆菌中导入了pBR322质粒而没有导入重组pBR322质粒.能在含氨苄青霉素的培养基上生长而不能在含四环素的培养基上生长的是导入了重组pBR322质粒的大肠杆菌，而既能在含氨苄青霉素的培养基上生长又能在含四环素的培养基上生长的只能是导入了pBR322质粒的大肠杆菌.综上分析可知，与图2-c空圈相对应的图2-b中的菌落是只能在含氨苄青霉素的培养基上生长而不能在含四环素的培养基上生长的大肠杆菌，表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素.图2-c的结果显示，多数大肠杆菌既能在含氨苄青霉素的培养基上生长，又能在含四环素的培养基上生长，导入的是pBR322质粒.

nlc202309040825

答案：（1）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞） （2）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒

知识链接用同种限制性核酸内切酶处理的目的基因和运载体具有相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，如果只考虑两个DNA片段两两结合，混合物中至少有3种环状DNA：质粒自连的环状DNA（普通质粒）、目的基因自连的环状DNA、质粒与目的基因相连的环状DNA（重组质粒）.由此可见，经DNA连接酶处理后，并不能保证每一个质粒都能与目的基因实现重组，因此导入受体细胞的不一定是基因工程所需要的重组质粒，也可能是普通质粒，这就需要对受体细胞进行筛选.

通常在构建基因表达载体时就要考虑到筛选的需要，质粒上需要具有特定的标记基因以利于筛选.例2中的pBR322质粒含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因（图2-a），因此含有普通pBR322质粒的细胞具有对四环素和氨苄青霉素的双重抗性.如果目的基因插入到四环素抗性基因中，四环素抗性基因就会被破图3坏，对四环素的抗性就会丧失，所以带有重组质粒的受体细胞仅对氨苄青霉素具有抗性，对四环素没有抗性.根据这个特点可筛选出导入重组质粒的受体细胞.筛选时首先要用一小块灭菌的绒布固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，制作一个“印章”（即接种工具，如图3），然后采用例2第（2）小题所述的方法进行，最后从图2-c空圈相对应的图2-b中的菌落处分离得到所需的含有重组质粒的细胞.

二、细胞工程中的筛选

1.植物体细胞杂交技术中筛选杂种细胞

例3现有甲、乙两个烟草品种（2N=48），其基因型 分别为rrHH和RRhh，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因（rr或hh）作用的结果.取两品种的花药离体培养成植株，然后将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合（只考虑2个原生质体的相互融合），诱导产生细胞团.（1）实验开始时必须用 除去不利于原生质体融合的物质.（2）实验中除获得杂种细胞外，还有基因型为 的融合细胞.（3）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，方法： .在此条件下，有种细胞团不能分化；能分化的细胞团是由的原生质体融合来的.由该细胞团分化发育成的植株，其染色体数是，基因型是.

解析制备原生质体利用酶解法，即用果胶酶和纤维素酶水解细胞壁；花药离体培养形成单倍体植株，利用其叶肉细胞制成的原生质体基因型分别是rH和Rh，如果只考虑两两融合的情况，除获得杂种细胞外，还有原生质体自身融合而成的，基因型分别是rrHH、RRhh；由于隐性纯合基因rr或hh的作用，在光照强度大于800勒克斯时不能生长，因此可将融合后的细胞置于大于800勒克斯光照下培养，自身融合的rrHH、RRhh不能生长，只有基因型为RrHh的杂种细胞能够生长.

答案：（1）纤维素酶和果胶酶 （2）rrHH、RRhh （3）置于大于800勒克斯光照下培养，收集能生长的细胞团 2 甲乙两品种 48 RrHh

知识链接杂种细胞的筛选没有通用的方法，一般根据需要筛选的细胞特点进行.筛选可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学的方法.

2.单克隆抗体制备过程中的筛选

例4已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断.人淋巴细胞中虽有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖.鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞：

（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞（只考虑两个细胞的融合）.

（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说明原理.

方法： .原理： .

（3）欲制备治疗H7N9禽流感的单克隆抗体，已知人B淋巴细胞（染色体组成为2N=46），鼠骨髓瘤细胞（染色体组成为2N=40）.那么B淋巴细胞应取自于 （正常个体、患者），杂交瘤细胞中共有 个染色体组.

解析（1）将人的淋巴细胞和鼠的骨髓瘤细胞混合后加入聚乙二醇促融，如果只考虑两个细胞的融合，则试管中除杂种细胞外，还有2种自身融合细胞；（2）由题意可知，D途径可被氨基蝶呤阻断，故在培养基中加入氨基蝶呤后，只有D途径的骨髓瘤细胞不能进行DNA复制而不能分裂增殖，B淋巴细胞虽然有S途径，但是B细胞一般不分裂增殖，只有杂交瘤细胞中可利用B细胞的S途径进行DNA合成而不断增殖.（3）患者体内可分化出能够分泌抗H7N9禽流感病毒抗体的浆细胞，故所需B淋巴细胞应取自患者，人和鼠都是二倍体，因此杂交瘤细胞中含有4个染色体组.

答案：（1）2 （2）培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖的细胞；加入氨基蝶呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖.（3）患者 4（4）液体 动物血清

知识链接在单克隆抗体的制备中，首先把从脾脏中分离出的B细胞（浆细胞）和骨髓瘤细胞进行融合以获得杂交瘤细胞.

通常采用两步操作进行：第一步采用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞.HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、 氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成的，已知细胞中DNA的合成存在D和S两条途径，其中氨基蝶呤可阻断D途径，骨髓瘤细胞仅有D合成途径，B淋巴细胞虽然含有D、S两条途径，但是一般不增殖，这就决定了在HAT培养基中只有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞可以利用B淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖，其他细胞不能增殖.由此筛选出的杂交瘤细胞可能是多种B细胞和骨髓瘤细胞融合而成的，因此需要进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞.二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后利用特定抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），如果上清液可与特定抗原发生特异性反应（阳性反应），说明这个培养孔中的细胞就有我们需要的杂交瘤细胞.对培养孔中的细胞继续进行有限稀释，一般重复3～4次，保证每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞，由此获得 “单克隆抗体”——由一个细胞克隆而来的细胞群分泌的抗体.第二次筛选同时也是鉴定的过程.

（收稿日期：2014-02-03）